一種鵝血紅素提取方法
2023-05-02 01:43:11
專利名稱：一種鵝血紅素提取方法
技術領域：
本發明屬於血紅素製備技術領域，具體涉及一種鵝血紅素的提取方法。
背景技術：
血紅素(分子式=C34H32N4FeO4)是血紅蛋白、肌紅蛋白、紅細胞的輔基，是重要的天然卟啉鐵化合物。動物機體中的鐵大約70%以血紅素的形式存在，其功能是血液輸送氧氣和二氧化碳的物質，它和蛋白質結合成血紅蛋白，是一種生物鐵，是人體缺鐵性貧血的天然補血鐵劑，很容易被吸收，對缺鐵人群具有重要的保健功能。在畜禽肉類加工過程中會有大量血液產生，這些血液作為副產品目前多數被用作飼料、食用或被廢棄，造成大量優質資源浪費甚至間接環境的汙染。有資料報導，鵝血富含蛋白質、礦物質及抗癌因子等。然而，目 前國內外對鵝血有效活性物質和功能缺乏深入研究，從鵝血中直接提取血紅素技術還處於空白，市場上也沒有鵝血紅素產品，為此，對該產品的開發利用具有重要意義和市場發展前
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發明內容
本發明的目的是提供一種鵝血紅素的提取方法，即採用酶解法製備鵝血紅素，以填補目前該方面的空白。申請人:通過長時間的研究，經過各種因素的篩選，確定出酶解法製備鵝血紅素的最佳工藝條件。本發明的鵝血紅素製備方法，包括血球粉的製備和酶解處理步驟I)血球粉的製備首先收集鵝血中的紅細胞，再用NaCl溶液洗滌紅細胞，然後將紅細胞真空冷凍乾燥完成血球粉的製備；2)酶解處理將製備的血球粉用水溶解後製成血球粉溶液，加入鹼性蛋白酶和風味蛋白酶進行酶解，酶解液即為鵝血紅素溶液。上述步驟I)中NaCl溶液的質量體積百分比濃度為O. 9% ;真空冷凍乾燥的條件為-2(TC -45°C、20Pa lOOPa。上述步驟2)中鹼性蛋白酶和風味蛋白酶的質量比為1:1 3。上述步驟2)中鹼性蛋白酶和風味蛋白酶在酶解液中的加入量為3°/Γ4%。上述步驟2)中酶解溫度為45°C 55°C，酶解時間為3. 5h 4. 5h血球粉的濃度為O. Γ0. 2g/mL。上述步驟2)所得酶解液用截留分子量為lkDa 14kDa孔徑的透析袋進行低溫下透析即可得到鵝血紅素含量更高的產品。本發明採用了真空冷凍乾燥法，避免了血球粉製備過程中與氧的接觸，有效防止了在製備過程中血紅素的損耗，避免了現有方法溫度過高的缺點。離心後鵝血球製成血球粉後，克服血液本身易氧化變質的缺陷，有效防止了加工過程中血紅素的損耗，其穩定性及方便性均得到一定提高，大大延長了產品的貨架期，有利於保持血紅素的活性。而採用酶解法提取血紅素避免了傳統有機溶劑法帶來的化學汙染，有利於鵝血紅素在食品方面的進一步加工，填補了鵝血紅素提取技術方面的空白，為鵝血紅素生產工藝提供科學的參考。
圖I :本發明中單酶酶解溫度與酶解時間交互作用響應面圖；圖2 :本發明中雙酶酶解時間與酶用量交互作用響應面圖。
具體實施例方式本發明採用酶解的方法製備鵝血紅素微膠囊，分別以不同比例的鹼性蛋白酶和風味蛋白酶為肽鏈內切酶和肽鏈外切酶。以酶解液中血紅素含量為響應值，酶解時間、酶用量和酶總量比為響應因子，設計響應面試驗，得到製備鵝血紅素的最佳工藝條件。 本發明的製備方法，包括如下的步驟I)血球粉的製備首先收集鵝血中的紅細胞，再用NaCl溶液洗滌紅細胞，離心後將紅細胞真空冷凍乾燥完成血球粉的製備；真空冷凍乾燥處理中，樣品於-40°C預冷，這是因為根據熱力學中的相平衡理論，水的三相點(汽、液、固三相共存)溫度為O. 0098°C，三相點壓力為609. 3pa(4. 57mmHg)在水的相變過程中，當壓力低於三相點壓力時，固態冰可以直接轉化為氣態的水蒸氣即冰晶升華。真空冷凍乾燥即是把含有大量水的物質預先冷凍，使物質中的游離水結晶，凍結成固體，然後在高真空條件下使物質中的冰晶升華，待冰晶升華後再除去物質中部分吸附水，最終得到殘餘水量為1°/Γ4%左右的幹製品。在冷凍乾燥前必須將物料進行徹底冷凍才能實現，如物料冷凍不完全，乾燥處理中會出現大量泡沫，這會嚴重阻礙水分的升華。2)酶解法提取鵝血紅素將製備的血球粉用水溶解後製成血球粉溶液，加入蛋白酶進行酶解，酶解液即為鵝血紅素溶液；經過單酶的篩選，雙酶酶解的篩選，最終通過單酶和雙酶酶解效果之間的比較，最終選取最佳酶解方法。鹼性蛋白酶與風味蛋白酶分別作為肽鏈內切酶和肽鏈外切酶逐步發生酶解反應，水解程度將得到提高，經外肽酶催化的血紅蛋白水解形成低分子量多肽和胺基酸，這種小分子物質可以不管疏水相互作用而通過透析膜。因此，所得酶解液可再用截留分子量為lkDa 14kDa孔徑大小的透析袋，低溫下透析即可得到鵝血紅素含量更高的產品。下面結合實施案例對本發明的方法進行詳細描述。實施例I :單酶最佳工藝的篩選I)鵝血球粉的製備收集檢疫合格的16周齡肝用型青農灰鵝的新鮮鵝血50ml於離心管，在3000r/min條件下離心15min，收集紅細胞。將收集的紅細胞用O. 9%的NaCl溶液洗滌紅細胞，同條件離心，重複2次；最後將血球在_30°C -45°C、20Pa IOOPa條件下冷凍乾燥得血球粉20g ；可以將血球粉密封包裝於乾燥器內備用。2)標準曲線的繪製血紅素標準溶液鵝血紅素標準品16. 0±0. Img,置於IOOmL容量瓶中，加O. Imol/L NaOH溶液適量使完全溶解後，再用O. lmol/L NaOH溶液稀釋至刻度，搖勻得標準液。取10支具塞試管，分別加入血紅素標準溶液，精密量取血紅素標準液0、0. 1,0. 2、O. 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9、I. OmL,用 O. lmol/L 的 NaOH 溶液定容於 IOOmL 容量瓶，搖勻，以O. lmol/L的NaOH溶液為空白，在383nm波長處測定其吸光值，通過OriginPro 8. 5. I軟體擬合標準曲線。3)單酶單因素酶解試驗取一定量血粉，放入錐形瓶中，加入一定量蒸餾水搖勻，超聲波溶血，再加入一定量的蛋白酶(鹼性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶)，在恆溫水浴中酶解一定時間，383nm波長處測定其吸光值，根據所得指標高低，選取最佳酶。①酶解溫度對鵝血紅素提取的影響試驗結果表明，溫度對提取鵝血紅素的影響比較顯著。隨著溫度的升高，吸光值呈上升趨勢，其中鹼性蛋白酶與木瓜蛋白酶的酶解效果佔優。當溫度分別超過各自最適溫度之後，因為酶失活導致酶解效果的下降，吸光值開始降低，並且當溫度超過60°C時，血紅蛋 白明顯變性，呈果凍狀，不利於酶解的進行。②酶解時間對鵝血紅素提取的影響試驗結果表明，每一種酶在開始階段，吸光值升高趨勢明顯，當時間延長至最佳酶解時間後，吸光值不再上升，相反還有一定下降趨勢，說明酶解達到平衡。根據吸光值的高低，可以看出鹼性蛋白酶與木瓜蛋白酶的酶解效果要優於其餘三種酶。③酶用量對鵝血紅素提取的影響試驗結果表明，鹼性蛋白酶與木瓜蛋白酶的酶解效果優於其它。隨著酶用量的增力口，吸光值有所升高，但是酶用量對酶解效果的影響作用不大，而且當酶用量超過一定量時，還會對酶解起到反作用。④底物濃度對鵝血紅素提取的影響試驗結果表明，底物濃度的增加有助於反應的進行，對提取血紅素的影響比較顯著，但底物濃度過大，也會因液相黏度過大而阻礙反應的進行。同時也可以清晰的發現，鹼性蛋白酶的酶解效果最佳。⑤pH對鵝血紅素提取的影響試驗結果表明,pH對鵝血紅素提取的有影響,但在最適pH範圍內，影響效果不大。同時，根據數據發現，鹼性蛋白酶是單酶酶解的最佳選擇。4)單酶酶解響應面試驗以酶解溫度、酶解時間和底物濃度為自變量，血紅素含量為響應值，進行Box-Behnken設計,利用Design Expert 8. 06軟體進行響應面分析,建立回歸模型。在單因素試驗的基礎上，確定最佳工藝。響應面試驗方案及結果如下表I響應面優化設計試驗數據
權利要求
1.一種鵝血紅素提取方法，其特徵在於，包括血球粉製備和酶解處理步驟 1)血球粉製備首先收集鵝血中的紅細胞，再用NaCl溶液洗滌紅細胞，然後將紅細胞真空冷凍乾燥完成血球粉的製備； 2)酶解處理將製備的血球粉用水溶解後製成血球粉溶液，加入鹼性蛋白酶和風味蛋白酶進行酶解，酶解液即為鵝血紅素溶液。
2.如權利要求I所述的提取方法，其特徵在於所述步驟I)中NaCl溶液的濃度為O.9%。
3.如權利要求I所述的提取方法，其特徵在於所述步驟I)中真空冷凍乾燥的條件為-2(TC -45°C、20Pa lOOPa。
4.如權利要求I所述的提取方法，其特徵在於所述步驟2)中鹼性蛋白酶和風味蛋白酶的質量比為I: I 3。
5.如權利要求I所述的提取方法，其特徵在於所述步驟2)中鹼性蛋白酶和風味蛋白酶在酶解液中的加入量為3°/Γ4%。
6.如權利要求I所述的提取方法，其特徵在於所述步驟2)中酶解溫度為45°C 55°C，酶解時間為3. 5h 4. 5h。
7.如權利要求I所述的提取方法，其特徵在於所述步驟2)中血球粉的濃度為O.1^0. 2g/mL。
8.如權利要求I所述的提取方法，其特徵在於所述步驟2)中製備的酶解液用截留分子量為lkDa 14kDa孔徑的透析袋進行低溫下透析。
全文摘要
本發明涉及一種鵝血紅素的提取方法，包括血球粉的製備和酶解處理步驟，其中酶解處理是用鹼性蛋白酶和風味蛋白酶進行酶解。本發明採用了真空冷凍乾燥法，避免了血球粉製備過程中與氧的接觸，有效防止了在製備過程中血紅素的損耗，避免了現有方法溫度過高的缺點。離心後鵝血球製成血球粉後，克服血液本身易氧化變質的缺陷，有效防止了加工過程中血紅素的損耗，其穩定性及方便性均得到一定提高，大大延長了產品的貨架期，有利於保持血紅素的活性。而採用酶解法提取血紅素避免了傳統有機溶劑法帶來的化學汙染，有利於鵝血紅素在食品方面的進一步加工，填補了鵝血紅素提取技術方面的空白，為鵝血紅素生產工藝提供科學的參考。
文檔編號C12P17/18GK102876747SQ20121039598
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月17日 優先權日2012年10月17日
發明者王寶維, 高順, 葛文華, 張名愛, 嶽斌 申請人:青島農業大學