一種酶蛋白環化方法

2023-05-01 21:15:46 1

專利名稱：一種酶蛋白環化方法
技術領域：
本發明涉及一種新的酶蛋白環化方法，以提高蛋白酶的性能，特別涉及雙內含肽介導的酶蛋白環化方法。本發明還涉及一種增強熱穩定性的環化木聚糖酶。
背景技術：
許多天然的酶在應用中存在著許多性能上的不足，如熱穩定性低。釀造、飼料工業中的高溫制粒的過程需要75V -90°C溫度，並持續數分鐘，在此過程中會大幅的喪失酶的活性，限制了天然酶在工業生產中的應用。因此提高酶的熱穩定性成為急需解決的問題。體外蛋白環化是一種新技術，環化後可增加蛋白的熱穩定性，減少蛋白對水解酶剪切的抗性，同時也可增強蛋白的化學抗性。2000年Thomas C. Evans和Ming-Qun Xu利用^p DnaE內含肽，在體內環化了有395個胺基酸的麥芽糖結合蛋白，此種內含肽環化方法的缺點是不利於進行體外環化，因此實現體外蛋白的環化是需要解決的問題。

發明內容
本發明的目的是開發一種新的體外酶蛋白環化技術，提供具有熱穩定性的環化酶。技術解決方案本發明提供了一種環化的酶，其特徵在於，其酶蛋白的N、C兩端相連結。本發明提供了一種環化酶蛋白的方法，包括整套表達載體的構建、重組子的篩選及環化分子的鑑定方法，其特徵在於通過兩種內含肽介導環化酶蛋白質，用天然的肽鍵將酶蛋白的N、C兩端連結起來。所述二種內含肽是集胞藍細菌(Synechocystis sp. ) Ssp DnaB內含肽(GenBank 為 DQ371396.1)和蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)Mxe GyrA 內含肽(GenBank 為 U67876.1)。用發明的方法可以對多種天然酶蛋白進行體外環化，其限制條件是酶蛋白的多肽序列的第一個胺基酸是半胱氨酸，且酶蛋白的三維晶體結構已知，同時酶蛋白的N、C兩端應位於蛋白結構的同側。在本發明的一個實例中，所述酶蛋白是木聚糖酶蛋白，經實驗證實，環化後的木聚糖酶的熱穩定性有所提高。本發明對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的木聚糖酶基因xylB進行環化，環化方法是將核苷酸序列(GenBank為DQ100307. 1)的基因在大腸桿菌中環化表達，通過兩種內含肽介導木聚糖酶環化。用本發明的方法改良的木聚糖酶具有更好的熱穩定性。1.基因克隆從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的基因組中PCR得到一個中性木聚糖酶基因xylB。2.環化載體的構建從質粒pTWim (ENB公司)上PCR擴增出集胞藍細菌kp DnaB 內含肽的序列和蟾分枝桿菌Mxe GyrA內含肽的序列。將DnaB片段、xylB基因和Mxe GyrA 序列順序連接形成融合基因，插入到經酶切消化後的PTWim載體上，形成表達載體pTX。轉化到大腸桿菌，獲得重組子。3.蛋白的表達和純化加入IPTG誘導表達木聚糖酶前體，通過幾丁質親和柱得到體外的木聚糖酶融合前體。之後通過溫度誘導和MESNA誘導蛋白環化的發生。驗證蛋白的環化情況。4.木聚糖酶性質的測定使用DNS法測定木聚糖酶的酶活。


圖1為大腸桿菌重組載體pTX的物理圖譜；圖2表示60 90°C下，環化木聚糖酶和野生木聚糖酶在各溫度保溫30分鐘後，剩餘酶活的百分比；圖3為SDS-PAGE電泳鑑定蛋白環化情況。圖中1為蛋白酶切割後的線性蛋白，2 為環化木聚糖酶。
具體實施例方式下面具體實施例中，用木聚糖酶的環化過程進一步闡述本發明的環化方法。應理解，該實施例僅用於舉例說明本發明的方法，而不限制所用酶蛋白的範圍。實驗條件菌株與載體大腸桿菌菌株E. coli BL21 (DE3)購自Novagen公司，pTWINl質粒購自ENB公司。酶與試劑盒限制性內切酶，連接酶，Taq酶，Factor )(a為NEB公司產品。基因組提取試劑盒為天根生化公司產品。生化試劑DNA合成試劑為Millipore公司產品。引物合成為ABI公司Cyclone DNA 合成儀。IPTG、X-Gal、SDS、木聚糖及MESNA為Sigma公司產品。TEMED、過硫酸銨、丙烯醯胺及甲叉雙丙烯醯胺為!Iomega公司產品。木糖、磷酸二氫鈉和檸檬酸為國產分析純。幾丁質樹脂和lector Xa為NEB公司產品。乙酸-乙酸鈉緩衝溶液(pH 5. 5)稱取三水乙酸鈉23. 14g，加入冰乙酸1. 70ml，再加水溶解，定容至2000ml。1. 0%木糖溶液(w/v)稱取無水木糖1. 000g，加緩衝液(3. 4)溶解，定容至100ml。1. 0%木聚糖溶液(w/v)稱取木聚糖(Sigma X0672) 1. 00g，加入氫氧化鈉0. 34g， 再加入60ml水，攪拌至木聚糖完全溶解。再加入冰乙酸0. 5ml，再用乙酸溶液調節pH值至 5.5。繼續攪拌30min，用乙酸-乙酸鈉緩衝溶液定容至100ml。木聚糖溶液能立即使用，使用前適當搖勻。4°C避光保存，有效期為7天。DNS試劑稱取3，5- 二硝基水楊酸3. 15g(化學純)，加水500ml，攪拌5s，水浴至45°C.然後逐步加入100ml 200g/L氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明 (注意在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48°C .).再逐步加入四水酒石酸鉀鈉 91. 0g，苯酚2. 50g和無水亞硫酸鈉2. 50g。繼續45°C水浴加熱，同時補加水300ml，不斷攪拌，直到加入的物質完全溶解.停止加熱，冷卻至室溫後，用水定容至1000ml。用燒結玻璃過濾器過濾.取濾液，儲存在棕色瓶中，避光保存.室溫下存放7天後可以使用。培養基大腸桿菌培養基為LB(1%蛋白腖、0. 5%酵母提取物、NaCl, pH7. 0)。
實施例中其它未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法進行，如Sambrook等人的方法，分子克隆按(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)實驗室手冊中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。儀器與設備超聲波破碎儀，分析天平，PH計，離心機，恆溫水浴，紫外分光光度計及4度冰箱，蛋白電泳儀。實施例1木聚糖酶基因的克隆及環化載體的構建首先提取質粒pTWINl(ENB公司)，以所提取質粒為模板，PCR擴增集胞藍細菌 Ssp DnaB內含肽的序列。所使用的引物根據DnaB基因的5』和3』端序列合成，2個引物序列分別為5，ATACATATGA AAATCGAAGA AGGTAAAC 3，禾口 5，GAATTCGTTG TGTACAATGA TGTCATTC 3，，擴增後進行凝膠電泳，回收大小680bp的片段。之後經過Nde I和EcoR I 雙酶切後回收片段。另外，以所提質粒為模板，PCR擴增蟾分枝桿菌Mxe GyrA內含肽的序列。所使用的引物根據Mxe GyrA基因的5』和3』端序列合成，2個引物序列分別為 5，CTCGAGTGCATCACGGGAGATGCACTAG 3，和 5，GGATCCCCTTCCTGCAGTCATTGAAG 3，，擴增後進行凝膠電泳，回收大小806bp的片段。之後將得到片段使用BioI和BamHI雙酶切，後回收片段。提取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)基因組，以所提取的基因組為模板， 進行PCR擴增，電泳回收木聚糖酶xylB基因約678bp片段。所使用的引物根據xylB基因的5，禾Π 3，端序列合成，2個引物序列分別為5，GAATTCTGCTTTAACATTAGCATG 3，和 5，CTCGAGATATTCGCCTTTCCTTCCCTCG 3，。擴增後進行凝膠電泳，回收大小67^3ρ的片段，與 PGEM-T載體連接，轉化大腸桿菌ToplO。LB培養基塗板後篩選陽性重組子，提取質粒進行鑑定，得到重組子PGEMX。之後提取pGEMX質粒，使用BioI和EcoRI酶切後回收678bp的片段。最後將回收後的dnaB基因片段、Mxe GyrA片段和xylB基因片段一同與經NdeI和 BamHI雙酶切的pTWim質粒片段4°C連接過夜，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，LB培養基塗板後篩選陽性重組子，提取質粒進行鑑定，得到重組子。xylB基因插入DnaB和GyrA兩種內含肽之間，重組質粒PTX圖譜見圖1。實施例2木聚糖酶的體外環化1)蛋白環化及純化程序將重組子接種到20mL的LB培養基中，37°C振蕩培養過夜，按接種量接種於1 升LB培養基中，與37°C培養至OD為0. 5，加入IPTG至終濃度0. 5mM,繼續培養3小時，誘導表達木聚糖酶。離心收集菌體，菌體重懸於IOOmL含500mM NaCl的Tris-HCl (pH7. 0)緩衝液中，超聲波破碎菌體，I3OOOrpm離心30分鐘去除細胞碎片。上清液通過幾丁質柱，之後用20倍柱床體積的緩衝液l(20mM Tris-HCl pH7.0，0. 5M NaCl)徹底洗柱。停止柱流， 20°C放置16小時，誘導kp DnaB內含肽的剪切。後用3倍柱床體積的緩衝液1過柱，再使用3倍柱體積的緩衝液2(20mM Tris-HCl pH7. 0,0. 5M NaCl，含50mM MESNA)過柱，之後停止柱流，4°C放置過夜，誘導Mxe GyrA內含肽的剪切及環化的發生。次日，用3倍柱床體積的緩衝液1洗脫，大約收集8-10管，每管5ml。通過^Onm UV吸光值進行蛋白檢測。2)環化情況的檢驗將洗脫得到的蛋白液取50 μ 1，加入1 μ 1 Factor fci蛋白酶20°C切割6小時酶。之後將酶切前後的蛋白液進行SDS-PAGE電泳。環化的蛋白的電泳遷移速率要快於經!^ctoriCa蛋白酶切割線性後的蛋白，由此判斷環化的發生。結果見圖3，環化的木聚糖蛋白的電泳遷移速率快於i^actoriCa蛋白酶重新線性化的蛋白遷移速率，證明環化成功。實施例3環化木聚糖酶酶活測定1)標準曲線製作分別吸取木糖標準液1. O，2. O，3. O，4. O，5. Oml於50ml容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，稀釋成濃度分別為0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1. Omg/ml木糖標準液。取不同濃度的稀釋木糖標準液0. 5ml於三支試管中，加入磷酸二氫鈉-檸檬酸緩衝液1. 5ml，加入DNS試劑 3. 0ml，沸水浴5分鐘，之後用加入去離子水稀釋10ml，混勻。用去離子水做對照。冷卻後 MOnm測定吸光值。以吸光值為縱坐標，木糖濃度為橫坐標，繪製標準曲線。過木糖標準曲線的回歸方程為y = 0. 148x-0. 0754，其中R2 = 0. 9997。2)木聚糖酶酶活測定酶活性單位(U)定義為1ml酶液於37°C、pH5. 5條件下，每分鐘催化分解木聚糖產生1 μ mol木糖的酶量為一個酶活力單位U。酶活測定方法如下將實施例2中洗脫得到的酶液稀釋500倍後，吸取0. 5ml，加入1 %木聚糖底物1. 5ml。混合後37°C水浴反應30分鐘，加入DNS液3. Oml終止反應，然後沸水浴處理5分鐘，取出後加入IOml蒸餾水，混勻後使用紫外分光光度計於540nm測定吸光值。將吸光值帶入木糖標準曲線的回歸方程算出對應的木糖濃度。測得吸光值A結果為0. 535，得到對應的木糖濃度為4. 124mg/mL·將所得的木糖濃度為4. 12%ig/ml，帶入如下公式計算酶活力木聚糖酶活力(U/ml)= CX500X1000/MXt。式中，C為所得的木糖濃度；M為木糖的分子量(150. 2)；t為酶解反應時間30min。酶活測定結果所得酶活為458U/ml。實施例4環化木聚糖酶和野生型木聚糖酶的熱穩定性測定比較在乙酸-乙酸鈉緩衝溶液緩衝液體系緩衝液和條件下，熱穩定性測定為酶液分別在65、70、75、80、85、90、95°C下水浴處理30分鐘，之後迅速放入冰上冷卻。在37°C下進行酶活測定，方法同實施例3。野生型木聚糖酶的純化方法同實施例2，酶活測定方法同實施例3。不同之處是野生型木聚糖酶的第一個胺基酸為色氨酸。剩餘酶活百分比為熱處理後的酶活與未做熱處理所測酶活之比，以處理溫度為橫坐標，剩餘酶活％為縱坐標作圖。如圖 2所示，結果表明環化木聚糖酶95°C熱處理後剩餘酶活為206U/ml，為熱處理前458U/ml的 45%，而野生型木聚糖酶95°C熱處理後剩餘酶活約為88U/ml，為熱處理前20%。顯示環化木聚糖酶較野生型木聚糖酶耐熱性有所提高。
權利要求
1.一種環化酶蛋白的方法，包括整套表達載體的構建、重組子的篩選及環化分子鑑定， 其特徵在於通過集胞藍細菌kp DnaB內含肽和蟾分枝桿菌Mxe GyrA內含肽介導環化酶蛋白質，用天然的肽鍵將酶蛋白的N、C兩端連結起來。
2.權利要求1所述的方法，所述酶蛋白的多肽序列的第一個胺基酸是半胱氨酸，且酶蛋白的三維晶體結構已知，同時酶蛋白的N、C兩端應位於蛋白結構的同側。
3.—種環化的酶，其特徵在於酶蛋白的多肽序列第1個胺基酸為半胱氨酸，且酶蛋白的N、C兩端相連結。
4.一種環化的木聚糖酶，編碼該酶的基因具有GenBank為DQ100307. 1所示的核苷酸序列。
5.一種環化木聚糖酶蛋白的方法，其特徵在於通過集胞藍細菌kp DnaB內含肽和蟾分枝桿菌Mxe GyrA內含肽介導的環化方法，用天然的肽鍵將酶蛋白的N、C兩端連結起來， 並且在大腸桿菌中表達GenBank為DQ100307. 1所示核苷酸序列的基因。
6.一種重組大腸桿菌細胞，含有GenBank為DQ100307. 1所示核苷酸序列的基因。
全文摘要
本發明涉及一種酶蛋白環化方法，通過集胞藍細菌Ssp DnaB內含肽和蟾分枝桿菌Mxe GyrA內含肽介導環化酶蛋白質，用天然的肽鍵將酶蛋白的N、C兩端連結起來。本發明用上述方法得到了增強熱穩定性的環化木聚糖酶。
文檔編號C12N9/00GK102296081SQ20101021812
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月24日 優先權日2010年6月24日
發明者平淑珍, 張維, 林敏 , 燕永亮, 趙仲麟, 陸偉, 陳明 申請人:中國農業科學院生物技術研究所