一種巴馬香豬體細胞克隆的方法
2023-05-01 19:28:41 1
專利名稱：一種巴馬香豬體細胞克隆的方法
技術領域：
本發明涉及動物繁殖、動物胚胎生物技術，具體是一種巴馬香豬體細胞克隆的方法。
背景技術：
至今並未發現有與本發明相同或相似的報導。
發明內容
本發明的目的是為了 1.解決人類異種器官移植所進行轉基因豬研究必需的關鍵技術問題，為基因打靶豬和異種器官移植等研究奠定基本而又必要的研究手段。2.為具有重要經濟價值的優良地方品種巴馬香豬的保種開闢了一條新的途徑，也可大量繁育其它具有優良性狀的種豬，解決優良種豬引種、保種和品種改良等問題，大大加快優良種豬引種、保種和品種改良的速度。3.對探討豬早期胚胎發育的全能性，揭示豬胚胎、組織、個體發育中基因組印跡現象的本質，對研究發育過程中同種動物或異種動物核質互作關係，特別是對解決核遺傳物質(核DNA)與細胞質遺傳物質(線粒體DNA)的調控和相容性等發育核心問題均具有重要價值。提供一種具有重要經濟價值的優良地方品種巴馬香豬體細胞克隆的方法。本發明解決上述技術問題的技術方案如下一種巴馬香豬體細胞克隆的方法，是按以下步驟進行操作1.相關試劑的配製 1)磷酸鹽緩衝液DPBS的配製磷酸鹽緩衝液DPBS的配製稱取DPBS粉劑9. 5克/L，青黴素66 μ g/L，和鏈黴素 100 μ g/L,超純水定容，待藥品充分溶解後，用滅菌的濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分
裝，4°C保存。2)體細胞培養液DMEM的配製體細胞培養液DMEM的成分為DMEM粉劑9. 5g/L，44mM NaHCO3, ImM丙酮酸鈉， 66mg/L青黴素鈉和100mg/L硫酸鏈黴素，體積百分濃度10% -15%的FCS和體積百分濃度
的非必需胺基酸。根據以上配方，將DMEM粉末溶於超純水中，加入NaHCO3，丙酮酸鈉，青黴素鈉和硫酸鏈黴素，然後調PH至7. 2-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾除菌，分裝後儲於4°C 備用；使用前添加FCS和非必需胺基酸；使用前放在培養箱內預熱平衡。3)細胞傳代消化液胰蛋白酶的配製細胞傳代消化液胰蛋白酶的成分為2. 5mg/ml胰蛋白酶和0. ^igAilEDTA-Nii4。根據以上配方，取胰蛋白酶和EDTA-Nii4溶解於磷酸緩衝液中，充分溶解完後，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾除菌，分裝後儲於-20°C備用。4)體細胞冷凍液的配製體積百分濃度10-15% FCS的DMEM培養液中加入體積百分濃度10% DMSO ；5)洗卵液的配製洗卵液為改良TL-ifepes-PVA液，調pH至7. 3-7. 4後，用濾膜孔徑為0. 22 μ m濾器過濾分裝，放於4°C保存，1-4周內用完，使用前放在35-39°C恆溫箱中預熱。6)豬卵泡液的配製抽取豬卵巢上直徑3_8mm卵泡的卵泡液，將抽取液放入離心管中離心，收集上清液，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，-20°c至_80°C保存備用。7) FSH和LH儲存液的配製取體外成熟液儲液放入小瓶內，稱量少量BSA或者血清溶解於該儲存液中，再加入FSH，充分溶解後，過濾除菌，分裝，-20°C至_80°C保存備用；使用時將其添加到豬卵母細胞成熟液中，最終濃度為0. 5-1. 0 μ g/ml。取TCM-199成熟液的儲存液放入小瓶內，稱量少量BSA或者血清溶解於該儲存液中，再加入LH，充分溶解後，過濾除菌，分裝，-20°C至-80°C保存備用；使用時將其添加到豬卵母細胞成熟液中，最終濃度為0. 5-1. 0 μ g/ml。8) EGF儲液的配製稱量EGF加入含BSA或者血清的TCM-199成熟液儲存液中，分裝，_20°C至_80°C 保存備用；使用時稀釋，最終使用濃度為lOng/ml。9)體外成熟液的配製體外成熟液儲液為改良的TCM-199，其成分為3. 05mM D-glucose，0. 91mM Sodium pyruvate, 26. 19mM NaHCO3,0. 09mM EDTA · Na4 · 2H20, 75 μ g/mlPenicillin G,50y g/ml Str印tomycin，用濾孔為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存備用；使用前，在成熟液儲液中添加最終使用濃度為0. 57mM的半胱氨酸、最終使用濃度為lOng/ml的EGF、最終使用濃度為0. 5-1 μ g/ml的FSH、最終使用濃度為0. 5-1 μ g/ml的LH和最終使用濃度為10%的卵泡液，再次用濾孔為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，放入二氧化碳培養箱中平衡備用。10)胚胎培養液的配製採用NCSU-23或者PZM-3培養液用於重構胚胎的體外培養，調節pH為7. 2-7. 3，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存，1-4周內用完。11)核移植操作液的配製在洗卵液中添加體積百分濃度5-15% FCS和5_7. 5 μ g/ml細胞鬆弛素B，使用前將其放在35-39°C恆溫箱中預熱。12)融合激活液稱取0. 3M 甘露醇，0. ImM CaCl2 · 2H20，0. ImM MgS04 · 7Η20，0. 5mM Hepes,0. 3% BSA或者0. lg/L PVA0用超純水定容，調整pH值7. 3-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4 °C保存，使用前在30-39 °C恆溫箱中預熱。13)細胞鬆弛素B的配製用DMSO溶解細胞鬆弛素B，分裝到Eppendorf管中，_20°C至_80°C凍存，最終工作濃度為 5-7. 5 μ g/ml。
14)透明質酸酶儲存液的配製透明質酸酶儲存液的配製稱取透明質酸酶，加入到含BSA或者血清的洗卵液中， 過濾，分裝到Eppendorf管中，-20°C至_80°C保存；使用時稀釋，使用最終濃度為Hmg/ml。2.巴馬香豬睪丸細胞的體外培養採集當地巴馬香豬養殖場給雄性巴馬香豬去勢的睪丸組織，將其放入含青、鏈黴素的磷酸鹽緩衝液或者生理鹽水中清洗，然後用體積百分濃度75%酒精快速清洗後，再用含青、鏈黴素的磷酸鹽緩衝液或者生理鹽水中徹底清洗；在超淨工作檯內，把去勢的睪丸組織塊移到滅菌過的小瓶中，用眼科剪將其剪碎， 加入磷酸緩衝液或者生理鹽水，移到滅菌離心管中離心，洗滌，棄掉上清，向沉澱中加入少許DMEM培養液，移到培養皿中攤均勻，轉入體積百分濃度5% CO2、溫度37°C和最大飽和溼度的培養箱中培養，第二天加入DMEM培養液；以後每2-3天換液一次，待細胞長到70-80% 匯合時，輕輕撥掉組織塊，然後將其和培養液一起清除，用DPBS清洗，用胰蛋白酶溶液消化，然後加入DMEM終止消化，並輕輕吹打；然後將液體移到滅菌的離心管中，離心，棄掉上清，再向離心管中加入新鮮的DMEM培養液，重懸細胞，調整濃度後，接種到培養皿中，繼續培養，每2-3天換液一次。70-90%匯合時，將細胞傳代或冷凍。3.巴馬香豬睪丸細胞的冷凍睪丸細胞體外培養長到70-90%匯合時，用磷酸鹽緩衝液清洗細胞，然後加入胰蛋白酶溶液作用，待大部分細胞變圓部分細胞已脫壁時迅速加入DMEM終止消化，吹打至細胞完全脫壁，把細胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入細胞凍存液，吹打均勻後分裝到細胞凍存管內，於4°C冰箱中置0. 5個小時，再放入-80°C冰箱過夜，過夜後直接將凍存管放入液氮中。4.冷凍睪丸細胞的解凍從-80°C液氮中取出凍存管，快速投入30-37°C溫水中，不斷搖動凍存管，待冰塊全部融化後，將細胞懸液轉移至離心管中，加入預熱的DMEM培養液，離心清洗，然後用預熱的DMEM調整到所需的細胞濃度後接種到培養皿培養。5)豬卵母細胞的採集和體外成熟培養從當地生豬肉類加工廠收集豬卵巢，放入含有含青、鏈黴素的30-37°C生理鹽水或者磷酸鹽緩衝液中，送回實驗室，用含青、鏈黴素的生理鹽水或者磷酸鹽緩衝液衝洗，帶入無菌操作室，用裝有針頭的注射器抽取卵巢表面直徑為2 6mm的卵泡，將抽取的卵泡液放入玻璃或者塑料管中，靜置0. 5-1小時，用洗卵液稀釋後放在實體顯微鏡下，用玻璃吸管挑選帶有2層以上卵丘細胞、胞質均勻的卵母細胞，在洗卵液中洗滌，用預平衡的成熟液洗滌，最後放入含FSH和LH的成熟液滴中，培養20-22小時，然後移入不含激素的新鮮成熟液滴中繼續培養20-22小時，培養條件為體積百分濃度5% CO2、最大飽和溼度、38. 5_39°C。6.核移植1)卵母細胞的準備將體外培養40_44h的豬卵母細胞在透明質酸酶中作用，輕輕吹打除去周圍卵丘細胞，用玻璃撥卵針在實體顯微鏡下輕輕轉動卵母細胞，挑選出胞質均勻且有極體排放的卵母細胞為核移植備用。2)巴馬香豬睪丸細胞的準備
選擇3-10代生長狀態良好的細胞，去除培養液，用DPBS清洗後，加入胰蛋白酶溶液作用，待70-90%的細胞已脫壁時，加入預熱的DMEM終止消化，輕輕吹打，然後將細胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入核移植操作液，重懸睪丸細胞離心洗滌，棄上清後加入核移植操作液，重懸睪丸細胞，然後再向混合液中加入細胞鬆弛素B，使最終使用濃度為 5-7. 5μ g/ml。3)操作滴的準備用上述調整好的睪丸細胞懸液，做成長條型液滴，上面覆蓋礦物油，將挑選出的卵母細胞放在上述長條型液滴中，在顯微操作儀下去核操作；吸取中等大小圓形、表面光滑， 細胞膜折光度較好的睪丸供體細胞通過透明帶切口注射到透明帶下方，並輕點透明帶使睪丸供體細胞與卵母細胞膜接觸良好，形成了重構卵。4)重構卵的融合/激活和培養將重構卵放在含有細胞鬆弛素B的胚胎培養液滴中，然後把恢復好的重構卵移到融合液中洗滌，然後進行融合/激活，融合後的重構卵用胚胎培養液洗滌，放入平衡好的含細胞鬆弛素B的胚胎培養液滴中培養3個小時，挑選融合好的重構卵，用胚胎培養液洗滌， 然後移到胚胎培養液滴中培養，培養條件為39°C，體積百分濃度5% CO2，最大飽和溼度，得到體細胞核移植胚胎，將體細胞核移植胚胎移植到受體雌豬體內相應部位，懷孕到期後產下體細胞克隆的巴馬香豬。發明的有益效果是1.對社會的意義1)為加快國內轉基因豬技術和人類異種器官移植的研究做出了貢獻；2)加快了廣西乃至全國畜牧業發展水平的速度；3)為國內同類研究奠定了技術基礎；4)對培養人才、推廣科學知識起到了積極作用。2.對科技進步的意義1)在學術上填補了國內空白；2)在國內學術界有廣泛而深遠的影響。
圖1是本發明有關克隆巴馬香豬的照片。圖中A是新生克隆巴馬香豬及其代孕母親陸川豬的照片；B是成年後的該克隆巴馬香豬的照片；C是新生Fl代雜交豬及其母親陸川豬的照片；D是斷奶後的Fl代雜交豬的照片；E是F2代雜交豬的照片。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步描述。必須說明在權利要求書中所有工藝條件下進行克隆試驗結果與本實施例結果相似。實施例1.相關試劑的配製(1)磷酸鹽緩衝液DPBS的配製
磷酸鹽緩衝液DPBS的配製稱取DPBS粉劑9. 5克/L，青黴素66 μ g/L，和鏈黴素 100 μ g/L,超純水定容，待藥品充分溶解後，用滅菌的濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存；(2)體細胞培養液DMEM的配製體細胞培養液DMEM的成分為DMEM粉劑9. 5g/L,44mM NaHC03, ImM丙酮酸鈉， 66mg/L青黴素鈉和100mg/L硫酸鏈黴素，體積百分濃度15%的FCS和體積百分濃度1 %的
非必需胺基酸；根據以上配方，將DMEM粉末溶於超純水中，加入NaHCO3,丙酮酸鈉，青黴素鈉和硫酸鏈黴素，然後調PH至7. 2-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾除菌，分裝後儲於4°C 備用；使用前添加FCS和非必需胺基酸；使用前放在培養箱內預熱平衡；(3)細胞傳代消化液胰蛋白酶的配製細胞傳代消化液胰蛋白酶的成分為2. 5mg/ml胰蛋白酶和0. 2mg/mlEDTA-Na4 ；根據以上配方，取胰蛋白酶和EDTA-Nii4溶解於磷酸緩衝液中，充分溶解完後，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾除菌，分裝後儲於-20°c備用；(4)體細胞冷凍液的配製體積百分濃度15% FCS的DMEM培養液中加入體積百分濃度10% DMSO ；(5)洗卵液的配製洗卵液為改良TL-ifepes-PVA液，調pH至7. 3-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m濾器過濾分裝，放於4°C保存，4周內用完，使用前放在39。C恆溫箱中預熱(6)豬卵泡液的配製抽取豬卵巢上直徑3_8mm卵泡的卵泡液，將抽取液放入離心管中離心，收集上清液，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，-20°c保存備用；(7) FSH和LH儲存液的配製取體外成熟液的儲存液放入小瓶內，稱量少量BSA或者血清溶解於該儲存液中， 再加入FSH，充分溶解後，過濾除菌，分裝，-20°C保存備用；使用時將其添加到豬卵母細胞成熟液中，最終濃度為0. 5 μ g/ml ；取TCM-199成熟液的儲存液放入小瓶內，稱量少量BSA或者血清溶解於該儲存液中，再加入LH，充分溶解後，過濾除菌，分裝，-20°C保存備用；使用時將其添加到豬卵母細胞成熟液中，最終濃度為0. 5 μ g/ml ；(8)體外成熟液的配製體外成熟液儲液為改良的TCM-199，其成分為3. 05mM D-glucose，0. 91mM Sodium pyruvate,26. 19mM NaHCO3,0. 09mM EDTA · Na4· 2H20,75 μ g/mlPenicillin G,50 μ g/ml Str印tomycin，用濾孔為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存備用；使用前，在成熟液儲液中添加最終使用濃度為0. 57mM的半胱氨酸、最終使用濃度為lOng/ml的EGF、最終使用濃度為0. 5 μ g/ml的FSH、最終使用濃度為0. 5 μ g/ml的LH和最終使用濃度為10%的卵泡液， 再次用濾孔為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，放入二氧化碳培養箱中平衡備用；(9)胚胎培養液的配製採用NCSU-23培養液用於重構胚胎的體外培養，調節pH為7. 2-7. 3，用濾膜孔徑為 0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存，4周內用完；
(10)核移植操作液的配製在洗卵液中添加體積百分濃度15% FCS和7. 5 μ g/ml細胞鬆弛素B，使用前將其放在39°C恆溫箱中預熱；(11)融合激活液稱取0. 3M 甘露醇，0. ImM CaCl2 · 2H20，0. ImM MgS04 · 7Η20，0· 5mMHepes,0. lg/L PVA。用超純水定容，調整pH值7. 3-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存，使用前在39°C恆溫箱中預熱；(12)細胞鬆弛素B的配製用DMSO溶解細胞鬆弛素B，分裝到Eppendorf管中，-20至_80°C凍存，最終工作濃度為7. 5 μ g/ml ；(13)透明質酸酶儲存液的配製透明質酸酶儲存液的配製稱取透明質酸酶，加入到含BSA或者血清的洗卵液中， 過濾，分裝到Eppendorf管中，_20°C保存；使用時稀釋，使用最終濃度為2mg/ml ；(14) EGF儲液的配製稱量EGF加入含BSA或者血清的TCM-199成熟液儲存液中，分裝，_20°C保存備用； 使用時稀釋，最終使用濃度為lOng/ml ；2.巴馬香豬睪丸細胞的體外培養採集當地巴馬香豬養殖場給雄性巴馬香豬去勢的睪丸組織，將其放入含青、鏈黴素的磷酸緩衝液或者生理鹽水中清洗，然後用體積百分濃度75%酒精快速清洗後，再用含青、鏈黴素的磷酸緩衝液或者生理鹽水中徹底清洗；在超淨工作檯內，把去勢的睪丸組織塊移到滅菌過的小瓶中，用眼科剪將其剪碎， 加入磷酸緩衝液或者生理鹽水，移到滅菌離心管中離心，洗滌，棄掉上清，向沉澱中加入少許DMEM培養液，移到培養皿中攤均勻，轉入體積百分濃度5% CO2、溫度37°C和最大飽和溼度的培養箱中培養，第二天加入DMEM培養液；以後每2天換液一次，待細胞長到70-80%匯合時，輕輕撥掉組織塊，然後將其和培養液一起清除，用DPBS清洗，用胰蛋白酶溶液消化， 然後加入DMEM終止消化，並輕輕吹打；然後將液體移到滅菌的離心管中，離心，棄掉上清， 再向離心管中加入新鮮的DMEM培養液，重懸細胞，調整濃度後，接種到培養皿中，繼續培養，每2天換液一次。70-90%匯合時，將細胞傳代或冷凍；3.巴馬香豬睪丸細胞的冷凍睪丸細胞體外培養長到70-90%匯合時，用磷酸緩衝液清洗細胞，然後加入胰蛋白酶溶液作用，待大部分細胞變圓部分細胞已脫壁時迅速加入DMEM終止消化，吹打至細胞完全脫壁，把細胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入細胞凍存液，吹打均勻後分裝到細胞凍存管內，於4°C冰箱中置0. 5個小時，再放入-80°C冰箱過夜，過夜後直接將凍存管放入液氮中；4.冷凍睪丸細胞的解凍從-80°C液氮中取出凍存管，快速投入37°C溫水中，不斷搖動凍存管，待冰塊全部融化後，將細胞懸液轉移至離心管中，加入預熱的DMEM培養液，離心清洗，然後用預熱的 DMEM調整到所需的細胞濃度後接種到培養皿培養；5.豬卵母細胞的採集和體外成熟培養
從當地生豬肉類加工廠收集豬卵巢，放入含有青、鏈黴素的30-37°C生理鹽水或者磷酸緩衝液中，送回實驗室，用含青、鏈黴素的生理鹽水或者磷酸鹽緩衝液衝洗，帶入無菌操作室，用裝有針頭的注射器抽取卵巢表面直徑為2 6mm的卵泡，將抽取的卵泡液放入玻璃或者塑料管中，靜置0. 5小時，用洗卵液稀釋後放在實體顯微鏡下，用玻璃吸管挑選帶有 2層以上卵丘細胞、胞質均勻的卵母細胞，在洗卵液中洗滌，用預平衡的成熟液洗滌，最後放入含FSH和LH的成熟液滴中，培養20-22小時，然後移入不含激素的新鮮成熟液滴中繼續培養20-22小時，培養條件為體積百分濃度5% CO2、最大飽和溼度、39°C ；6.核移植(1)卵母細胞的準備將體外培養40_44h的豬卵母細胞在透明質酸酶中作用，輕輕吹打除去周圍卵丘細胞，用玻璃撥卵針在實體顯微鏡下輕輕轉動卵母細胞，挑選出胞質均勻且有極體排放的卵母細胞為核移植備用；(2)巴馬香豬睪丸細胞的準備選擇3-10代生長狀態良好的細胞，去除培養液，用DPBS清洗後，加入胰蛋白酶溶液作用，待70-90%的細胞已脫壁時，加入預熱的DMEM終止消化，輕輕吹打，然後將細胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入核移植操作液，重懸睪丸細胞離心洗滌，棄上清後加入核移植操作液，重懸睪丸細胞，然後再向混合液中加入細胞鬆弛素B，最終使用濃度為 7. 5 μ g/ml ；(3)操作滴的準備用上述調整好的睪丸細胞懸液，做成長條型液滴，上面覆蓋礦物油，將挑選出的卵母細胞放在上述長條型液滴中，在顯微操作儀下去核操作；吸取中等大小圓形、表面光滑， 細胞膜折光度較好的睪丸供體細胞通過透明帶切口注射到透明帶下方，並輕點透明帶使睪丸供體細胞與卵母細胞膜接觸良好，形成了重構卵；(4)重構卵的融合/激活和培養將重構卵放在含有細胞鬆弛素B的胚胎培養液滴中，然後把恢復好的重構卵移到融合液中洗滌，然後進行融合/激活，融合後的重構卵用胚胎培養液洗滌，放入平衡好的含細胞鬆弛素B的胚胎培養液滴中培養3個小時，挑選融合好的重構卵，用胚胎培養液洗滌， 然後移到胚胎培養液滴中培養，培養條件為39°C，體積百分濃度5% CO2，最大飽和溼度，得到體細胞核移植胚胎，將體細胞核移植胚胎移植到受體雌豬體內相應部位，懷孕到期後產下體細胞克隆的巴馬香豬。7.結果2007年度進行巴馬香豬體細胞核移植胚胎的胚胎移植4頭·次，結果於2007年 10月產下一頭體細胞克隆的雄性巴馬香豬，從毛色、體型、性別和DNA鑑定，都證明是巴馬香豬克隆豬。該雄性克隆巴馬香豬成年後與13頭陸川豬母豬配種，其中3頭母豬返情，受胎10 頭，產仔10窩共98頭仔豬，活產93頭，即該雄性克隆巴馬香豬已經繁殖出了 93頭活仔豬後代，說明該雄性克隆巴馬香豬具有正常的繁殖能力。隨機選擇該雄性克隆巴馬香豬的雌性後代3頭，進行人工輸精配種，受胎3頭，產仔3窩共22頭仔豬，活產14頭，說明該雄性克隆巴馬香豬的後代也具備正常的繁殖能力。
表1 克隆巴馬小型豬及其Fl後代遺傳分析
權利要求
1. 一種巴馬香豬體細胞克隆的方法，其特徵在於，按以下步驟進行操作1)相關試劑的配製(1)磷酸鹽緩衝液DPBS的配製磷酸鹽緩衝液DPBS的配製稱取DPBS粉劑9. 5克/L，青黴素66 μ g/L，和鏈黴素 100 μ g/L,超純水定容，待藥品充分溶解後，用滅菌的濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存；(2)體細胞培養液DMEM的配製體細胞培養液DMEM的成分為DMEM粉劑9. 5g/L，44mM NaHC03, ImM丙酮酸鈉，66mg/L 青黴素鈉和100mg/L硫酸鏈黴素，體積百分濃度10% -15%的FCS和體積百分濃度1 %的非必需胺基酸；根據以上配方，將DMEM粉末溶於超純水中，加入NaHCO3，丙酮酸鈉，青黴素鈉和硫酸鏈黴素，然後調PH至7. 2-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾除菌，分裝後儲於4°C備用； 使用前添加FCS和非必需胺基酸；使用前放在培養箱內預熱平衡；(3)細胞傳代消化液胰蛋白酶的配製細胞傳代消化液胰蛋白酶的成分為2. 5mg/ml胰蛋白酶和0. 2mg/mlEDTA-Na4 ；根據以上配方，取胰蛋白酶和EDTA-Na4溶解於磷酸緩衝液中，充分溶解完後，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾除菌，分裝後儲於_20°C備用；(4)體細胞冷凍液的配製體積百分濃度10-15% FCS的DMEM培養液中加入體積百分濃度10% DMSO ；(5)洗卵液的配製洗卵液為改良TL-ifepes-PVA液，調pH至7. 3-7. 4後，用濾膜孔徑為0. 22 μ m濾器過濾分裝，放於4°C保存，1-4周內用完，使用前放在35-39°C恆溫箱中預熱；(6)豬卵泡液的配製抽取豬卵巢上直徑3-8mm卵泡的卵泡液，將抽取液放入離心管中離心，收集上清液，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，-20°C至_80°C保存備用；(7)FSH和LH儲存液的配製取TCM-199成熟液的儲存液放入小瓶內，稱量少量BSA或者血清溶解於該儲存液中，再加入FSH，充分溶解後，過濾除菌，分裝，-20°C至_80°C保存備用；使用時將其添加到豬卵母細胞成熟液中，最終濃度為0. 5-1.0 μ g/ml ；取TCM-199成熟液的儲存液放入小瓶內，稱量少量BSA或者血清溶解於該儲存液中，再加入LH，充分溶解後，過濾除菌，分裝，-20°C至-80°C保存備用；使用時將其添加到豬卵母細胞成熟液中，最終濃度為0. 5-1.0 μ g/ml ；(8)EGF儲液的配製稱量EGF加入含BSA或者血清的TCM-199成熟液儲存液中，分裝，_20°C至_80°C保存備用；使用時稀釋，最終使用濃度為lOng/ml ；(9)體外成熟液的配製體外成熟液儲液為改良的TCM-199，其成分為3. 05mM D-glucose，0. 91mM Sodium pyruvate,26. 19mM NaHCO3,0. 09mM EDTA 『 Na4『 2H20,75 μ g/mlPenicillin G，50 μ g/ml Str印tomycin，用濾孔為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存備用；使用前，在成熟液儲液中添加最終使用濃度為0. 57mM的半胱氨酸、最終使用濃度為lOng/ml的EGF、最終使用濃度為0. 5-1 μ g/ml的FSH、最終使用濃度為0. 5-1 μ g/ml的LH和最終使用濃度為10%的卵泡液，再次用濾孔為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，放入二氧化碳培養箱中平衡備用；(10)胚胎培養液的配製採用NCSU-23或者PZM-3培養液用於重構胚胎的體外培養，調節pH為7. 2-7. 3，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存，1-4周內用完；(11)核移植操作液的配製在洗卵液中添加體積百分濃度5-15% FCS和5-7. 5 μ g/ml細胞鬆弛素B，使用前將其放在35-39°C恆溫箱中預熱；(12)融合激活液稱取 0. 3M 甘露醇，0. ImM CaCl2 · 2H20，0. ImM MgS04 · 7Η20，0· 5mMHepes,0. 3% BSA 或者0. lg/L PVA。用超純水定容，調整pH值7. 3-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存，使用前在30-39°C恆溫箱中預熱；(13)細胞鬆弛素B的配製用DMSO溶解細胞鬆弛素B，分裝到Eppendorf管中，_20°C至_80°C凍存，最終工作濃度為 5-7. 5 μ g/ml ；(14)透明質酸酶儲存液的配製透明質酸酶儲存液的配製稱取透明質酸酶，加入到含BSA或者血清的洗卵液中，過濾，分裝到Eppendorf管中，_20°C至_80°C保存；使用時稀釋，使用最終濃度為Hmg/ml ；2)巴馬香豬睪丸細胞的體外培養採集當地巴馬香豬養殖場給雄性巴馬香豬去勢的睪丸組織，將其放入含青、鏈黴素的磷酸鹽緩衝液或者生理鹽水中清洗，然後用體積百分濃度為75%酒精快速清洗後，再用含青、鏈黴素的磷酸鹽緩衝液或者生理鹽水中徹底清洗；在超淨工作檯內，把去勢的睪丸組織塊移到滅菌過的小瓶中，用眼科剪將其剪碎，加入磷酸緩衝液或者生理鹽水，移到滅菌離心管中離心，洗滌，棄掉上清，向沉澱中加入少許 DMEM培養液，移到培養皿中攤均勻，轉入體積百分濃度5% CO2、溫度37°C和最大飽和溼度的培養箱中培養，第二天加入DMEM培養液；以後每2-3天換液一次，待細胞長到70-80 %匯合時，輕輕撥掉組織塊，然後將其和培養液一起清除，用DPBS清洗，用胰蛋白酶溶液消化， 然後加入DMEM終止消化，並輕輕吹打；然後將液體移到滅菌的離心管中，離心，棄掉上清， 再向離心管中加入新鮮的DMEM培養液，重懸細胞，調整濃度後，接種到培養皿中，繼續培養，每2-3天換液一次。70-90%匯合時，將細胞傳代或冷凍；3)巴馬香豬睪丸細胞的冷凍睪丸細胞體外培養長到70-90%匯合時，用磷酸鹽緩衝液清洗細胞，然後加入胰蛋白酶溶液作用，待大部分細胞變圓部分細胞已脫壁時迅速加入DMEM終止消化，吹打至細胞完全脫壁，把細胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入細胞凍存液，吹打均勻後分裝到細胞凍存管內，於4°C冰箱中置0. 5個小時，再放入-80°C冰箱過夜，過夜後直接將凍存管放入液氮中；4)冷凍睪丸細胞的解凍從-80°C液氮中取出凍存管，快速投入30-37°C溫水中，不斷搖動凍存管，待冰塊全部融化後，將細胞懸液轉移至離心管中，加入預熱的DMEM培養液，離心清洗，然後用預熱的 DMEM調整到所需的細胞濃度後接種到培養皿培養；5)豬卵母細胞的採集和體外成熟培養從當地生豬肉類加工廠收集豬卵巢，放入含有含青、鏈黴素的30-37°C生理鹽水或者磷酸鹽緩衝液中，送回實驗室，用含青、鏈黴素的生理鹽水或者磷酸鹽緩衝液衝洗，帶入無菌操作室，用裝有針頭的注射器抽取卵巢表面直徑為2 6mm的卵泡，將抽取的卵泡液放入玻璃或者塑料管中，靜置0. 5-1小時，用洗卵液稀釋後放在實體顯微鏡下，用玻璃吸管挑選帶有2層以上卵丘細胞、胞質均勻的卵母細胞，在洗卵液中洗滌，用預平衡的成熟液洗滌，最後放入含FSH和LH的成熟液滴中，培養20-22小時，然後移入不含激素的新鮮成熟液滴中繼續培養20-22小時，培養條件為體積百分濃度5% CO2、最大飽和溼度、38. 5-39°C ；6)核移植(1)卵母細胞的準備將體外培養40-44h的豬卵母細胞在透明質酸酶中作用，輕輕吹打除去周圍卵丘細胞， 用玻璃撥卵針在實體顯微鏡下輕輕轉動卵母細胞，挑選出胞質均勻且有極體排放的卵母細胞為核移植備用；(2)巴馬香豬睪丸細胞的準備選擇3-10代生長狀態良好的細胞，去除培養液，用DPBS清洗後，加入胰蛋白酶溶液作用，待70-90%的細胞已脫壁時，加入預熱的DMEM終止消化，輕輕吹打，然後將細胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入核移植操作液，重懸睪丸細胞離心洗滌，棄上清後加入核移植操作液，重懸睪丸細胞，然後再向混合液中加入細胞鬆弛素B，使最終使用濃度為 5-7. 5 μ g/ml ；(3)操作滴的準備用上述調整好的睪丸細胞懸液，做成長條型液滴，上面覆蓋礦物油，將挑選出的卵母細胞放在上述長條型液滴中，在顯微操作儀下去核操作；吸取中等大小圓形、表面光滑，細胞膜折光度較好的睪丸供體細胞通過透明帶切口注射到透明帶下方，並輕點透明帶使睪丸供體細胞與卵母細胞膜接觸良好，形成了重構卵；(4)重構卵的融合/激活和培養將重構卵放在含有細胞鬆弛素B的胚胎培養液滴中，然後把恢復好的重構卵移到融合液中洗滌，然後進行融合/激活，融合後的重構卵用胚胎培養液洗滌，放入平衡好的含細胞鬆弛素B的胚胎培養液滴中培養3個小時，挑選融合好的重構卵，用胚胎培養液洗滌，然後移到胚胎培養液滴中培養，培養條件為39°C，體積百分濃度5% CO2，最大飽和溼度，得到體細胞核移植胚胎，將體細胞核移植胚胎移植到受體雌豬體內相應部位，懷孕到期後產下體細胞克隆的巴馬香豬。
全文摘要
本發明公開了一種巴馬香豬體細胞克隆的方法。方法按以下步驟進行操作1)相關試劑的配製；2)巴馬香豬體細胞的培養；3)巴馬香豬體細胞的冷凍；4)冷凍體細胞的解凍；5)豬卵母細胞的採集和體外成熟培養；6)體細胞核移植及胚胎移植。本發明的有益效果是1)加快國內轉基因豬技術和人類異種器官移植的研究。2)加快了廣西乃至全國畜牧業發展水平的速度。3)在學術上填補了國內空白。
文檔編號C12N15/877GK102321670SQ20111031119
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月14日 優先權日2011年10月14日
發明者盧克煥, 盧晟盛 申請人:廣西大學