鄰苯二甲酸酯汙染土壤的修複方法與流程
2023-05-01 16:14:41 2
本發明屬於生態環保領域，具體涉及一種鄰苯二甲酸酯汙染土壤的修複方法。
背景技術：
鄰苯二甲酸酯(Phthalate esters,PAEs)是鄰苯二甲酸的酯化衍生物，是最常見的塑化劑，主要應用於聚乙烯樹脂的合成、粘膠劑和塑料薄膜等的生產，所述的PAEs包括3種代表性的鄰苯二甲酸酯類(即鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸正二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)。近年來，由於PAEs的大量使用，這類化合物廣泛存在於大氣、水體和土壤等環境中，並通過食物鏈對人體健康造成影響。PAEs及其降解中間產物因被懷疑會引發癌症並損害腎臟，而被美國環境保護局(EPA)列為重要汙染物。作為環境雌激素，PAEs能夠擾亂內分泌系統的正常功能、幹擾人體和其他動物的生長發育、導致出生缺陷和生殖能力下降等危害。因此，如何有效控制和消除環境內PAEs引發的汙染已成為當務之急。
鄰苯二甲酸酯類物質降解方法主要有光催化氧化處理、生物降解、微波輻照處理、活性炭降解、臭氧氧化等方式，其中生物降解的作用佔重要地位。生物修復包括植物修復和微生物修復。植物修復是利用植物及其根際微生物的共存體系來吸收、轉移、容納或轉化汙染物使其對環境無害。作為一種原位綠色修復技術，植物修復在PAEs汙染土壤的修復中具有極大的優勢。但是隨著殘留時間的延長，土壤中的PAEs逐漸被土壤空隙吸附，使其生物有效性偏低，從而會導致植物對PAEs的降解和富集效率低。根際微生物對土壤中PAEs的降解有重要作用，同時植物根系分泌物能明顯強化微生物的降解功能。因而，植物與微生物的協同修復技術是土壤有機汙染生物修復領域的一個發展方向。
由於植物根系發達，其在生長過程中對PAEs具有較強的吸收、揮發、根濾、降解、穩定作用，可以淨化土壤中的PAEs等汙染物。為進一步提高植物對土壤中PAEs的修復效率，可採用生物修復技術中的植物修復和微生物強化技術相結合的方法。截至目前，利用微生物-植物聯合降解PAEs的報導較少。
技術實現要素：
針對生產實踐中的實際問題和需求，本發明提出降解土壤中PAEs的方法，以實現對鄰苯二甲酸酯汙染土壤高效、快速地修復。
本發明是通過以下技術方案實現的：
一種鄰苯二甲酸酯汙染土壤的修複方法，具體為以下三種方式中的任一種：(1)在汙染土壤中種植綠豆；(2)在汙染土壤中施加綠木黴F7；(3)在汙染土壤中種植綠豆，並聯合施加綠木黴F7；所述綠木黴F7的分類命名為Trichoderma virens，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.3.17613。
進一步地，保持汙染土壤中含水量為最大田間持水量的60-80％，以便有利於植物生長。
進一步地，綠豆種植及綠木黴F7聯合施加的方式為以下三者之一：(1)先在汙染土壤中種植綠豆再施加綠木黴F7；(2)先施加綠木黴F7再種植綠豆；(3)用綠木黴F7菌液浸泡綠豆種子再播種。
進一步地，所述種植的綠豆可以是直接將綠豆種子播種到汙染土壤中，也可以將綠豆植株移栽至汙染土壤中。
更進一步地，所述種植的綠豆優選直接將綠豆種子播種到汙染土壤中，直接在原土壤中播種生長，避免移栽損傷根莖，無需緩苗過程，更利於綠豆的紮根生長，因此降解PAEs的速度更快。
更進一步地，所述綠豆的種植密度為20-30株/m2土地，密度過低根系無法全面覆蓋汙染土壤造成降解率低，密度過高綠豆的營養光照等條件跟不上、生長弱，也會降低對PAEs的降解率。
進一步地，所述綠木黴F7的施加量為1×1010-9×1012個孢子數/m2土地，如果施加量過低，綠木黴F7無法在短期內有效擴增影響對PAEs的降解，施加量也不宜過高以有效控制成本。
進一步地，所述綠木黴F7的施加形式為發酵液或固體製劑。
進一步地，發酵液的製備方式為：將活化的綠木黴F7菌塊接種到含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)斜面上，28±2℃黑暗條件下培養4-6d後，用無菌水衝洗下分生孢子，將孢子液稀釋到1×105-9×105個孢子/mL作為發酵接種的種子液；取種子液按照1％的接種量接種於PDA液體培養基中，28±2℃，150-200r/min的恆溫震蕩培養4-6d，即得到綠木黴F7發酵液。
進一步地，發酵液的施加方式為將綠木黴F7發酵液直接施加在綠豆根部。
進一步地，發酵液在綠豆出苗後10d、20d和30d，分三次向植物根際部位接種，以加強接種效果。
進一步地，固體製劑的製備方式為將綠木黴F7種子液(1×105-9×105個孢子/mL)，加入到麥麩培養基中，28±2℃培養3-5d至長出白色菌絲時，無菌條件下用玻璃棒將菌絲和培養基充分混勻，使綠木黴F7布滿整個培養基；隔1.5-3d後再次用玻璃棒將菌絲和培養基充分混勻，直至整個麥麩培養基都長滿綠色的綠木黴F7孢子，混勻計數孢子量為1×109-9×109個孢子/g，得到綠木黴F7固體製劑。固體製劑的施加方式為按土壤重量的4-6％將固體製劑拌入土壤中。
本發明修復鄰苯二甲酸酯汙染土壤的方法與現有技術相比有如下優點：
(1)實驗發現綠木黴F7能夠利用鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)作為唯一碳源和能源生長繁殖，在純培養條件下，該菌5天就能將無機鹽培養基中300mg/L的DMP降解75.1％。該菌同時對鄰苯二甲酸正二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)等均具有良好的利用能力；
(2)綠豆適應性強，生長快，根系發達，生物量較大，能夠有效去除土壤中鄰苯二甲酸酯；
(3)綠豆根系與根際微生物綠木黴F7聯合，可進一步促進鄰苯二甲酸酯降解，使土壤中鄰苯二甲酸酯降解去除率最高達85％，實現高效去除鄰苯二甲酸酯。綠木黴F7聯合綠豆處理汙染土壤，提高了鄰苯二甲酸酯汙染土壤的修復效率，綠木黴F7與綠豆之間存在協同促進修復效果的現象；
(4)本發明方法在土壤中鄰苯二甲酸酯濃度高達256mg/kg條件下仍可實現85％去除率，因此適用於大範圍鄰苯二甲酸酯中、低濃度汙染土壤的修復。
附圖說明
圖1實施例1接種2.5％的綠木黴F7對不同濃度DMP、DBP、DEHP的降解率；
圖2實施例1接種10％的綠木黴F7對不同濃度DMP、DBP、DEHP的降解率；
圖3實施例2不同試驗處理條件下DMP、DBP、DEHP的降解率；
圖4實施例3不同試驗處理條件下DMP、DBP、DEHP的降解率。
具體實施方式
下面結合具體實施例及附圖對本發明做進一步詳細說明。
實施例1：綠木黴F7對鄰苯二甲酸酯的降解
接種環挑取純化培養的綠木黴F7，接入5g/L的葡萄糖溶液，於28℃，180r/min的恆溫震蕩培養箱中震蕩培養36h，誘導孢子萌發和菌絲生長。分光光度計測定菌液在660nm處的OD值，適當稀釋使其濃度一致(OD660≈0.8)，得到菌液。
配製基礎鹽培養基：MgSO4·7H2O 0.5g、KCl 0.5g、K2HPO4 1.31g、NaNO3 3.0g、FeSO4·7H2O0.018g、補足蒸餾水至1000mL；pH 7.0，121℃，0.1MPa滅菌20min。向滅菌後的基礎鹽培養基中添加PAEs，得到PAEs培養基。設置4組不同的濃度梯度，3種PAEs濃度分別為0、25、50和100mg/L，PAEs總濃度分別為0、75、150和300mg/L。
設置2種接種量，分別以2.5％和10％(菌液與PAEs培養基的體積比)的接種量將菌液接入到上述PAEs培養基中，以不接種綠木黴F7的PAEs無機鹽培養基作為非生物降解對照，28℃、180r/min培養5d。每組設三個重複。所有操作均在無菌條件下進行。5d後取樣分析培養液中PAEs含量，實驗結果見圖1-2。
結果顯示，在不同濃度PAEs條件下，接種2.5％和10％的綠木黴F7對3種PAEs的降解率大小順序均為DMP＞DBP＞DEHP；在純培養5d內，接種2.5％的綠木黴F7處理下，DMP、DBP和DEHP三種PAEs的混合體系總降解率為53.5％～58.1％，其中DMP的降解率為64.1％～67.9％，DBP的降解率為51.2％～59.1％，DEHP的降解率為48.3％～50.8％。接種10％的綠木黴F7處理下，DMP、DBP和DEHP三種PAEs的混合體系總降解率為60.0％～64.5％，其中DMP的降解率為71.3％～75.1％，DBP的降解率為57.6％～64.9％，DEHP的降解率為51.1％～63.6％。而未接菌的對照組DMP、DBP和DEHP三種PAEs的降解率僅為2.1％～4.4％。上述結果表明綠木黴F7對三種鄰苯二甲酸酯混合物具有較好的降解能力。
實施例2：綠木黴F7發酵液聯合綠豆修復鄰苯二甲酸酯汙染土壤
試驗土壤取自山東青島膠州市膠西鎮農田耕作層，土壤pH 6.58(土水比1：2.5)，有機質23.1g/kg，陽離子交換量13.2cmol/kg，全氮含量為1.25g/kg，速效磷和鉀含量分別為36.4mg/kg、197mg/kg。取得土壤經風乾、碾碎後過2mm(10目)篩。
上述土壤經進一步碾碎過0.3mm篩。取少量經過0.3mm篩的土壤，加入5g/L PAEs儲備液，使3種PAEs濃度均為1000mg/kg(總濃度為3000mg/kg)，待溶劑揮發後與未汙染土混合，製成3種PAEs濃度均為50mg/kg(總濃度為150mg/kg)的人工汙染土壤。
供試綠豆(Phaseolus radiatus L.)種子購自山東農業科學研究院。
供試菌種為綠木黴(Trichoderma virens)菌株F7(保藏編號：CGMCC No.3.17613)。
試驗設置四個處理，處理一：CK，自然降解對照；處理二：接種綠木黴F7發酵液；處理三：種植綠豆；處理四，種植綠豆+接種綠木黴F7發酵液。每處理做四次重複。將實驗土壤裝入陶瓷盆中，每盆4kg土。在接種菌液和種植綠豆前採集土壤樣品，測定PAEs含量，見表1。
綠木黴F7發酵液的製備：將活化的綠木黴F7菌塊接種到含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)斜面的克氏瓶中，28℃黑暗條件下恆溫培養5d後，用無菌水衝洗下分生孢子，將孢子液稀釋到5×105個孢子/mL，作為發酵接種的種子液。取5mL孢子懸浮液接種於500mL的PDA液體培養基中，28℃，180r/min的恆溫震蕩培養箱中培養5d，即為綠木黴F7發酵液。
選取飽滿的綠豆種子，用1％次氯酸鈉溶液浸泡種子10min，取出用去離子水清洗種子5次後，栽入育苗基質中進行育苗，出苗1周後移入裝有汙染土壤的陶瓷盆(盆內徑為36cm)中，每盆5株，待苗移栽成活後進行一次間苗，每盆保留3株，相當於29.5株/m2土地。
在綠豆出苗後10d，在植株根際施加100ml綠木黴F7發酵液。在修復過程中，保持土壤含水量為最大田間持水量的65％左右。在培養20d和30d時，分別向植物根際追加一次綠木黴F7發酵液，用量均為100ml，也即幹土重的2.5％(體積質量比)，相當於9.83×1010(單次)/2.95×1011(三次)孢子數/m2土地。
試驗共進行75d，常規田間管理。收穫時，採集土壤樣品，測定試驗終止時土壤的PAEs。結果見表1和圖3。
從試驗結果看，3種PAEs發生了自然降解作用，DMP、DBP和DEHP的降解率分別為64.2％，45.8％和41.7％，總PAEs降解率為50.8％。接種綠木黴F7和種植綠豆後PAEs的降解均有所提高，其中接種綠木黴F7處理下DMP、DBP和DEHP的降解率分別為69.7％，63.3％和58.2％，總PAEs降解率為64.0％；種植綠豆DMP、DBP和DEHP的降解率分別為74.8％，68.5％和64.7％，總PAEs降解率為69.5％。綠木黴F7聯合綠豆顯著提高了PAEs的降解，DMP、DBP和DEHP的降解率分別為88.3％，83.9％和82.0％，總PAEs降解率為84.9％。
本實例說明，綠木黴F7有效提高了土壤介質中的DBP、BMP和DEHP的生物修復效率，綠木黴F7聯合綠豆處理汙染土壤，提高了鄰苯二甲酸酯汙染土壤的降解速率，綠木黴F7與綠豆之間存在協同促進修復效果的現象。
表1實施例2不同試驗處理條件下PAEs的降解率(mg/kg DW)
實施例3綠木黴F7固體製劑聯合綠豆修復鄰苯二甲酸酯汙染土壤
所用土壤來源、性質和基本類型、添加PAEs汙染物的方式、綠豆種子同實施例2。實驗所用人工汙染土壤3種PAEs濃度均為100mg/kg(總濃度為300mg/kg)。
綠木黴F7固體製劑的製備：將活化的綠木黴F7菌塊接種到含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)斜面的克氏瓶中，28℃黑暗條件下恆溫培養5d後，用無菌水衝洗下分生孢子，將孢子液稀釋到1×105個孢子/mL，作為發酵接種的種子液。以麥麩為綠木黴F7繁殖的載體即培養基，將麥麩洗淨烘乾粉碎後，調節其含水量為50wt％，分裝至培養皿中，121℃滅菌30min。無菌條件下，吸取木黴孢子種子液加入到麥麩培養基中，28℃培養4d。待長出少量白色菌絲時，無菌條件下用玻璃棒將菌絲和培養基充分混勻，使綠木黴F7布滿整個培養基。隔2d後重複上述操作，直至整個麥麩培養基都長滿綠色的綠木黴F7孢子，混勻計數孢子量為4.5×109個孢子/g，得到綠木黴F7固體製劑。
試驗設置四個處理，處理一：CK，自然降解對照；處理二：施加綠木黴F7固體製劑；處理三：種植綠豆；處理四，種植綠豆+施加綠木黴F7固體製劑。每處理做四次重複。每盆裝5.0kg土，對於處理二和處理四按土壤重量的5％將固體製劑(0.25kg)拌入土壤中，相當於8.96×1012個孢子數/m2土地，表層覆土平衡7d後播種。
選取飽滿的綠豆種子，用1％次氯酸鈉溶液浸泡種子10min，取出用去離子水清洗種子7次後，在盆裡的汙染土壤中事先挖好深度一致的穴，均勻播種6顆種子。然後將土覆蓋在種子上，噴灑去離子水。待綠豆長出2片真葉時，間苗。保證每盆3棵綠豆，盆內徑為40cm，相當於23.9株/m2土地。在修復過程中，保持土壤含水量為最大田間持水量的75％左右。
試驗共進行75d，常規田間管理。收穫時，採集土壤樣品，測定試驗終止時土壤的PAEs。結果見表2和圖4。
從試驗結果看，3種PAEs發生了自然降解作用，DMP、DBP和DEHP的降解率分別為64.4％，48.8％和45.1％，總PAEs降解率為52.3％。施加綠木黴F7固體製劑和種植綠豆後PAEs的降解均有所提高，其中施加綠木黴F7固體製劑處理下DMP、DBP和DEHP的降解率分別為69.8％，63.9％和60.6％，總PAEs降解率為64.6％，種植綠豆DMP、DBP和DEHP的降解率分別為74.6％，68.9％和66.7％，總PAEs降解率為69.9％。綠木黴F7固體製劑聯合綠豆顯著提高了PAEs的降解，DMP、DBP和DEHP的降解率分別為85.0％，84.2％和83.1％，總PAEs降解率為85.1％。
本實例說明，綠木黴F7有效提高了土壤介質中的DBP、BMP和DEHP的生物修復效率，綠木黴F7固體製劑聯合綠豆處理汙染土壤，提高了鄰苯二甲酸酯汙染土壤的降解速率，綠木黴F7與綠豆之間存在協同促進修復效果的現象。
表2實施例3不同試驗處理條件下PAEs的降解率(mg/kg DW)