兒童哮喘基因位點檢測試劑盒的製作方法

2023-05-01 16:19:46

專利名稱：兒童哮喘基因位點檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及分子生物學和醫學領域，具體涉及檢測兒童哮喘基因位點是否發生突變的試劑盒，通過同時檢測與兒童哮喘關聯的基因0RMDL3和C5的單核苷酸多態性位點基因型來評估兒童罹患哮喘風險性。
背景技術：
兒童哮喘是兒童最常見的慢性支氣管疾病，以反覆發作的呼吸困難、伴有喘鳴音出現為主要症狀，多在冬、春季發病，初次發病年齡多在學齡前。哮喘反覆發作，對兒童健康、學習和生活影響很大，且部分兒童哮喘可遷延至承認哮喘，成為終生疾患，如診治不及吋，隨病程延長可產生氣道不可逆性狹窄和氣道重塑，因此，對哮喘的合理防治至關重要。據證實，兒童患哮喘有家族性說明該病和遺傳因素有夫，因此遺傳體質不同的人， 應該採取不同的疾病風險控制策略才能更好的預防哮喘的發生；有效區分喘息性疾病患兒的病因(哮喘性和非哮喘性)，進行有效早期幹預治療，將提高治療的針對性，避免過度化治療。利用現代科學研究成果，開發ー項基於分子遺傳基礎的兒童哮喘遺傳輔助診斷與評估預測產品會對兒童哮喘的發生起到預警、個性化防治的作用。隨著「後基因組時代」的到來，尋找基因與疾病之間的關係已成為新的研究熱點。由於哮喘的複雜性，發現並鑑定其關聯基因一直較為艱難。而以基因單核苷酸多態性(SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms)分型分析為基礎的全基因組關聯分析(GWAS,Genome-Wide Association Study)則為我們提供了新的研究手段。根據研究發現染色體17q21內0RMDL3基因SNPs位點和在炎症反應中起重要作用的編碼補體成分5 (C5)與兒童哮喘易感性顯著關聯，同時發現該標記與0RMDL3基因的轉錄水平亦關聯。0RMDL3基因是迄今為止發現的與哮喘關聯最有充分證據的基因。0RMDL3基因屬於新的基因家族(0RMDL1 0RMDL2和0RMDL3)的一個成員，基因位於染色體17q21 - q21
I。有3個外顯子，2個內含子，141飛02位為編碼序列，編碼ー個由153個胺基酸組成的位於內質網膜的跨膜蛋白，序列保守性很強。人類0RMDL3基因的表達模式是由通過RT-PCR和Northern印跡分析得到的。通過對16名成人和胎兒組織樣本進行RT-PCR表達分析，發現0RMDL3基因家族的3個基因在人體組織中均表達。其中在成人胰腺、肝臟中表達水平較高，在肺和胎盤中表達水平較低；在胎兒的肺、肝臟、腎臟、脾臟和胸腺中表達水平較高，在大腦、心臟和骨骼肌中表達水平較低。Moffatt等分析了有哮喘史的家庭組及對照組，在994例兒童哮喘患者和1243個對照中定義了超過31. 7萬個SNP位點。而染色體17q21上存在多個強烈的、重複性的與兒童哮喘發病相關的標記SNPs，在2320例德國兒童中(P=0. 0003)和3301例英國兒童中(P=0. 0005)各自獨立進行的重複研究中，同樣發現染色體17q21表現出與兒童哮喘相關的SNPrs7216389始終並且強烈地(P〈10_22)與0RMDL3基因的轉錄水平相關。結果表面遺傳變異所調控的0RMDL3基因的表達水平是兒童哮喘易感性的因素之一。由於哮喘發病的複雜性，相關基因的發現與鑑定一直較為艱難。可採用高通量測序來進行定點候選基因的克隆，基因單核苷酸多態性(SNP)分型分析和連鎖不平衡(LD)基因定位可對候選基因進行更深入的分析，並且有可能確定其是否為哮喘相關基因。在2005年底發現的118個哮喘基因中，C5基因已被證實與兒童哮喘密切相關，主要表現在炎症 反應中。引起兒童哮喘的其中ー個重要原因是氣道炎症氣道慢性炎症。不管哪ー種類型的哮喘，哪一期的哮喘，都表現為以肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞為主的多種炎症細胞在氣道的浸潤和聚集。這些細胞互相作用可以分泌出數十種炎症介質和細胞因子。這些介質、細胞因子與炎症細胞互相作用，構成複雜的網絡，相互作用和影響，使氣道炎症持續存在。當機體遇到誘發因素時，這些炎症細胞能夠釋放多種炎症介質和細胞因子，引起氣道平滑肌收縮，黏液分泌増加，血漿滲出和黏膜水腫。已知多種細胞，包括肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、上皮細胞、巨噬細胞和內皮細胞都可產生炎症介質。主要的介質有組胺、前列腺素(PG)、白三烯(LT)、血小板活化因子(PAF)、嗜酸性粒細胞趨化因子(ECF-A)、嗜中性粒細胞趨化因子(NCF- A)、主要鹼基蛋白(MBP)、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)、內皮素-1 (ET-I)、黏附因子(abhesion molecules, AMs)等。經研究表明，C5基因(編碼補體成分5)在發生病變後，就能引起上述炎症細胞、炎症介質和細胞因子互相參與，相互作用形成惡性循環，引發氣道炎症，最終罹患哮喘。C5是形成膜攻擊複合體(MAC)的第I個補體分子。人的C5基因定位於第9號染色體長臂32-34區，是由以ニ硫鍵相連接的α、β鏈組成，分子量190kDa，其中α鏈為115kDa，β鏈為75kDa。C5與C3和C4的結構相類似，但沒有鏈內硫酯鍵。靠近N端的第74-75位精氨酸ー亮氨酸鍵為C5轉化酶作用的部位。在C5轉化酶的作用下，C5 α鏈N末端裂解出ー個分子量為IlkDa的小片段C5a進入液相中，其餘部分為IlOkDa的大片段C5b，仍結合在細胞膜表面。親生的C5b在極短時間內能保持與C6結合的構象，可與C6非共價結合形成一牢固的C5b6複合物,並通過與C3b的可逆性結合而固定的細胞膜上。但C5b生成後其潛在的生物學活性存在時間非常短促，若無C6結合則迅速衰變為C5bi。 C5b只形成MAC參與細胞溶解效應，而C5a卻具有廣泛的生物學活性。概括起來有以下幾方面(I)過敏毒素作用C5a是具有過敏毒素作用的補體裂解片段中作用最強的介質，較C3a強20倍，較C4a強2500倍。此外，C5a還可不依賴於肥大細胞釋放組胺，即通過直接作用於血管內皮細胞而増加血管的通透性。(2)趨化作用高濃度的C5a是中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞的趨化劑，可刺激這些細胞沿著濃度定向移動。值得注意的是，被血清羧肽酶N切C5aC端精氨酸殘基而形成的去精C5a雖喪失了使肥大細胞分泌組胺的能力，但仍具有較強的趨化活性，是補體活化後產生趨化作用的主要因素。(3)促代謝作用高濃度的C5a可刺激中性粒細胞和單核細胞的氧化代謝，提高其cGMP的水平，有利於促進溶酶體與細胞膜的融合，釋放溶酶體酶。此外，C5a還可刺激中性粒細胞粘附及增強其產生超氧化物。(4)免疫調節作用近年體外研究表明，C5a對免疫應答有明顯增強作用，如可誘導單核細胞分泌IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等細胞因子，促進抗原及同種異體抗原誘導的T細胞増殖及B細胞產生抗體等。C5a的上述生物學活性的利於增強機體的防禦機能，但由其導致的炎症反應也可造成對機體的損傷。
發明內容[0010]本實用新型針對目的是提供ー種採用螢光定量PCR技術同時檢測兩個兒童哮喘基因SNP位點的試劑盒。該試劑盒由包裝盒體、襯墊、裝有檢測兩個SNP位點的螢光定量PCR反應液的兩個試管、裝有陽性對照品的ー個試管、裝有陰性對照品的ー個試管組成，襯墊上設有容器孔，分別放置兩管螢光定量PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品。其中螢光定量PCR反應液的成分包含PCR緩衝液、MgCl2、dNTPs、SNP位點檢測用上遊引物、SNP位點檢測用下遊引物、SNP位點基因型ー螢光探針、SNP位點基因型ニ螢光探針、Taq DNA聚合酶。其中，0RMDL3上的SNP位點檢測引物和探針為上遊引物序列5』- AGGCAACCCTGGAAA -3』下遊引物序列5』- TGATCAATCAGGGCC -3』基因型ー螢光探針序列5』-FAM - CAAACAcGCATGGA - TAMRA -3』基因型ニ螢光探針序列5』-VIC- CAAACAtGCATGGA -TAMRA -3』C5上的SNP位點檢測引物和探針為上遊引物序列5』- CTGCTGTCTGTTCTCCT -3』下遊引物序列5』- CTTCATCCCGACTTCTG -3』基因型ー螢光探針序列5』-FAM - GACGATaTAATAGA - TAMRA -3』基因型ニ螢光探針序列5』-VIC - GACGATgTAATAGA -TAMRA _3，對照品分為陽性對照品和陰性對照品，陰性對照品為無菌雙蒸水樣品，陽性對照品為ロ腔黏膜細胞DNA樣品。 本試劑盒保存於_20°C，儘量減少反覆凍融。本實用新型試劑盒使用方法毎次檢測均應設立陽性對照和陰性對照。擴增檢測在螢光定量PCR儀上進行，分為6個反應管，每ー個SNP位點檢測使用3個反應管，其中I個反應管為被檢測樣品，陽性對照和陰性對照各使用I個反應管，每管中總體積10μ 1，其中8μ I PCR反應液，2 μ I檢測樣品(基因組DNA、陽性對照或陰性對照)。反應條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進行60個循環的95°C、30秒，60°C、I分鐘。反應完成後在螢光定量PCR儀上進行終點螢光讀取，根據得到的ニ維螢光圖和實時擴增曲線讀取被檢測樣品的SNP位點基因型。本實用新型提供的該試劑盒主要用於檢測兒童哮喘基因SNP位點，從而告知被檢者患病風險數值，提前預防和控制，指導醫師選擇正確的臨床治療方案，有利於患者進行針對性治療。本實用新型的特點是該試劑盒運用螢光定量PCR技術實現了同時檢測兩個兒童哮喘基因SNP位點基因型的目的，相對於現有的螢光定量PCR試劑盒只檢測ー個SNP位點，本實用新型試劑盒將同一疾病的所有SNP位點檢測整合在ー個試劑盒內，使用更方便而且成本更低，對罹患兒童哮喘風險性的評估也更便捷。

圖I為本實用新型的結構示意圖。
具體實施方式
本實用新型結合附圖和具體實施例作進ー步說明。應該理解，這些實施例僅用於說明目的，而不用於限制本實用新型範圍。實施例I參見圖1，本實用新型試劑盒由包裝盒體I、襯墊2、裝有檢測兩個SNP位點的螢光定量PCR反應液的兩個試管3、裝有陽性對照品的一個試管4、裝有陰性對照品的一個試管5組成，襯墊上設有容器孔、分別放置兩管螢光定量PCR反應液3、陽性對照品4和陰性對照品5。其中螢光定量PCR反應液的成分包含PCR緩衝液、MgCl2、dNTPs、SNP位點檢測用 上遊引物、SNP位點檢測用下遊引物、SNP位點基因型ー螢光探針、SNP位點基因型ニ螢光探針、Taq DNA聚合酶。本試劑盒保存於_20°C，儘量減少反覆凍融。實施例2I.材料血樣總DNA提取試劑盒購於美國Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相關試劑購於美國Promega公司，7900型螢光定量PCR儀為美國ABI公司產品。2.引物及探針0RMDL3上的SNP位點檢測引物和探針為上遊引物序列5』- AGGCAACCCTGGAAA -3』下遊引物序列5』- TGATCAATCAGGGCC _3』基因型ー螢光探針序列5』-FAM - CAAACAcGCATGGA - TAMRA -3』基因型ニ螢光探針序列5』-VIC- CAAACAtGCATGGA -TAMRA -3』C5上的SNP位點檢測引物和探針為上遊引物序列5』- CTGCTGTCTGTTCTCCT -3』下遊引物序列5』- CTTCATCCCGACTTCTG -3』基因型ー螢光探針序列5』-FAM - GACGATaTAATAGA - TAMRA -3』基因型ニ螢光探針序列5』-VIC - GACGATgTAATAGA -TAMRA -3』3.樣本檢測選取30例血液樣本，其中已確定患兒童哮喘的為18例。樣本用血樣總DNA提取試劑盒提取總DNA。每一例檢測為12個反應管，每管中總體積10μ 1，其中8μ I PCR反應液，姆ー個SNP位點檢測使用3個反應管，I個反應管中加入2 μ I被檢測DNA,另外2個反應管中加入2 μ I陽性對照和陰性對照，在ΑΒΙ7900螢光定量PCR儀上進行擴增。反應條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進行60個循環的95で、30秒，60°C、I分鐘。反應完成後在螢光定量PCR儀上進行終點螢光讀取。
權利要求1.ー種兒童哮喘基因位點檢測試劑盒，其特徵是由包裝盒體(I)、襯墊(2)、裝有檢測兩個SNP位點的螢光定量PCR反應液的兩個試管(3)、裝有陽性對照品的一個試管(4)、裝有陰性對照品的一個試管(5)組成，襯墊(2)上設有容器孔，分別放置兩管螢光定量PCR反應液(3 )、陽性對照品(4 )和陰性對照品(5 )。
專利摘要本實用新型提供了一種檢測兒童哮喘基因位點是否發生突變從而評估兒童罹患哮喘風險性的試劑盒，由包裝盒體1、襯墊2、裝有檢測兩個SNP位點的螢光定量PCR反應液的兩個試管3、裝有陽性對照品的一個試管4、裝有陰性對照品的一個試管5組成，襯墊上設有容器孔，分別放置兩管螢光定量PCR反應液3、陽性對照品4和陰性對照品5。本實用新型試劑盒運用螢光定量PCR技術實現了同時檢測兩個兒童哮喘基因SNP位點基因型的目的，相對於現有的螢光定量PCR試劑盒只檢測一個SNP位點，本實用新型試劑盒將與同一疾病的兩個SNP位點檢測整合在一個試劑盒內，使用更方便而且成本更低，對兒童罹患哮喘風險性的評估也更便捷。
文檔編號C12Q1/68GK202401075SQ201220000408

公開日2012年8月29日 申請日期2012年1月4日 優先權日2012年1月4日
發明者任峻, 張華忠 申請人:浙江愛易生物醫學科技有限公司