IκB激酶ε抑制劑（SIKE）在治療心肌肥厚中的功能及應用的製作方法
2023-05-02 12:27:21
IκB激酶ε抑制劑（SIKE）在治療心肌肥厚中的功能及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種IκB激酶ε的抑制劑SIKE在心肌肥厚中的功能和應用，屬於基因的功能與應用領域。本發明確定了SIKE的表達與心肌肥厚之間的相互關係，以心臟特異性SIKE轉基因小鼠和非轉基因為實驗對象，通過主動脈弓縮窄手術，模擬心肌肥厚疾病模型，結果表明SIKE基因過表達顯著抑制了心肌肥厚及其纖維化，改善心功能。因此，SIKE基因可作為藥物靶標，用於在篩選保護心臟功能和/或預防、緩解和/治療心肌肥厚的藥物；SIKE基因可作為基因治療中的靶基因，用於在設計和製備在保護心臟功能和/或預防、緩解和/治療心肌肥厚的藥物和/或生物學試劑，為心肌肥厚的治療提供了一條有效的新途徑。
【專利說明】[0001] I κ B激酶ε抑制劑（SIKE)在治療心肌肥厚中的功能及應用
【技術領域】
[0002] 本發明屬於基因的功能與應用領域，特別涉及一種I κ B激酶ε抑制劑（SIKE)在 治療心肌肥厚中的功能和應用，具體是在製備預防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物中的 應用。
【背景技術】
[0003] 據世界衛生組織報告，心血管疾病已成為威脅人類生命健康的全球性慢性非傳染 性疾病之一。多種心血管疾病包括高血壓、動脈粥樣硬化、心臟瓣膜病、心肌病等都會進展 為心力衰竭，是大多數病患住院和死亡的首要原因。心肌肥厚是心臟對機械負荷及神經體 液因子改變的代償反應，臨床研究表明，心肌肥厚不僅是心力衰竭前的一種適應性反應，而 且是缺血，心律失常、猝死等心血管疾病的獨立危險因子。心肌肥厚包括"生理性"肥厚和 "病理性"肥厚，通常將發生在鍛鍊後的正常個體且不伴有心肌損傷的肥厚稱為"生理性"月巴 厚；在"病理性"肥厚時，儘管增大的心臟體積最初是代償性機制，持續的肥厚卻最終會導致 左室功能的下降、顯著升高個體心衰、心律失常和猝死的風險。心血管疾病發病率和病死率 在全世界範圍內持續升高，儘管在治療方法上有了進步，但是目前依然沒有有效方法減少 心血管事件的發生。因此尋找抑制心肌肥厚的特異性分子，對於進一步闡述心肌肥厚的發 生發展機制，具有重大的理論意義，可為臨床防治心肌肥厚提供新靶點和新策略。
[0004] SIKE (suppressor of IKK ε 1)是 IKK ε (inhibitor of kappa B kinase 印silon，lKB激酶ε)抑制劑。IkB激酶家族（lKBkinases，IKKs)是NF-κΒ信號途徑 最為重要的成員之一，其在先天性免疫以及炎症反應的調節中發揮關鍵作用。目前已發現 IKKs家族除IKK α / β / Y複合物之外，還存在另外一種I K B激酶複合物IKK ε。作為IKKs 家族的最新成員，ΙΚΚε和ΙΚΚα/β/Υ之間有非常高的同源性，他們在N末端都含有一個 特殊的激酶功能結構物，在C端則是一個螺旋-螺旋膜體(motif)。IKK ε可高表達於胸腺、 脾、外周血細胞及富含活化Τ細胞的細胞群中【1】。
[0005] 心肌肥厚發生的機制十分複雜，研究證實NF-κ Β的激活是心肌細胞肥大所必需 的，研究表明NF-κ Β信號通路在心肌肥厚的發生發展中起著重要作用【2,3】。ΙΚΚε被證明 有助於脂多糖和病毒誘導的IRF3 (幹擾素調節因子3)和IRF7的磷酸化過程，由此引起它 的同型二聚、核轉運和I型幹擾素基因（INF-α和INF-β )的激活【4】。SIKE是ΙΚΚε的抑 製劑，可抑制由病毒和TLR3觸發引起的IRF3活性【5,6】;而IRF3可通過下調ERK1/2的激 活，來抑制心肌肥厚【7】。因此，SIKE可能在心肌肥厚中起到重要作用，為心肌肥厚引起的 心臟疾病的治療研究提供新的思路。
[0006] 【參考文獻】 1、Peters RT， Liao SM， Maniatis T. IKKepsiIon is part of a novel PMA-inducible IkappaB kinase complex. Mol Cell 2000; 5: 513-522 2、 Freund C， Schmidt-Ullrich R， Baurand A， et al. Requirement of nuclear factor-NF-κ B in angiotensin II and isoproterenol-induced cardiac hypertrophy in vivo. Circulation, 2005, 111 (18):2319-2325. 3、 Young D，Popovic ZB, Jones WK, et al. Blockade of NF-kappa B using I kappa B alpha dominant-negative mice ameliorates cardiac hypertrophy in myotrophin-overexpressed transgenic mice. J Mol Biol, 2008，381 (3):559-568. 4、 Hemmi H， Takeuchi 0， Sato S， et al. K. The roles of two IkappaB kinase-related kinases in lipopolysaccharide 554 and double stranded RNA signaling and viral infection. J Exp Med, 2004,199: 1641-1650. 5、 Huang J，Liu T，Xu LG, Chen D，et al. SIKE is an IKK epsilon/ TBK1-associated suppressor of TLR3- and virus-triggered IRF-3 activation pathways. ΕΜΒ0 J. 2005, ; 24 (23) : 4018-28. 6、 Marion JD， Roberts CF， Call RJ， et al. Mechanism of endogenous regulation of the type I interferon response by suppressor of I κ B kinase epsilon (SIKE), a novel substrate of TANK-binding kinase 1 (TBK1). J Biol Chem. 2013:288(25) :18612-23. 7、 Lu J， Bian ZY， Zhang R， Zhang Y， et al. Interferon regulatory factor 3 is a negative regulator of pathological cardiac hypertrophy. Basic Res Cardiol. 2013;108(2) :326
【發明內容】
[0007] 為解決上述現有技術的缺陷和不足，本發明的首要目的在於確定SIKE的表達和 心肌肥厚的相互關係，提供一種SIKE作為藥物靶標在篩選保護心臟功能和/或預防、緩解 和/治療心肌肥厚的藥物中的應用，提供一個用於保護心臟功能和/或預防、緩解和/或治 療心肌肥厚的靶基因 SIKE的新用途。
[0008] 本發明的目的通過下述技術方案實現： 本發明通過試驗確定SIKE表達與心肌肥厚之間的關係：SIKE基因過表達顯著抑制了 心肌肥厚及其纖維化，改善心功能。
[0009] 本發明選用心臟特異性SIKE轉基因小鼠和非轉基因小鼠進行試驗，並將每種小 鼠分成假手術組和手術組，每組10隻小鼠。手術組給予主動脈弓縮窄手術，假手術組不予 主動脈弓縮窄，然後通過對假手術組和手術組的各組小鼠進行心臟心肌肥厚、纖維化及心 功能的測定，研究SIKE基因過表達對主動脈弓縮窄誘導的心肌肥厚的影響。結果表明過表 達SIKE基因顯著抑制心肌肥厚及纖維化，保護心功能。
[0010] 由以上結果可知SIKE基因過表達顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，保護心功能。因 此SIKE基因具有保護心功能和抑制心肌肥厚及纖維化的作用，特別是SIKE基因能夠抑制 主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關疾病發生的作用。
[0011] 針對SIKE的上述功能，提供一種SIKE的應用，主要體現為SIKE在保護心臟和制 備治療心肌肥厚中的應用，特別是SIKE在製備保護心臟功能和/或預防、緩解和/或治療 心肌肥厚的藥物中應用。
[0012] 一種保護心臟功能的藥物，包含SIKE。
[0013] 一種預防、緩解和/治療心肌肥厚的藥物，包含SIKE。
[0014] 本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果： (1)本發明發現SIKE的新功能，即SIKE具有能夠保護心臟功能和抑制心肌肥厚的作 用。
[0015] (2)基於SIKE在保護心臟功能和抑制心肌肥厚中的作用，其可以用於製備保護心 髒功能和/或預防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1是NTG和TG小鼠 AB模型8周後心身比（HW/BW)、肺身比（LW/BW)及心脛比（HW/ TL)的統計柱狀圖，結果顯示SIKE過表達會抑制HW/BW、LW/BW及HW/TL (* :p < 0. 05vs NTG Sham 組，# :p < 0· 05vs NTG AB 組）。
[0017] 圖2是NTG和TG小鼠 AB模型8周後心臟組織HE染色及心肌細胞橫截面積統計 柱狀圖，結果顯示SIKE過表達會抑制心肌細胞肥大（*:p < 0. 05vs NTG Sham組，#:p < 0·05vs NTG AB 組）。
[0018] 圖3是NTG和TG小鼠 AB模型8周後心臟組織天狼星紅染色圖，結果顯示SIKE過 表達會抑制心臟的纖維化。
[0019] 圖4是NTG和TG小鼠 AB模型8周後超聲檢測心功能結果統計柱狀圖，結果顯示 SIKE過表達顯著保護心功能；其中，LVEDD為左室舒張末期內徑、LVESD為左室收縮末期內 徑、EF為射血分數、FS為短軸縮短率（*:p < 0.05vs NTG Sham組，#:p < 0.05vs NTG AB 組）。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 於此。
[0021] 實驗用動物及飼養 實驗動物：選用8-10周齡、體重在23. 5-27. 5g，雄性，心臟特異性SIKE轉基因小鼠 (TG，心臟特異性SIKE轉基因小鼠由武漢大學心血管病研究所李紅良教授實驗室構建)及非 轉基因小鼠（NTG，同齡同窩對照非轉基因小鼠）為實驗對象。
[0022] 心臟特異性SIKE轉基因小鼠的構建： 用引物（上遊引物：GTTGTCGACGCCACCATGAGCTGCACGATCGAGAA ;下遊引物： GCCAAGCTTACTTGATGGTCTGAGAGG)擴增小鼠 SIKE 全長基因（NCBI, Gene ID: 66641， NM_025679. 3)，把擴增的SIKE全長基因連接於心肌肌球蛋白重鏈（a -MHC)啟動子下遊，將 構建的序列通過顯微注射構造成受精胚胎（C57BL/6J背景），得到心臟特異性SIKE轉基因 老鼠。（上述的轉基因小鼠參照下述文獻製備：Jiang DS, Bian ZY, Zhang Y, Zhang SM, Liu Y, Zhang R et al. Role of interferon regulatory factor 4 in the regulation of pathological cardiac hypertrophy. Hypertension 2013; 61:1193-1202.) 飼養環境：所有實驗小鼠均飼養在武漢大學心血管病研究所SPF級實驗動物中心。SRF 級大小鼠飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。飼養條件：室溫在22-24°C之間，溼度在 40-70%之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水攝食。
[0023] 【實施例1】心肌肥厚（AB)模型獲得 1. 實驗動物分組：心臟特異性SIKE轉基因小鼠（TG)和非轉基因小鼠（NTG)，通過主動 脈縮窄術建立心肌肥厚模型。隨機分為4組，分組如下：非轉基因小鼠假手術組（NTG Sham) 及AB術組（NTG AB)、心臟特異性SIKE轉基因小鼠假手術組（TG Sham)及AB術組（TG AB)。
[0024] 2.心肌肥厚模型採用主動脈弓縮窄手術，模型操作流程： 2. 1術前準備 (1)麻醉：先給小鼠稱重，按照90mg/kg體重計算所需麻藥（3%戊巴比妥鈉）量，通過腹 腔注射，並記錄注射時間點。夾尾、夾趾無明顯反應且小鼠狀態良好為麻醉成功標準(一般 注射後約lOmin無明顯反應，以麻醉後約50min小鼠夾趾有反應，麻醉後30min左右為最佳 手術時間）。
[0025] (2)術區準備：將小鼠左胸部、左側胸部及左前肢腋下的皮膚去毛。剃毛後用溼紗 布擦拭術區去除鼠毛，以不影響手術視野為宜。
[0026] (3)氣管插管：用橡皮筋將小鼠上門齒固定於V形板斜面上，並迅速將氣管插管經 聲門準確插入氣管內，隨後右側臥位置於加熱墊上(加熱墊需提前預熱)，然後將氣管插管 與呼吸機連接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏與呼吸機頻率一致，說明氣管插管成功。
[0027] 2.2主動脈弓降支結紮術 取右側臥位，小鼠左前肢置於右前肢上方，並用醫用膠帶將兩前肢固定。右胸部下方墊 入棉籤，抬高胸廓，依次用碘酒及體積分數為75%酒精對手術區域皮膚消毒。左手持眼科鑷 將左胸部皮膚捏起，右手持眼科剪剪開皮膚約lcm，依次分離肌肉及軟組織，於第2-3肋水 平打開胸腔，用棉籤稍撥開左肺，游離主動脈弓降支，將7-0手術縫線穿過血管，並在血管 上方平行放置一段26G (25. 0-27. 5g小鼠）或者27G (23. 5-25. Og)注射器針頭，將血管及 針頭一起結紮好，再抽出針頭即可達到相應程度的血管縮窄。結紮完畢後依次縫合，關閉胸 腔，用注射器從縫口處插入胸腔並抽出lcc氣體以恢復胸腔內負壓，拔出注射器後迅速縫 合皮膚切口。假手術組（Sham)在游離出主動脈降支後只穿線不結紮，其餘步驟同心肌肥厚 (AB)模型組。
[0028] 2.3術後護理 主動脈弓降支結紮術後，待小鼠出現自主呼吸、夾趾出現強烈反應，拔出氣管插管，並 將小鼠放入裝有高壓滅菌過的墊料、飼料和飲用水的飼養籠內，於飼養室繼續飼養觀察。非 轉基因小鼠及心臟特異性SIKE轉基因小鼠術後8周分別進行各項指標的檢測。
[0029] 【實施例2】小鼠心肌肥厚（AB)模型心肌肥厚及纖維化檢測 1.取材 (1)前期工作：預先準備裝有20mL的體積分數10%甲醛的尿杯，並貼好標籤(小鼠編號、 組別、手術類型及取材日期)。將倒滿質量分數10% KC1溶液的培養皿置於取材處。打開分 析天平，調零備用。再稱重處死小鼠。
[0030] (2)取材：眼科彎鑷夾住心耳下方的血管蒂，剪下心臟，迅速置於質量分數10% KC1 溶液中。待心臟停跳在舒張期後，置於滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內液體，蘸幹表面液體後， 稱重並記錄，將心臟放入相應的尿杯中，固定48h後用於病理學檢測。
[0031] (3)相關測量及計算：取出小鼠肺臟，修剪後濾紙吸乾，稱重並記錄。剪開小鼠後 肢脛骨處皮膚，測量並記錄脛骨長度。計算心重與體重的比值（HW/BW)，肺重與體重的比值 (LW/BW)以及心重與脛骨長度的比值（HW/TL)。
[0032] 2.病理學檢測 2. 1製備石錯標本切片 由實驗室專業病理工作人員製備石蠟標本切片，主要操作程序包括修剪心臟一包埋框 處理一流水衝洗一脫水一透明一浸蠟一包埋一切片一攤片一晾乾或烘烤後備用。
[0033] 2.2蘇木精-伊紅（HE)染色 主要步驟為：55 °C烘烤30min -二甲苯5min，3次一100%酒精lmin - 95%酒精 lmin - 70%酒精lmin -雙蒸水lmin -蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021) 5min -水 洗lmin - 1%鹽酸酒精(取3mL濃鹽酸與297mL 70%酒精充分混合均勻）l-3s -水洗 lmin - Scott液(碳酸氫鈉0. 35g，七水硫酸鎂2g，兩者溶於100mL蒸饋水）lmin -水洗 lmin -伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024) 3_5min -蒸饋水洗去浮色一70%酒精Is - 95%酒 精Is - 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未乾立即封片一通風櫥內吹乾， 顯微鏡拍照。
[0034] HE染色圖片統計：每張圖片選擇3個以上邊界清楚，核大致位於中央的細胞，用 Image-Pro Plus 6. 0軟體圈細胞面積。
[0035] 2. 3天狼星紅（PSR)染色 主要步驟為：55 °C烘烤30min -二甲苯2min，3次一100%酒精lmin - 95%酒 精lmin - 70%酒精lmin -流水衝洗lOmin -雙蒸水lmin -質量分數0. 2%磷鑰酸 2min - 0. 1%天狼猩紅苦味酸溶液滴於組織上，溼盒中染色90min -去除殘液一0. 01N鹽 酸4s - 70%酒精1次一90%酒精1次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲 苯未乾立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。
[0036] 心肌組織由心肌細胞和間質組織組成，心臟是一終末分化器官，心肌細胞失去增 殖能力，各種生理或病理性刺激引起的心肌細胞反應，只能是單個細胞的體積增大而不能 在數量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理過程中，主要表現為心肌細胞體積增大，肌節 數量增多，細胞排列紊亂；心臟間質改變包括心肌成纖維細胞的增殖與轉化，膠原纖維密度 增加，膠原分泌增加，膠原比例平衡失調等。
[0037] 圖1、圖2、圖3是NTG和SIKE-TG小鼠 AB模型後的表型結果。結果表明NTG小鼠 AB術後8周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高於其Sham組；AB術後8周TG小鼠的HW/BW、LW/BW 及HW/TL增大的程度明顯小於NTG小鼠（圖1)。心臟表型表明，AB組較Sham組的心臟均增 大，且AB術後TG小鼠心臟增大的程度遠小於NTG小鼠。HE染色切片可觀察到：Sham組心 肌肌原纖維細胞排列整齊、緻密，形態完整，胞核及核仁結構清晰；AB組肌絲排列紊亂、松 散，心肌細胞體積明顯增大，形態不規整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊TG小鼠 AB術後心 肌細胞橫截面積大於Sham組，顯著小於NTG小鼠 AB組（圖2)。PSR染色可見，發現AB組心 室心肌間質膠原含量較Sham組增加，動脈血管周圍膠原增加更為明顯，膠原增粗，排列紊 亂成網絡狀；TG小鼠 AB術後心肌間質膠原含量及血管周圍膠原含量均小於NTG小鼠 AB組 (圖3)。以上結果說明經AB模型後，小鼠發生明顯的心肌肥厚，SIKE過表達可顯著抑制心 髒的心肌細胞肥大和纖維化。
[0038] 【實施例3】心肌肥厚（AB)模型小鼠超聲檢測心功能 1前期準備 (1)麻醉機準備：先連接氧氣瓶和麻醉機上的進氣接口，再擰開麻醉機上加藥口密封 蓋，迅速加入異氟烷至安全刻度後擰緊密封蓋。擰開氧氣瓶上總閥門，調整流量控制閥的旋 鈕，出氣壓力維持在〇· 2-0. 3mPa。
[0039] (2)待測小鼠準備：待檢測小鼠用異氟烷迅速麻醉後，左胸前區剃毛，將處理好的 小鼠頭部伸入麻醉劑導管套頭內，以1. 5-2. 0%異氟烷維持小鼠穩定的麻醉狀態。
[0040] 2心功能檢測 小鼠取左側臥位或仰臥位，並在剃毛區均勻塗抹超聲耦合劑(天津成信公司）。採用 高頻超聲診斷儀，頻率為15MHz，選取標準左心室乳頭肌短軸切面，測量左室舒張末期內徑 (LVEDD)、左室收縮末期內徑（LVESD)、射血分數（EF)及短軸縮短率（FS)。
[0041] 本實施例運用Μ型超聲心動圖檢測評價心肌肥厚和心功能。圖4是NTG和SIKE-TG 小鼠 ΑΒ模型後的超聲檢測結果。與NTG Sham組相比，NTG小鼠 ΑΒ術後8周表現出心功能 減弱和心肌肥厚。主要表現為心肌肥厚的指標LVEDD、LVESD增大，而反應心功能的指標EF、 FS則下降。AB術後8周，與NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指標LVEDD、LVESD增大的程 度及反應心功能的指標EF、FS下降的程度則小於NTG組。這些結果表明SIKE過表達可以 顯著保護心功能，與TG小鼠心肌肥厚被抑制的結果一致。
[0042] 由以上結果可知，在主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚疾病模型中，SIKE基因過表達 顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，保護心功能。因此SIKE基因具有保護心功能和抑制心肌肥 厚及纖維化的作用，特別是SIKE基因能夠抑制主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關疾病發 生的作用。
[〇〇43] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1. IK B激酶ε的抑制劑SIKE在製備保護心臟功能和/或預防、緩解和/或治療心肌 肥厚的藥物中的應用。
2. -種保護心臟功能和/或預防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物，其特徵在於：包含 ΙκΒ激酶ε的抑制劑SIKE。
3. Ικ Β激酶ε的抑制劑SIKE在篩選保護心臟功能和/或預防、緩解和/或治療心肌 肥厚的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K45/00GK104107430SQ201410377414
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年8月1日 優先權日:2014年8月1日
【發明者】李紅良, 蔣丁勝, 鄧克窮, 張曉東 申請人:武漢大學