低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法

2023-05-02 07:28:21 1

低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法
【專利摘要】本發明公開了一種低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，依次分離FⅠ、FⅡ+Ⅲ、FⅢ、FⅡ，在對FⅡ沉澱超濾、純化時，依次採用超濾脫醇、巴氏滅活、一次沉澱分離、二次沉澱分離、二次沉澱超濾脫醇的工藝。本發明在過濾時將壓濾機的溫度控制在較低範圍內，在沉澱分離工藝採用了適當的電導率，提高了免疫球蛋白的收率，在對免疫球蛋白純化精製時，進行了兩次沉澱分離，兩次沉澱分離均採用了二級澄清除菌過濾，通過四級過濾技術，去除了製品中的不溶性顆粒，提高了製品的澄清度和收率。
【專利說明】低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及以人血漿為原料製備靜注人免疫球蛋白的方法，更具體的說涉及一種採用低溫乙醇法提取靜注人免疫球蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]低溫乙醇法是人血漿蛋白的製備方法之一，該方法是1940年由美國哈佛大學醫學院的EdwinJ.Cohn教授發明的，因此又稱為「孔氏法」。孔氏法最初用來分離牛血清白蛋白，隨後應用於人血漿分離。低溫乙醇法是以混合血漿為原料，逐級降低酸度(從PH7.0降到pH4.0)。提高乙醇濃度(從O升到40%)，同時降低溫度(從2°C降到_2°C)，各種蛋白在不同的條件下以組分(粗製品)的形式分步從溶液中析出，並通過離心或者過濾分離出來。影響蛋白質沉澱反應因素主要有五個，即:PH值、溫度、蛋白質濃度、離子強度和乙醇濃度。由於工藝參數選擇不合理及分離方法不科學，導致了現有的低溫乙醇法生產人免疫球蛋白收率較低且純度低。
[0003]專利號為201110030778.3的發明專利公開了 「一種生產靜注人免疫球蛋白的方法」，該發明的主要工藝如下:以人血漿為原料，首先從血漿中分離出組分I + II +III，再從組分I +11+III沉澱分離組分I +III，再分離組分II，再用層析法純化組分II，之後進行病毒滅活，滅活後配製靜注人免疫球蛋白。該方法的組分分離周期略長、且純度較低，人免疫球蛋白生廣的收率還有待提聞。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，在用人血漿為原料製備靜注人免疫球蛋白時，以提高靜注人免疫球蛋白的收率。
[0005]本發明所述低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，包括以下步驟:
[0006]步驟一、從人血漿中分離F I，得F I上清液；
[0007]步驟二、從F I上清液中分離出F II + III沉澱；
[0008]步驟三、從F II + III沉澱中分離F III沉澱，得FIII上清液；
[0009]步驟四、從F III上清液中分離出F II沉澱；
[0010]步驟五、F II沉澱超濾、純化，包括以下步驟:
[0011]①、超濾脫醇:取重量為上述F II沉澱8~10倍、溫度為2~8°C注射用水將F II沉澱完全溶解，採用二級澄清除菌過濾，調節溶液PH值至4.30~4.70 ;
[0012]②、巴氏滅活:將超濾脫醇後的溶液用注射用水調節蛋白質含量至17~33g/l，按60~120g/l加入甘氨 酸，調節pH值至1.10~7.50，在55~65°C的溫度下加溫9~11小時進行巴氏滅活後，降溫至20~30°C ；
[0013]③、一次沉澱分離:用注射用水調節巴氏滅活後的溶液，使溶液中蛋白質含量為5.0~15.0g/Ι，調節溶液pH值至6.70~7.20，控制溫度至O~2°C，調節乙醇濃度至體積百分比18~20%，控制溫度至2~6°C，調節溶液的電導率為1.20~1.50ms/cm，攪拌反應I~3小時,按每千克蛋白質0.08~0.12kg比例分別添加等量的珍珠巖和娃藻土,繼續反應0.5~1.5小時後,用壓濾機進行加壓過濾,加壓過濾時,選用孔徑不超過0.9 μ m的深層濾板，控制壓濾機溫度至5°C以下，過濾分離出一次沉澱，得一次沉澱上清液；
[0014]④、二次沉澱分離:將一次沉澱上清液溫度控制至-1~_3°C，調節pH值至7.10~7.40，乙醇濃度至體積百分比24~26%，控制溶液溫度至-6~_12°C，調節溶液的電導率為1.50-1.90ms/cm,攪拌反應I~3小時,用壓濾機進行加壓過濾,加壓過濾時,選用孔徑不超過0.9μ m的深層濾板，控制壓濾機溫度至-3°C以下，過濾分離出二次沉澱；
[0015]⑤、二次沉澱超濾脫醇:取重量為上述二次沉澱5~10倍、溫度為2~8°C的注射用水將二次沉澱完全溶解，採用二級澄清除菌過濾，同時調節PH值至3.40~3.80，超濾脫醇後再調節pH值至3.8~4.4。
[0016]步驟六、將步驟五所得二次沉澱溶液按成品規格配製，使蛋白質含量不低於50g/1，加入麥芽糖，使麥芽糖含量為90~110g/l，加入聚山梨酯-80，使聚山梨酯-80含量不大於80 μ g/ml,調節pH值至3.8~4.4,實現製品配製後,進行除菌過濾分裝。
[0017]所述步驟一是將融合後的人血漿的溫度控制在0.0~4.(TC之間，調節蛋白質濃度至40~65g/l，調節溶液的電導率為12.0~14.0ms/cm,調節pH值至6.80~7.30，調節乙醇濃度至體積百分比7.0~10.0%，控制溫度至-1.0~-3.(TC，用壓濾機進行加壓過濾，加壓過濾時選用孔徑不超過0.9 μ m的深層濾板，控制壓濾機溫度至-1°C以下，過濾分離出F I沉澱，得F I上清液。
[0018]所述步驟二是,調節F I上清液pH值至5.70~6.30、乙醇濃度至體積百分比18.0~22.0%，控制溫度至-4.0~-6.(TC，按照每16Kg蛋白質添加0.5~1.5Kg的比例分別添加等量的珍珠巖和硅藻土，用壓濾機進行加壓過濾，加壓過濾時，選用孔徑不超過0.7 μ m的深層濾板，控制壓濾機溫度至-3V以下，過濾分離出F II + III沉澱。
[0019]所述步驟三是，取重量為上述F II + III沉澱8~10倍、溫度為2~8°C的注射用水將F II + III沉澱完全溶解，調節pH值至4.60~5.00，攪拌反應I~2小時後，再將溶液的pH值調節至5.00~5.40，再進行攪拌反應I~2小時，調節溶液電導率為1.20~1.50ms/cm,調節乙醇濃度至體積百分比13~15%,反應I~3小時，按每千克F II + III沉澱添加0.07~0.1kg的比例分別添加等量的珍珠巖和娃藻土,繼續反應0.5~1.5小時,用壓濾機進行加壓過濾，加壓過濾時，選用孔徑不超過0.7 μ m的深層濾板，控制壓濾機溫度至-1°C以下，過濾分離出F III沉澱，取F III上清。
[0020]所述步驟四是，調節FIII上清液電導率為6.50~8.50ms/cm、調節pH值至7.00~7.40、乙醇濃度至體積百分比24~26%、控制溫度至-6.0~-12.(TC，攪拌反應I~3小時，用壓濾機進行加壓過濾，加壓過濾時，選用孔徑不超過0.9 μ m的深層濾板，控制壓濾機溫度至-3°C以下，過濾分離出F II沉澱。
[0021]本發明所述低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，從人血漿中依次分離F 1、F II +IILFIILF II，使得提取組分沉澱精益細化，縮短了組分的分離周期，利於人血漿的綜合利用。通過控制壓濾機的溫度避免了製品壓濾過程升溫而導致蛋白變性，同時在沉澱分離工藝採用了適當的電導率，·故提高了免疫球蛋白的收率，免疫球蛋白的收率可達到5.2g/I以上(現有技術免疫球蛋白的收率為4.8g/l)。在對免疫球蛋白純化精製時，進行了兩次沉澱分離，兩次沉澱分離均採用了二級澄清除菌過濾，通過四級過濾，去除了製品中的不溶性顆粒，提高了製品的澄清度。在人免疫球蛋白超濾前後分別進行溶液的PH控制，減少和去除人免疫球蛋白中的抗補體活性，提高了人免疫球蛋白的有效性。
[0022]表一:產品的主要質量指標
[0023]
【權利要求】
1.一種低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，其特徵在於:包括以下步驟: 步驟一、從人血漿中分離F I，得F I上清液； 步驟二、從F I上清液中分離出F II +III沉澱； 步驟三、從F II + III沉澱中分離FIII沉澱，得FIII上清液； 步驟四、從FIII上清液中分離出F II沉澱； 步驟五、F II沉澱超濾、純化，包括以下步驟: ①、超濾脫醇:取重量為上述FII沉澱8~10倍、溫度為2~8°C注射用水將 F II沉澱完全溶解，採用二級澄清除菌過濾，調節溶液pH值至4.30~4.70 ; ②、巴氏滅活:將超濾脫醇後的溶液用注射用水調節蛋白質含量至17~33g/l，按60~120g/l加入甘氨酸，調節pH值至7.10~7.50，在55~65°C的溫度下加溫9~11小時進行巴氏滅活後，降溫至20~30°C ； ③、一次沉澱分離:用注射用水調節巴氏滅活後的溶液，使溶液中蛋白質含量為5.0~15.0g/Ι，調節溶液pH值至6.70~7.20，控制溫度至O~2°C，調節乙醇濃度至體積百分比18~20%，控制溫度至2~6°C，調節溶液的電導率為1.20~1.50ms/cm，攪拌反應I~3小時，按每千克蛋白質0.08~0.12kg比例分別添加等量的珍珠巖和娃藻土,繼續反應0.5~1.5小時後，用壓濾機進行加壓過濾，加壓過濾時，選用孔徑不超過0.9 μ m的深層濾板，控制壓濾機溫度至5°C以下`，過濾分離出一次沉澱，得一次沉澱上清液； ④、二次沉澱分離:將一次沉澱上清液溫度控制至-1~_3°C，調節pH值至7.10~7.40，乙醇濃度至體積百分比24~26%，控制溶液溫度至-6~_12°C，調節溶液的電導率為1.50~1.90ms/cm,攪拌反應I~3小時,用壓濾機進行加壓過濾,加壓過濾時,選用孔徑不超過0.9μ m的深層濾板，控制壓濾機溫度至-3°C以下，過濾分離出二次沉澱； ⑤、二次沉澱超濾脫醇:取重量為上述二次沉澱5~10倍、溫度為2~8°C的注射用水將二次沉澱完全溶解，採用二級澄清除菌過濾，同時調節PH值至3.40~3.80，超濾脫醇後再調節pH值至3.8~4.4。 步驟六、將步驟五所得二次沉澱溶液按成品規格配製，使蛋白質含量不低於50g/l，加入麥芽糖，使麥芽糖含量為90~110g/l，加入聚山梨酯-80，使聚山梨酯-80含量不大於80 μ g/ml,調節pH值至3.8~4.4,實現製品配製後,進行除菌過濾分裝。
2.根據權利要求1所述低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，其特徵在於:所述步驟一是將融合後的人血眾的溫度控制在0.0~4.0°C之間,調節蛋白質濃度至40~65g/l,調節溶液的電導率為12.0~14.0ms/cm，調節pH值至6.80~7.30，調節乙醇濃度至體積百分比7.0~10.0%,控制溫度至-1.0~-3.0°C,用壓濾機進行加壓過濾,加壓過濾時選用孔徑不超過0.9μ m的深層濾板，控制壓濾機溫度至-1°C以下，過濾分離出F I沉澱，得F I上清液。
3.根據權利要求1所述低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，其特徵在於:所述步驟二是，調節F I上清液pH值至5.70~6.30、乙醇濃度至體積百分比18.0~22.0%，控制溫度至-4.0~-6.(TC，按照每16Kg蛋白質添加0.5~1.5Kg的比例分別添加等量的珍珠巖和硅藻土，用壓濾機進行加壓過濾，加壓過濾時，選用孔徑不超過0.7 μ m的深層濾板，控制壓濾機溫度至_3°C以下，過濾分離出
F II +III沉澱。
4.根據權利要求1所述低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，其特徵在於:所述步驟三是，取重量為上述F II + III沉澱8~10倍、溫度為2~8V的注射用水將F II + III沉澱完全溶解，調節pH值至4.60~5.00，攪拌反應I~2小時後，再將溶液的pH值調節至5.00~5.40，再進行攪拌反應I~2小時，調節溶液電導率為1.20~L 50ms/cm，調節乙醇濃度至體積百分比13~15%，反應I~3小時，按每千克F II +III沉澱添加0.07~0.1kg的比例分別添加等量的珍珠巖和硅藻土，繼續反應0.5~1.5小時，用壓濾機進行加壓過濾，加壓過濾時，選用孔徑不超過0.7 μ m的深層濾板，控制壓濾機溫度至-1°C以下，過濾分離出F III沉澱，取F III上清。
5.根據權利要求1所述低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，其特徵在於:所述步驟四是，調節F III上清液電導率為6.50~8.50ms/cm、調節pH值至7.00~7.40、乙醇濃度至體積百分比24~26%、控制溫度至-6.0~-12.(TC，攪拌反應I~3小時，用壓濾機進行加壓過濾，加壓過濾時，選用孔徑不超過0.9 μ m的深層濾板，控制壓濾機溫度至-3°C以下，過濾分離出F II沉澱。
【文檔編號】C07K1/36GK103665100SQ201410003241
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2014年1月3日 優先權日:2014年1月3日
【發明者】安康, 張寶獻, 張其昌, 王猛, 滕世超, 郭心怡 申請人:華蘭生物工程重慶有限公司