一種液體深層發酵生產塊菌多糖的培養基的製作方法

2023-05-02 08:27:41 5

專利名稱:一種液體深層發酵生產塊菌多糖的培養基的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程與技術領域：
，具體涉及一種液體深層發酵生產塊菌多糖的培養基，還涉及一種生產塊菌多糖的液體深層發酵的方法，該培養基適用於塊菌的液體深層發酵以及工業化大規模發酵生產塊菌多糖。
技術背景塊菌是世界上最珍貴的藥食兩用真菌之一，其子囊果呈球形、半球形或塊狀，直徑一般在1.5-12釐米，成熟後為褐色、紅褐色至深褐色，基部常凹陷，表面布以大小不一的小疣。塊菌的產地狹窄，主要分布於歐洲大陸的北溫帶和寒帶地區，其產量在市場上一直供不應求，價值顯赫。
塊菌(Truffle)是地下生菌物中一個比較重要的子囊菌類群，子實體在土壤中生長，除個別種類在成熟時半露出土表外，大部分種類自始至終埋生於地下，是與樹木共生的外生菌根型藥食兩用真菌。
塊菌在生物分類學上屬於子囊菌亞門(Ascomycotina)、塊菌目(Tuberales)、塊菌科(Tuberaceae)、塊菌屬(Tuber)，常見的塊菌有黑孢塊菌(Tuber melanosporum Vittad)、印度塊菌(Tuber indicum Cooke)、中國塊菌(Tuber sinense Tao et Liu)等。我國雲南產的印度塊菌和和四川產的中國塊菌在外形上與黑孢塊菌相似，其品質亦可與歐洲產的黑孢塊菌相媲美，目前國際市場上每公斤新鮮黑孢塊菌的價格高達1000多美元，其昂貴的價格和黑色、疣狀的外形被賦予森林中「黑鑽石」的美譽。
有關塊菌多糖的研究開始於上個世紀九十年代，當時的研究側重於如何從塊菌的子實體中提取塊菌多糖及其生物活性，如文獻胡慧娟，李佩珍，林濤，杭秉茜，郭躍偉。塊菌多糖對小鼠腫瘤及免疫系統的影響。中國藥科大學學報，1994；25(5)289-292首次報導了從中國塊菌的子實體中提取出一種新的蛋白結合多糖——塊菌多糖，連續通過10天給藥接種有S-180肉瘤、EAC肉瘤液的小鼠，發現25毫克/千克、50毫克/千克的塊菌多糖能明顯的抑制小鼠S-180肉瘤及EAC肉瘤的生長。同時通過連續給藥發現塊菌多糖對小鼠脾臟的重量、外周血中的白細胞數及T淋巴細胞百分率具有明顯的增加作用；能夠促進T淋巴細胞轉化，提高小鼠血清中IgG水平等。實驗結果表明，塊菌多糖作為一個新的真菌多糖，毒性低、水溶性好、抑制腫瘤作用明顯，可望開發成為抗腫瘤免疫療法的藥物。
塊菌作為一種藥食兩用真菌具有可培養性，能夠通過廉價的培養基快速簡單地獲得大量的塊菌菌絲體及其發酵代謝產物，同時可以通過代謝工程的原理有針對性地設計合適的培養基組分，誘導塊菌多糖高效積累，使發酵過程朝著有利於塊菌多糖生產的方向進行，整個發酵過程容易放大到工業化生產的規模。但目前的發酵研究主要側重於如何獲得塊菌的菌絲體，如文獻陳惠群，劉洪玉，李子平。中國塊菌主要生理特性初步研究。食用菌學報，1998，5(4)26-30報導了將中國塊菌(Tuber sinense Tao et Liu)在鮮松針培養基(洋芋20％、鮮松針3％、葡萄糖1％、麥芽糖1％、蛋白腖0.5％、硫酸鎂0.05％、瓊脂2％)上進行純培養，通過比較菌絲的生長量和菌落直徑大小分別考察了溫度、碳源、氮源、pH對中國塊菌菌絲生長的影響。結論表明中國塊菌的最適宜生長溫度為23-25℃、最適pH為5-6，菌絲生長最好的碳源為麥芽糖、蔗糖、果糖，菌絲生長最好的氮源為蛋白腖和硫酸銨。
塊菌多糖可以直接從塊菌子實體中提取，亦可以通過塊菌液體深層發酵的方法獲得，但前者不適應於工業化大規模生產，原因主要在於1.塊菌作為一種生長於地下的藥食兩用真菌，在自然界中要求生長於鹼性土壤、氣候溫和的環境，同時與橡樹、櫟樹等樹種的根系共生，苛刻的生長條件直接導致了其天然產量的供不應求。
2.為彌補塊菌天然產量的不足曾有不少學者進行了半人工模擬栽培的研究，但從接種到收穫一般需要7-9年時間，周期較長，需要耗費大量的人力和物力。
3.由於塊菌生長於地下，人工發現的難度較大，採集過程中易受到損傷，同時塊菌生長於自然界受環境變化的影響較大，品質較難保證。
4.目前歐美市場上每千克新鮮的黑孢塊菌的價格高達1000美元，雲南產的中國塊菌的市場價亦高達400元/公斤。因此若直接以塊菌子實體作為塊菌多糖的生產原料則無法迴避原料價格昂貴、產量有限等問題。
目前的文獻報導僅是針對中國塊菌的生理特性研究進行了純培養和在黑孢塊菌的半人工模擬栽培過程中對塊菌的菌絲體生長進行了初步研究，涉及到通過液體深層發酵生產塊菌多糖的塊菌純培養的研究尚未見到有關報導，相關的培養基配方研究在本發明中屬於第一次報導。總之，一種既適合塊菌生長又適合塊菌胞外多糖生產的液體深層發酵培養基對整個塊菌多糖生產的工藝和成本而言至關重要。

發明內容本發明的目的在於提供一種液體深層發酵生產塊菌多糖的培養基，該培養基配方合理，成本低廉，製作簡便；中國塊菌在該液體深層發酵培養基中生長迅速、塊菌胞外多糖產量高；利用塊菌在該培養基中深層發酵來生產塊菌多糖能夠解決塊菌子實體產量不足等問題。
本發明的另一個目的在於提供一種液體深層發酵生產塊菌多糖的製備方法，方法易行，操作簡便，適合塊菌多糖的工業化生產。
本發明的技術方案以中國塊菌(Tuber sinense Tao et Liu)為出發菌株，有關該菌株的內容詳見參考文獻(陳惠群 劉洪玉.中國塊菌主要生理特性初步研究，食用菌學報，1998，5(4)26-30)。採用斜面菌種培養、一級液體種子培養、二級液體種子培養、和液體深層發酵的生產流程來生產塊菌胞外多糖。在液體深層發酵階段，通過考察不同的碳源、氮源和起始pH值對塊菌胞外多糖產量的影響來優化最佳的液體深層發酵培養基。
實現本發明的具體步驟如下一、斜面菌種培養本發明所採用的斜面培養基為麥芽糖30-150克/升、硫酸鎂1.0-10克/升、磷酸二氫鉀1.0-10克/升、瓊脂10-30克/升、馬鈴薯提取液1.0升、pH值5-8。滅菌條件為121℃、20分鐘。將中國塊菌接種於新鮮配置的斜面培養基中，置於生化培養箱內培養，培養溫度15-40℃，培養時間2-20天。
二、液體種子培養液體種子培養基配方為麥芽糖30-150克/升、蛋白腖5.0-50克/升、硫酸鎂1.0-10克/升、磷酸二氫鉀1.0-10克/升、pH值5-8；培養溫度15-40℃，搖床轉速50-300轉/分鐘，培養時間2-20天。將步驟一中所培養的斜面菌種轉接入裝有一級液體種子培養基的搖瓶中進行一級液體種子培養，該培養液即為含有菌種的一級液體種子。將所培養的一級液體種子轉接入搖瓶中進行二級液體種子培養，接種量按體積比計為10％，該培養液即為含有菌種的二級液體種子。
三、塊菌液體深層發酵及其培養基的優化將步驟二中所培養的二級液體種子轉接搖瓶進行液體深層發酵，接種量按體積比計為10％，發酵溫度15-40℃，搖床轉速50-300轉/分鐘，發酵時間2-20天。所述的液體深層發酵培養基中無機鹽成分為硫酸鎂0.1-10克/升、磷酸二氫鉀0.1-10克/升；碳源為麥芽糖50克/升、乳糖30-150克/升、果糖80克/升、或半乳糖80克/升；氮源為尿素7克/升、酵母膏34克/升、牛肉浸膏34克/升、硫酸銨15.6克/升、氯化銨12.6克/升、硝酸鈉20克/升、硝酸鉀24克/升、硝酸銨9克/升；起始pH值為2-9。根據碳源、氮源、pH值的優化結果，得到一種液體深層發酵培養基配方乳糖30-150克/升、蛋白腖5-50克/升、硫酸鎂1.0-10克/升、磷酸二氫鉀1.0-10克/升、pH值為2-9。將該培養基組分用水溶解，然後調至指定的pH值，置於高壓滅菌鍋內121℃滅菌20分鐘後即完成該液體深層發酵培養基的製備。
四、塊菌胞外多糖的測定將步驟三中所獲得的含有菌絲體的發酵液離心(5000轉/分鐘、30分鐘)，取其上清液用於塊菌胞外多糖的測定。採用乙醇沉澱法來獲得液體深層發酵所獲得的塊菌胞外多糖，發酵上清液加入四倍體積的無水乙醇，混勻後靜置過夜，13000轉/分鐘離心5分鐘後取沉澱，用等量的80％乙醇清洗後在13000轉/分鐘下離心5分鐘就可以得到純度較高的胞外多糖，其濃度用濃硫酸-苯酚法來測定。詳細步驟見參考文獻，M.Dubois，K.A.Gilles，J.K.Hamilton，et al.Colorimetric method for determination of sugars andrelated substances，Anal.Chem.1956，(28)350-356.
本發明的有益效果由於塊菌價格昂貴，目前塊菌多糖的工業化生產在市場上沒有，本發明避免了從塊菌子實體中提取多糖過程中原料有限和價格昂貴等不利因素，大大降低其生產成本，有望填補塊菌多糖工業化生產的空白。同時通過對碳源、氮源、起始pH的優化，本發明所獲得的最佳液體深層培養基能大大提高塊菌多糖的產量，更適合塊菌多糖的工業化生產。
具體實施方式實施例1採用的菌種中國塊菌(Tuber sinense Taoet Liu)。
A、斜面菌種培養本實施例所採用的斜面菌種培養基配方為麥芽糖50克/升、硫酸鎂5克/升、磷酸二氫鉀5克/升、瓊脂15克/升、馬鈴薯提取液1.0升、pH值5或6或7或8。滅菌條件為121℃、20分鐘。培養溫度為15或17或19或24或27或29或34或36或40℃，培養時間為2或5或7或9或14或16或17或20天。
B、液體種子培養本實施例中一級液體種子、二級液體種子培養基的配方均為麥芽糖70克/升，蛋白腖25克/升，硫酸鎂5克/升，磷酸二氫鉀6克/升，pH值5或6或7或8。將斜面菌種轉接入裝有一級液體種子培養基的搖瓶中即可進行一級液體種子培養。培養溫度為15或17或19或24或27或29或34或36或40℃，搖床轉速為200轉/分鐘，培養時間為2或5或7或9或14或16或17或20天，裝液量為每250毫升搖瓶裝50毫升液體；將培養好的一級液體種子轉接搖瓶進行二級液體種子培養，二級液體種子的培養基配方和以上一級液體種子培養基的配方相同，培養溫度與A步相同，搖床轉速為200轉/分鐘，培養時間為2或4或6或8或10天，接種量為5毫升，裝液量為每250毫升搖瓶裝50毫升液體。
C、塊菌液體深層發酵及其培養基優化所採用的液體深層發酵培養基配方為麥芽糖80克/升，蛋白腖30克/升，硫酸鎂5克/升，磷酸二氫鉀6克/升，pH為2或3或4或5或6或7或8或9。發酵條件為溫度，搖與A步相同，搖床轉速200轉/分鐘，培養時間與A步相同。接種量為5毫升，裝液量為每250毫升搖瓶裝50毫升液體。
胞外多糖的測定主要參考文獻M.Dubois，K.A.Gilles，J.K.Hamilton，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances，Anal.Chem.1956，(28)350-356。具體實施步驟如下發酵完畢後將含有菌絲體的發酵液離心(5000轉/分鐘、30分鐘)，將發酵液離心後獲得的上清液用於塊菌胞外多糖的測定，採用乙醇沉澱法測定液體深層發酵所獲得的塊菌胞外多糖，取200微升離心後的上清液加入800微升的無水乙醇，混勻後靜置過夜，13000轉/分鐘離心4-6分鐘後取沉澱，用1毫升80％乙醇清洗後在13000轉/分鐘下離心4-6分鐘就可以得到純度較高的胞外多糖。濃度用濃硫酸-苯酚法來測定，向得到的胞外多糖中加入1摩爾/升的氫氧化鈉1毫升，60℃保溫1小時，冷卻後取500微升補水至1毫升；加入5％苯酚1毫升，混勻後加入濃硫酸5毫升，25℃保溫25分鐘後於488nm下比色。用分析純的葡萄糖以同樣的方法製作標準曲線，最後通過回歸方程計算出多糖的含量為1.60克/升。
實施例2-4液體深層發酵培養基中碳源分別為80克/升乳糖、80克/升果糖、80克/升半乳糖，其它條件與實施例1相同。分析測試結果，塊菌胞外多糖的產量分別為1.83克/升、1.13克/升、1.17克/升。
實施例5-12液體深層發酵培養基中碳源為乳糖，濃度分別為30克/升、50克/升、60克/升、70克/升、90克/升、110克/升、130克/升、150克/升，其它條件與實施例1相同。分析測試結果，塊菌胞外多糖的產量分別為0.88克/升、1.15克/升、1.35克/升、2.18克/升、1.60克/升、1.35克/升、1.19克/升、0.91克/升。
實施例13-20液體深層發酵培養基中氮源分別為尿素7克/升、酵母膏34克/升、牛肉浸膏34克/升、硫酸銨15.6克/升、氯化銨12.6克/升、硝酸鈉20克/升、硝酸鉀24克/升、硝酸銨9克/升，其它條件與實施例1相同。分析測試結果，塊菌胞外多糖的產量分別為1.53克/升、0.28克/升、1.07克/升、0.50克/升、0.25克/升、0.45克/升、0.62克/升、0.64克/升。
實施例21-27液體深層發酵培養基中氮源為尿素，濃度分別為1克/升、3克/升、5克/升、8克/升、11克/升、15克/升、20克/升，其它條件與實施例1相同。分析測試結果，塊菌胞外多糖的產量分別為0.65克/升、1.10克/升、1.42克/升、1.85克/升、1.87克/升、1.44克/升、1.13克/升。
實施例28-35液體深層發酵培養基中蛋白腖濃度為5克/升、10克/升、15克/升、20克/升、25克/升、30克/升、35克/升、50克/升，其它條件與實施例1相同。分析測試結果，塊菌胞外多糖的產量分別為1.41克/升、1.60克/升、1.85克/升、2.04克/升、2.23克/升、1.60克/升、1.46克/升、1.15克/升。
實施例36-42液體深層發酵培養基中起始pH值分別為2、3、4、5、7、8、9，其它條件與實施例1相同。分析測試結果，塊菌胞外多糖的產量分別為0.35克/升、1.39克/升、0.93克/升、1.28克/升、1.55克/升、1.68克/升、1.01克/升。
實施例43-50液體深層發酵培養基中硫酸鎂濃度為0.1克/升、0.5克/升、1克/升、2克/升、5克/升、7克/升、9克/升、10克/升，其它條件與實施例1相同。分析測試結果，塊菌胞外多糖的產量分別為0.22克/升、0.44克/升、1.10克/升、1.37克/升、1.60克/升、1.42克/升、1.13克/升、1.02克/升。
實施例51-58液體深層發酵培養基中磷酸二氫鉀濃度為0.1克/升、0.5克/升、1克/升、2克/升、5克/升、6克/升、7克/升、9克/升、10克/升，其它條件與實施例1相同。分析測試結果，塊菌胞外多糖的產量分別為1.32克/升、1.58克/升、1.76克/升、2.1 5克/升、2.30克/升、1.60克/升、1.54克/升、1.38克/升、1.01克/升。
權利要求
1.一種液體深層發酵生產塊菌多糖的製備方法，它包括下列步驟A、斜面菌種培養將中國塊菌菌種接種於斜面培養基上，接種完後置於生化培養箱裡培養，培養溫度15-40℃，培養時間2-20天，所述的斜面菌種培養基配方為麥芽糖30-150克/升，硫酸鎂1.0-10克/升，磷酸二氫鉀1.0-10克/升，瓊脂10-30克/升，馬鈴薯提取液1.0升，pH值為5-8；B、液體種子的培養將步驟A中培養的斜面菌種轉接入裝有一級液體種子培養基的搖瓶中進行一級液體種子培養，培養條件為溫度15-40℃、搖床轉速50-300轉/分鐘、時間2-20天；該培養液即為含有菌種的一級液體種子，所述的一級液體種子培養基配方為麥芽糖30-150克/升、蛋白腖5-50克/升、硫酸鎂1.0-10克/升、磷酸二氫鉀1.0-10克/升、pH值5-8，培養條件為溫度15-40℃、搖床轉速50-300轉/分鐘、培養時間2-10天；將培養好的一級液體種子轉接搖瓶進行二級液體種子培養，二級液體種子培養基與一級液體種子培養基相同，接種量10％/體積比，所得到的培養液即為含有菌種的二級液體種子；C、塊菌液體深層發酵將步驟B中所培養的二級液體種子轉接搖瓶進行液體深層發酵，發酵條件接種量10％/體積比、溫度15-40℃、搖床轉速50-300轉/分鐘、發酵時間2-20天，所述的液體深層發酵培養基中無機鹽成分為硫酸鎂0.1-10克/升、磷酸二氫鉀0.1-10克/升，碳源為麥芽糖、乳糖、果糖、或半乳糖；氮源為蛋白腖、尿素、酵母膏、牛肉浸膏、硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸銨，起始pH值為2-9，根據碳源、氮源、起始pH值的選擇，將液體深層發酵培養基用水溶解後調至指定的pH值，置於高壓滅菌鍋內121℃滅菌20分鐘後即完成該液體深層發酵培養基的製備。
2.一種用於實現權利要求
1所述的塊菌液體深層發酵的培養基，其特徵在於乳糖30-150克/升、蛋白腖5-50克/升、硫酸鎂0.1-10克/升、磷酸二氫鉀0.1-10克/升。
專利摘要
本發明公開了一種液體深層發酵生產塊菌多糖的培養基。該培養基由乳糖、蛋白腖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀按一定比例構成，其塊菌多糖的製備步驟首先是斜面菌種培養，其次是液體種子培養，最後是液體深層發酵。本發明通過對中國塊菌的斜面菌種、一級液體種子和二級液體種子的培養來穩定其生理狀況，在液體深層發酵階段著重考察了不同碳源、氮源及起始pH值對塊菌液體深層發酵過程中塊菌多糖產量的影響。在該培養基中塊菌生長迅速，發酵周期短，多糖產量高，成本低，適用於工業化大規模生產塊菌多糖。
文檔編號C12P19/04GK1995322SQ200610166503
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月27日
發明者湯亞傑, 李冬生, 孔國平 申請人:湖北工業大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan