基於spr幹涉成像的生物分子相互作用檢測方法及系統的製作方法

2023-05-02 08:17:11

專利名稱：基於spr幹涉成像的生物分子相互作用檢測方法及系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及用來實現高通量、高精度、無標記、實時傳感 蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-效應物、抗原-抗體、配體_受體、藥物-靶等生物 分子相互作用的檢測方法及其檢測系統。
背景技術：
生命過程的本質是一個各種生物分子相互作用的過程，疾病的發生和變化過程也 無不與分子相互作用攸關。正因為如此，生物分子相互作用的檢測已成為生命科學的研究 熱點之一。其中，蛋白質是基因的表達產物，執行著生命的功能，研究蛋白質分子之間及其 與別的分子相互作用，對闡明生命過程和疾病發生與發展的機理，以及新藥物發現都具有 重要的意義。與基因相比，蛋白質不僅種類更多，而且有時空特性，檢測基因的方法難以滿 足蛋白質檢測的要求，從而急切需要高通量、高精度、無標記、實時並能保持蛋白質活性的 新穎檢測方法。基於表面等離子體共振(surface ρlasmon resonance，簡稱SPR)的生物傳感器是 一種具有高靈敏度、實時、無標記等特點的光學檢測方法，被認為是檢測生物分子相互作用 的較理想方法。SPR生物傳感器的檢測方法主要有角度掃描、光強檢測和相位檢測等，其中 相位檢測的靈敏較高。本專利發明人曾提出了基於塞曼雷射器的外差幹涉生物分子相互作 用實時相位檢測分析方法及系統(參見中國專利號ZL99107780. 6，申請日期1999. 5. 28)， 這種方法的特點是精度高，但每次只能檢測1個樣本，或通過逐點掃描的方法檢測幾個樣 本，無法實現高通量測量。針對該不足，本專利的發明人又提出了基於空間相位調製幹涉 陣列檢測生物晶片的方法及系統(參見中國專利號ZL200410057323. 0)，基本構成如圖1 所示。氦氖雷射器101發出的線偏振平行光透過稜鏡102、折射率匹配液103和傳感晶片 玻璃基底104，入射到玻璃基底104與鍍在基底上的金膜105之間的界面，金膜的厚度為 30-50nm。當入射角處在共振角時，入射光在金膜表面激發表面等離子體共振。光從玻璃基 底104與鍍在基底上的金膜105之間的界面上反射，透過一維擴束鏡106，進入沃拉斯頓稜 鏡107 ；光在通過沃拉斯頓稜鏡107時，其中的P偏振分量和S偏振分量被分開一個很小的 角度，而後從沃拉斯頓稜鏡107射出。接著，光在通過偏振稜鏡108時，P偏振分量S偏振 分量發生幹涉，幹涉條紋通過成像透鏡109成像在CXD 110的靶面上，由計算機採集幹涉圖 像並進行處理。如果金膜表面的折射率發生變化，反射光中的P偏振光和S偏振光之間的 相位差隨之變化，成像在CCD上的幹涉條紋即對應移動。利用傅立葉條紋分析技術對所採 集的幹涉圖像進行處理，解算相位變化，得到晶片表面的折射率變化信息，從而實現了陣列 檢測。這種方法是通過測量幹涉條紋來獲得相位變化，為了靈敏地測定相位變化，每一個傳 感點應至少包含3條幹涉條紋，這樣至少需要佔據相鄰的12個CXD像素。顯然，C⑶的行 與列的像素都有限，檢測通量自然受到了限制。針對上述不足，本專利發明人進一步提出了基於時域相位調製幹涉的表面等離子 體陣列生物傳感方法(參見中國專利ZL200510086332. 7)，基本原理如圖2所示。光源201發出的平行光透過稜鏡202和折射率匹配層203，入射到傳感晶片的玻璃基底204和鍍在其 上的金膜205之間的界面上，並從該界面反射，金膜的厚度為30-50nm。當入射光處在共振 角上時，激發金膜表面的等離子體共振，從玻璃基底204和金膜205之間的界面上發射的光 的相位隨金膜表面介質折射率的改變而劇烈變化。反射光透過折射率匹配層203、稜鏡202 和一維擴束鏡206後，射入電光晶體207。電光晶體207由高壓調製電源208控制，可以在 其上施加5種不同的電壓。隨之，當光通過電光晶體207後，反射光的P和S偏振分量之間 就被附加上對應的5個不同相位差。調製後的光在通過偏振稜鏡209時，P偏振光和S偏 振光發生幹涉，幹涉圖像被成像透鏡210成像在CXD 211的靶面上。CXD 211圖像的採集 與高壓電源208輸出的對應電壓同步，高壓電源208輸出5個不同的電壓為1個周期，對應 採集5幀圖像也為1個周期。高壓電源208可以循環輸出電壓，對應的幹涉圖像也可以循 環採集。接著，利用Hariharan算法，對所採集的相鄰的5個電壓下的5幀幹涉圖像進行解 算，得到即時反射光的相位變化。理論上，利用這種方法，只需一個CCD的像素，就能檢測傳 感晶片上的一個傳感點，能實現高通量檢測。然而，當在電光晶體上施加高電壓時，隨之會 出現逆壓電效應，造成電光晶體的結構發生微尺度的形變，引起光路微小偏移，即光斑位置 移動，直接產生測量誤差，影響陣列檢測的一致性差，難以達到高精度檢測的要求。這是電 光晶體固有的缺陷，無法彌補。

發明內容
本發明的目的在於克服上述技術的不足，提供一種新的基於幹涉成像的表面等離 子體共振傳感系統方法及系統，能夠高通量、高精度、實時、無標記檢測蛋白質晶片，獲取蛋 白質之間相互作用的信息。根據本發明的一方面提供了一種基於sra幹涉成像的生物分子相互作用的檢測 方法，其特徵在於，包括以下步驟1)使半導體雷射器發出的光經過光纖耦合和準直後，再通過偏振稜鏡，得到偏振 方向可調的線偏振的準直光束；2)使所述的線偏振準直光束通過由計算機控制的四分之一波片切換裝置，所述切 換裝置中的2個快軸方向正交的四分之一波片被交替定位在光路中，從而使準直光的P偏 振分量和S偏振分量之間的相位差被交替調製成為90°或-90° ；3)使經過相位調製的準直光再入射到生物傳感單元中的傳感晶片的玻璃基底與 金膜之間的界面上，從而激發表面等離子體共振，同時光從該界面反射；4)使所述反射光通過檢偏器，從而使其中的P偏振分量和S偏振分量發生幹涉，產 生幹涉圖像；5)使所述幹涉圖像經成像鏡頭成像在CCD靶面上，並採集CCD靶面上的成像幹涉 圖像；6)由計算機控制波片切換機構，交替採集附加90°和-90°相位差後產生的成像 幹涉圖像；7)採集2幀圖像為1個周期，利用所採集到的附加90°和-90°相位差的相鄰的 2幀成像幹涉圖像，通過下式計算反映折射率分布的分布函數，
50014] Α=^Γ(1)式中，1+為附加90°相位差的幹涉圖像的折射率，1_為附加-90°相位差的幹涉 圖像的折射率，A為反映折射率分布的分布函數。根據本發明的一個實施例，還包括以下步驟8)重複步驟2)至步驟7)的操作，對循環採集到一系列成像幹涉圖像進行計算，並 以計算所得的一系列分布函數與折射率進行繪圖，從而得到一系列持續反映折射率分布的 信號圖。通過本發明的基於sra幹涉成像的生物分子相互作用的檢測方法，基於表面等 離子體共振陣列生物傳感原理，在入射光的P偏振分量和S偏振分量間，輪流附加90° 和-90°相位差，獲取對應的幹涉圖像，通過對2幅解算幹涉圖像，能夠得到1張反應折射率 分布信息圖像。利用相鄰的2幀幹涉圖像，可計算出1張反映折射率分布的A信號圖；若一 共採集η幀幹涉圖像，則可計算出η-1張反映折射率分布的信號圖Α。通過連續測量，就可 以實時得到折射率分布隨時間變化信息。根據本發明的另一方面還提供了一種基於sra幹涉成像的生物分子相互作用的 檢測系統，包括產生準直光並對其交替附加相位差的入射臂；接受經附加相位差的準直 光並激發表面等離子體共振的生物傳感單元；接受由所述生物傳感單元反射的光，使其產 生幹涉並將幹涉圖像成像的反射臂；以及獲取幹涉圖像並進行後續處理的信號採集處理單 元，其中，所述入射臂中依次設置有偏振雷射準直裝置、波片切換裝置、以及擴束裝置。根據本發明的一個實施例，其中，所述偏振雷射準直裝置中依次設置有半導體激 光器、單模光纖、雷射準直器和偏振稜鏡。根據本發明的一個實施例，其中，所述波片切換裝置包括旋轉電機、擺動架、波片 旋轉架以及兩個四分之一波片，所述四分之一波片固定在波片旋轉架中，所述波片旋轉架 安裝在所述擺動架上，所述擺動架在所述旋轉電機的驅動下，將兩個所述四分之一波片輪 流定位在光路中心，使所述四分之一波片與光軸垂直，以實現在P偏振分量和S偏振分量間 輪流附加90°和-90°的相位差。根據本發明的一個實施例，其中，所述擴束裝置的擴束倍數為2-8倍。根據本發明的一個實施例，其中，所述生物傳感單元利用表面等離子體共振的原 理，包括直角或梯形的稜鏡、傳感晶片和置於所述傳感晶片與所述稜鏡之間的折射率匹配 液，其中所述稜鏡、折射率匹配液和傳感晶片基底的折射率相同，且所述傳感晶片表面鍍有 30-50nm厚的金膜。根據本發明的一個實施例，其中，在所述金膜表面通過化學方法修飾有一層親水 的自組裝膜。根據本發明的一個實施例，其中，所述反射臂包含偏振稜鏡和成像鏡頭，該鏡頭將 金膜表面的幹涉圖像成像在CXD靶面上。根據本發明的一個實施例，其中，所述信號採集處理單元包含CXD或CMOS、以及計 算機，從所述CCD上採集到的所述成像幹涉圖像被輸入所述計算機，所述計算機利用相鄰2 幀所述成像幹涉圖像計算出折射率分布。通過本發明提供的這種基於sra幹涉成像的生物分子相互作用的檢測方法以及實現該方法的基於sra幹涉成像的生物分子相互作用的檢測系統，可以高通量、高精度、實 時、無標記檢測，獲取生物分子相互作用的信息，提供給生物醫學和藥物研究人員，進行蛋 白組學研究、疾病診斷、藥物發現與開發等。


圖1為現有技術的一種sra空間相位調製檢測原理示意圖；圖2為現有技術的一種SPR時域調製相位檢測原理示意圖；圖3為本發明的一個實施例的計算方法的理論依據；圖4為本發明的一個實施例的基於SI^R幹涉成像的生物分子相互作用的檢測系統 結構的示意圖；圖5為本發明的一個實施例的波片切換裝置結構示意圖，其中圖5a為主視圖，圖 5b為側視圖；圖6為本發明的一個實施例的檢測及信號處理過程的流程圖。
具體實施例方式下面結合附圖，對本發明所述的基於sra幹涉成像的生物分子相互作用的檢測方 法以及用於實現該方法的基於sra幹涉成像的生物分子相互作用的檢測系統舉例進行說 明。本發明所述的計算方法是利用sra反射光的振幅和相位隨折射率劇烈變化的特 性，通過公式(1)計算得到的反映折射率分布的信號圖A和實際的折射率關係可通過菲涅 爾公式仿真，仿真結果如圖3所示。從圖中可以看出，兩者在一定區間內成線性關係。因此， A的變化能反映實際的折射率變化，線性區間的位置由入射角的大小決定，通過改變入射角 可實現在不同折射率區間的測量。圖4顯示了本發明的一個實施例的基於SI^R幹涉成像的生物分子相互作用的檢測 系統的結構示意圖。在本實施例的檢測系統中，包括入射臂、生物傳感單元、反射臂和信號 採集處理單元等四大部分。根據本發明的一個實施例，所述入射臂位於生物傳感單元的一側，依次包括控溫 半導體雷射器401、單模光纖402、雷射準直器403、偏振稜鏡404、波片轉盤405、旋轉電機 406和雷射擴束鏡407。根據本發明的一個實施例，在所述入射臂中，控溫半導體雷射器401在恆流電源 的驅動下，發出光強穩定的雷射，光通過格林透鏡耦合到單模光纖402中，並在單模光纖 402中傳輸一段距離之輸出。接著，通過準直器403後成為光斑為3-10mm的準直光束，又透 過偏振稜鏡404，成為線偏振光，偏振方向可調。線偏振光通過波片移動機構405後，就在P 偏振方向和S偏振方向之間交替附加上90°和-90°的相位差，即進行了相位調製。經過 相位調製後的光束通過雷射擴束鏡407，擴束成為直徑為10-30mm的準直光束，再射到生物 傳感單元中。根據本發明的一個實施例，所述波片移動機構如圖5所示，包括旋轉電機405-1、 擺動架405-2、壓緊環405-3、波片旋轉架405-4、墊片405-5和四分之一波片405-6組成。 四分之一波片405-6和墊片405-5通過壓緊環405-3固定在波片旋轉架405-4中，波片旋
7轉架405-4安裝在擺動架405-2上，擺動架405-2在旋轉電機405-1的驅動下，將2個波片 405-6輪流定位在光路中心，波片與光軸垂直，實現在P偏振分量和S偏振分量間輪流附加 90°和-90°的相位差。根據本發明的一個實施例，所述生物傳感單元為表面等離子體共振生物傳感器， 包括直角稜鏡408、傳感晶片410和置於傳感晶片與稜鏡之間的折射率匹配液409、晶片表 面鍍有40nm金膜411以及位於傳感晶片410下面的流體池412，傳感晶片410與流體池412 緊貼並密封。在本發明所述的生物傳感單元中，稜鏡408與傳感晶片410的玻璃基底使用相同 的K9或ZF5玻璃，折射率匹配液409的折射率與稜鏡408和晶片410的玻璃基質折射率一 致。晶片410在玻璃基底上鍍有30-50nm的金膜411，金膜411表面使用化學方法修飾一 層親水的自組裝膜，用於偶聯被檢測的蛋白質分子。流體池412與金膜411緊貼並密封，金 膜411的表面成為流體池的其中一面的壁。當被檢測生物分子的溶液從其中流過時，溶液 中的生物分子與晶片表面偶聯的分子相互作用，引起晶片表面結構改變，隨之對應的折射 率變化。準直光束透過稜鏡408、折射率匹配液409和晶片410，在晶片410和金膜411的 界面處發生全反射，在入射角為共振角時，入射光的能量由倏逝波耦合到金膜411，形成表 面等離子體共振。根據本發明的一個實施例，位於生物傳感單元的另一側設置有反射臂，所述反射 臂中依次包含偏振稜鏡413和成像鏡頭414。由生物傳感單元反射的光，通過反射臂上的 偏振稜鏡413時，P偏振光和S偏振光發生幹涉，幹涉圖像由成像鏡頭414成像在CXD 415 上，該幹涉圖像為傳感表面的實像。根據本發明的一個實施例，所述信號採集處理單元包含CXD 415和用於圖像採集 和數據分析的計算機。當然，代替CCD，也可以使用CMOS。在所述信號採集處理單元中，從 CXD 415上採集到的幹涉圖像被輸入計算機，進行實時處理。旋轉電機405-1的運動和CXD 415的採集都由計算機控制，交替獲取附加了 90°和-90°相位差的幹涉圖像。計算機利 用相鄰的2幀幹涉圖像，可計算出1張反映折射率分布的A信號圖，若一共採集η幀幹涉圖 像，則可計算出η-1張反映折射率分布的A信號圖。很明顯，與傳統的五步相移法相比，解 算效率提高了 4倍。相鄰的2幀圖像之間的採集時間間隔小，可認為在採集相鄰的2幀幹 涉圖像時入射光強不變，這樣計算得到的反映折射率變化的信號分布圖與初始的光強分布 無關，避免了光強分布的不均勻性帶來的誤差，同時還能抑制光強漂移造成的測量誤差。下面結合附圖具體說明根據本發明的一個實施例的檢測及信號處理過程。圖6為 本發明的一個實施例的檢測及信號處理過程的流程圖。在測量開始時，計算機首先控制旋轉電機405-1，將一塊波片定位在光路中心，在 P和S偏振分量之間附加上90°或-90°相位差，CXD 415傳感對應的幹涉圖像，由計算機 讀入。緊接著，旋轉電機405-1將另一塊波片定位在光路中心，在P和S分量之間附加 上-90°或90°相位差，CXD 415傳感對應的幹涉圖像，由計算機讀入。其後，計算機利用 2幀幹涉圖像，根據公式(1)，計算反映折射率分布的A分布函數，並由此得到1張分別以分 布函數A和折射率為縱坐標和橫坐標的信號圖。同時，還可以選擇晶片上的傳感點，確定該 點的折射率變化，繪製對應的測量曲線。至此，完成了一個操作周期。
重複上述操作過程，又可以得到1張新的反映折射率分布的信號圖。計算這2張 信號圖之間的差異，便得到在對應傳感點上發生分子相互作用時引起的折射率變化。循環進行，就可以實時檢測生物分子的相互作用，並繪出對應傳感點的折射率隨 時間變化的曲線，繼而提供給生物醫學研究人員進行相關解析。通過本發明的基於sra幹涉成像的生物分子相互作用的檢測方法，基於表面等 離子體共振陣列生物傳感原理，在入射光的P偏振分量和S偏振分量間，輪流附加90° 和-90°相位差，獲取對應的幹涉圖像，通過對2幅幹涉圖像進行計算，能夠得到1張分別 以分布函數A和折射率為縱坐標和橫坐標的信號圖。利用相鄰的2幀幹涉圖像，可計算出 1張反映折射率分布的信號圖；若一共採集η幀幹涉圖像，則可計算出η-1張反映折射率分 布的信號圖。通過連續測量，就可以實時得到折射率分布隨時間變化信息。通過本發明提供的這種基於sra幹涉成像的生物分子相互作用的檢測方法以及 實現該方法的基於SPR幹涉成像的生物分子相互作用的檢測系統，可以高通量、高精度、實 時、無標記檢測，獲取生物分子相互作用的信息，提供給生物醫學和藥物研究人員，進行蛋 白組學研究、疾病診斷、藥物發現與開發等。儘管已經示出和描述了本發明的實施例，對於本領域的普通技術人員而言，可以 理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換 和變型，本發明的範圍由所附權利要求及其等同限定。
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權利要求
一種基於SPR幹涉成像的生物分子相互作用的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟1)使半導體雷射器發出的光經過光纖耦合和準直後，再通過偏振稜鏡，得到偏振方向可調的線偏振的準直光束；2)使所述線偏振準直光束通過由計算機控制的四分之一波片切換裝置，所述切換裝置中的2個快軸方向正交的四分之一波片被交替定位在光路中，從而使準直光的P偏振分量和S偏振分量之間的相位差被交替調製成為90°或 90°；3)使經過相位調製的準直光再入射到生物傳感單元中的傳感晶片的玻璃基底與金膜之間的界面上，從而激發表面等離子體共振，同時使光從該界面反射；4)使所述反射光通過檢偏器，從而使其中的P偏振分量和S偏振分量發生幹涉，產生幹涉圖像；5)使所述幹涉圖像經成像鏡頭成像在CCD靶面上，並採集CCD靶面上的成像幹涉圖像；6)由計算機控制波片切換機構，交替採集附加90°和 90°相位差後產生的成像幹涉圖像；7)採集2幀圖像為1個周期，利用所採集到的附加90°和 90°相位差的相鄰的2幀成像幹涉圖像，通過下式計算反映折射率分布的分布函數， A= I +- I - I ++ I - --- ( 1 ) 式中，I+為附加90°相位差的幹涉圖像的折射率，I 為附加 90°相位差的幹涉圖像的折射率，A為反映折射率分布的分布函數。
2.如權利要求1所述的基於SI^R幹涉成像的生物分子相互作用的檢測方法，其特徵在 於，還包括以下步驟8)重複步驟2)至步驟7)的操作，對循環採集到的一系列成像幹涉圖像進行計算，並以 計算所得的一系列分布函數與折射率進行繪圖，從而得到一系列持續反映折射率分布的信 號圖。
3.一種基於sra幹涉成像的生物分子相互作用的檢測系統，包括產生準直光並對其 交替附加相位差的入射臂；接受經附加相位差的準直光並激發表面等離子體共振的生物傳感單元； 接受由所述生物傳感單元反射的光，使其產生幹涉並將幹涉圖像成像的反射臂；以及 獲取幹涉圖像並進行後續處理的信號採集處理單元，其特徵在於，所述入射臂中依次設置有偏振雷射準直裝置、波片切換裝置、以及擴束裝置。
4.如權利要求3所述的基於SI^R幹涉成像的生物分子相互作用的檢測系統，其特徵在 於，所述偏振雷射準直裝置中依次設置有半導體雷射器、單模光纖、雷射準直器和偏振稜鏡。
5.如權利要求3所述的基於SPR幹涉成像的生物分子相互作用的檢測系統，其特徵在 於，所述波片切換裝置包括旋轉電機、擺動架、波片旋轉架以及兩個四分之一波片，所述四 分之一波片固定在波片旋轉架中，所述波片旋轉架安裝在所述擺動架上，所述擺動架在所述旋轉電機的驅動下，將兩個所述四分之一波片輪流定位在光路中心，使所述四分之一波 片與光軸垂直，以實現在P偏振分量和S偏振分量間輪流附加90°和-90°的相位差。
6.如權利要求3所述的基於SPR幹涉成像的生物分子相互作用的檢測系統，其特徵在 於，所述擴束裝置的擴束倍數為2-8倍。
7.如權利要求3所述的基於SPR幹涉成像的生物分子相互作用的檢測系統，其特徵在 於，其中，所述生物傳感單元利用表面等離子體共振的原理，包括直角或梯形的稜鏡、傳感 晶片和置於所述傳感晶片與所述稜鏡之間的折射率匹配液，其中所述稜鏡、折射率匹配液 和傳感晶片基底的折射率相同，且所述傳感晶片表面鍍有30-50nm厚的金膜。
8.如權利要求3所述的基於SPR幹涉成像的生物分子相互作用的檢測系統，其特徵在 於，其中，在所述金膜表面通過化學方法修飾有一層親水的自組裝膜。
9.如權利要求3所述的基於SPR幹涉成像的生物分子相互作用的檢測系統，其特徵在 於，其中，所述反射臂包含偏振稜鏡和成像鏡頭，該鏡頭將金膜表面的幹涉圖像成像在CCD 靶面上。
10.如權利要求3所述的基於SI^R幹涉成像的生物分子相互作用的檢測系統，其特徵在 於，其中，所述信號採集處理單元包含CCD或CMOS、以及計算機，從所述CCD上採集到的所述 成像幹涉圖像被輸入所述計算機，所述計算機利用相鄰2幀所述成像幹涉圖像計算出折射 率分布。
全文摘要
本發明公開了一種生物分子相互作用的檢測方法，包括以下步驟1)獲取準直光；2)使所述準直光的P偏振分量和S偏振分量之間的相位差被交替調製成為90°或-90°；3)使經相位調製的光再入射到生物傳感單元從而激發表面等離子體共振，並使光由此反射；4)使所述反射光中的P偏振分量和S偏振分量發生幹涉，產生幹涉圖像；5)使所述幹涉圖像成像，並採集成像幹涉圖像；6)交替採集附加90°和-90°相位差後產生的成像幹涉圖像；7)利用所採集到的相鄰的2幀成像幹涉圖像計算反映折射率分布的分布函數。根據本發明，通過連續測量可以實時得到折射率分布隨時間變化信息。
文檔編號G01N21/45GK101915750SQ20101022737
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月7日 優先權日2010年7月7日
發明者餘興龍, 王大千, 羅昭鋒, 鄧焱 申請人:清華大學