一種他立韋林的製備方法
2023-05-23 07:32:06 1
專利名稱：一種他立韋林的製備方法
技術領域：
本發明涉 及醫藥技術領域，特別是他立韋林的一種新的製備方法。
背景技術：
他立韋林(Taribavirin,商品名viramidine)的化學名稱是I-P-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-甲脒鹽酸鹽，為核苷類似物，是一種能通過腺苷脫氨酶作用轉化為利巴韋林的前藥，用於治療C肝。與利巴韋林相比，他立韋林可降低慢性C肝患者的貧血發生率，同時可使持續病毒學應答增加。他立韋林具有更小的副作用以及更好的療效，有可能取代利巴韋林成為安全有效的慢性C肝治療藥物。目前，他立韋林的合成主要為化學法。化學法參見文獻(Journal of MedicinalChemistry, 16(8), 935 937(1973) ； Journal of Medicinal Chemistry, 32(7), 1447 1449(1989) ;W02001/060379)。這類方法採用利巴韋林或者四乙醯核糖為起始原料，價格昂貴；縮合反應溫度高達150°C或以上，並且成熔融狀態，工業生產難以操作；反應及純化步驟繁瑣，副產物多，產率低，綜合成本高；大量使用有機溶劑，安全環保要求高。上述表明，採用現有技術，需要利用核苷製備四乙醯核糖或者製備利巴韋林作為起始原料，增加成本，並且安全環保要求高，其工業化受到了成本和安全環保的限制。
發明內容
為了克服現有技術的不足，本發明的目的在於提供了一種他立韋林的製備方法，工藝簡便，生產成本低廉，產物得率高。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是一種他立韋林的製備方法，採用乙酸短桿菌Brevibacterium acetylicum ATCC39311菌株作為菌種,包括如下步驟A、將菌種先進行發酵得菌種發酵液，再將菌種發酵液進行催化底物反應，所述的催化底物反應是指在菌種發酵液中加入底物，在55°C 65°C進行酶催化反應20小時 25小時得催化反應液；B、催化反應液的後處理步驟A催化反應結束後，加入與催化反應液相比，其重量百分含量為0. I 2. 5%活性炭，助濾除菌，濾液真空減壓濃縮到有固體析出，冷卻到10土1°C，過濾除去固體雜質，濾液加入0. 3 I. 0倍體積乙醇，冷卻結晶，5±1°C過濾收集濾餅，60±5°C下真空乾燥，得到I- ^ -D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-氰基；C、氨解反應與純化在耐壓反應釜中加步驟B的1-0 -D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-氰基、氯化銨和氨甲醇溶液，且氨甲醇溶液的濃度是10%，30°C 50°C反應15小時 36小時；真空減壓濃縮至幹，加入自身濃度為90%乙醇溶液結晶，抽濾，濾餅烘乾，得到他立韋林。進一步在上述他立韋林的製備方法中，所述步驟A的酶反應底物是核苷和3-氰基-1，2，4-三氮唑；核苷濃度為10mmol/L 600mmol/L ;所述核苷與3-氰基-1，2，4-三氮唑的摩爾比是I: I I: I. 5 ;所述的核苷是肌苷、鳥苷或腺苷中的一種或者兩種。所述步驟C各物質的摩爾比為I- ^ -D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-氰基氯化銨等於I: I. 0 I I. 5，所述氯化銨與氨甲醇溶液的摩爾比為1:3. 8 1:4. 2。所述步驟A菌種發酵是指將菌种放入菌種培養基進行發酵處理，所述菌種培養基的重量百分比配製為葡萄糖0. 1%
I.0%,酵母粉I. 0% 5. 0%,磷酸氫二鉀0. 35% I. 50%,磷酸二氫鉀0. 15% I. 50%,氯化鈉0. 15% I. 00%,自來水90. 00% 98. 25%,發酵液pH值控制在6. 0 6. 9。所述步驟A菌種發酵的發酵控制是採用發酵罐通風發酵；罐壓為0. 010 0. 015MPa，發酵溫度為35°C 40°C，發酵時間為25小時 35小時。本發明所涉及的乙酸短桿菌Brevibacterium acetylicum ATCC39311菌株(公知菌株)，購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,簡稱ATCC,網tit http://www. atcc. org/)。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果I)菌種發酵液催化反應相比化學法條件溫和。其特徵為採用酶液催化縮合反應，
生成I- ^ -D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-氰基。2)原料成本低。其特徵為採用大規模發酵生產的核苷為起始原材料，比現有技術中的四乙醯核糖或者製備利巴韋林容易獲取，價格低廉。3)步驟簡便。其特徵為採用菌種發酵液直接進行下一步催化反應，不需要分離收集菌體，簡單方便，並且可以繼續利用其中的磷酸鹽作為緩衝液。4)他立韋林總收率高，達到87. 5% 91. 5%。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明的內容作進一步詳述,實施例中所提及的內容並非對本發明的限定，製備過程中各個原材料的選擇可因地制宜而對結果並無實質性影響。實施例II.菌種發酵液培養基的配製葡萄糖0. 5%，酵母粉4. 5%，磷酸氫二鉀0. 8%，磷酸二氫鉀0. 3%，氯化鈉0. 2%，用自來水配製，發酵液pH值控制在6. 8 ；2.菌種發酵液的發酵控制採用30L發酵罐，將菌種接入發酵培養基，通風發酵；罐壓為0. 012MPa，發酵溫度為36°C，發酵時間為26小時；3.菌種發酵液催化底物反應在3L三口瓶中加入IL上述菌種發酵液、21. 46g (80mmol)肌苷和7. 53g (80mmol)3-氰基-1，2，4-三氮唑，攪拌加熱，在60°C溫度下進行酶催化反應24小時；催化反應過程中採用TLC (展開劑，乙酸乙酯異丙醇氨水=2:4:1)監控反應情況。4.催化反應液的後處理酶催化反應結束後，在反應液中加入2. Og活性炭，攪拌，抽濾，濾餅棄去，濾液真空減壓濃縮到約200ml，有少量固體析出；取出攪拌降溫，冷卻到10°C，抽濾，除去固體雜質；濾液加入0. 5倍體積乙醇，攪拌冷卻結晶，5 °C過濾收集濾餅，60 °C真空乾燥，得到I-^-D-呋喃核糖基-1H-1, 2，4-三氮唑-3-氰基 17. 19g (95%)。5.氨解反應與純化在耐壓反應釜中加入11. 31g (50mmol) 1-3-0-呋喃核糖基-111-1，2，4-三氮唑-3-氰基、2. 67g (50mmol)氯化銨和200ml氨甲醇溶液，35°C反應24小時；真空減壓濃縮至幹，加入IOOml90%乙醇溶液結晶，抽濾，濾餅烘乾，得到他立韋林13. 42g (96%)，熔點177-179°C;按照高效液相色譜法檢測純度為99. 5% ;檢測方法和條件如下(下面的實施例使用相同的方法和條件)儀器高效液相色譜儀(Agilent 1200)色譜柱BDSC18 4. 6mmx250mm 5 u m流動相5%甲醇 +95%50mmol/L(NH4)H2P04流速lml/min波長216nm實施例2I.菌種發酵液培養基的配製葡萄糖0. 5%，酵母粉4. 0%，磷酸氫二鉀0. 8%，磷酸二氫鉀0. 3%，氯化鈉0. 2%，用自來水配製，發酵液pH值控制在6. 8 ；2.菌種發酵液的發酵控制採用30L發酵罐，將菌種接入發酵培養基，通風發酵；罐壓為0. 012MPa,發酵溫度為36°C，發酵時間為30小時；3.菌種發酵液催化底物反應 在3L三口瓶中加入IL上述菌種發酵液、22. 66g (80mmol)鳥苷和7. 53g (80mmol)3-氰基-1，2，4-三氮唑，攪拌加熱，在60°C溫度下進行酶催化反應24小時；催化反應過程中採用TLC (展開劑，乙酸乙酯異丙醇氨水=2:4:1)監控反應情況。4.催化反應液的後處理酶催化反應結束後，在反應液中加入2. Og活性炭，攪拌，抽濾，濾餅棄去，濾液真空減壓濃縮到約200ml，有少量固體析出；取出攪拌降溫，冷卻到10°C，抽濾，除去固體雜質；濾液加入0. 5倍體積乙醇，攪拌冷卻結晶，5°C過濾收集濾餅，60°C真空乾燥，得到I-^-D-呋喃核糖基-1H-1, 2，4-三氮唑-3-氰基 17. 37g (96%)。5.氨解反應與純化在耐壓反應釜中加入11. 31g (50mmol) 1-3-0-呋喃核糖基-111-1，2，4-三氮唑-3-氰基、2. 67g (50mmol)氯化銨和200ml氨甲醇溶液，35°C反應24小時；真空減壓濃縮至幹，加入IOOml90%乙醇溶液結晶，抽濾，濾餅烘乾，得到他立韋林13. 28g (95%)，熔點177-179°C ;按照高效液相色譜法檢測純度為99. 6%。
權利要求
1.一種他立韋林的製備方法，採用乙醯短桿菌Brevibacterium acetylicumATCC39311菌株作為菌種，其特徵在於包括如下步驟 A、將菌種先進行發酵得菌種發酵液，再將菌種發酵液進行催化底物反應，所述的催化底物反應是指在菌種發酵液中加入底物，在55°C 65°C進行酶催化反應20小時 25小時得催化反應液； B、催化反應液的後處理步驟A催化反應結束後，加入與催化反應液相比，其重量百分含量為O. I 2. 5%活性炭，助濾除菌，濾液真空減壓濃縮到有固體析出，冷卻到10土1°C，過濾除去固體雜質，濾液加入O. 3 I. O倍體積乙醇，冷卻結晶，5± I °C過濾收集濾餅，60±5°C下真空乾燥，得到l-β -D-呋喃核糖基-1Η-1，2，4-三氮唑-3-氰基； C、氨解反應與純化在耐壓反應釜中加步驟B的1-0-0-呋喃核糖基-1!1-1，2，4-三氮唑-3-氰基、氯化銨和氨甲醇溶液，30°C 50°C反應15小時 36小時；真空減壓濃縮至幹，加入濃度為90%乙醇溶液結晶，抽濾，濾餅烘乾，得到他立韋林。
2.根據權利要求I所述的他立韋林的製備方法，其特徵在於所述步驟A的酶反應底物是核苷和3-氰基-1，2，4-三氮唑；核苷濃度為lOmmol/L 600mmol/L ;所述核苷與3-氰基-1，2，4-三氮唑的摩爾比是I: I I: I. 5 ;所述的核苷是肌苷、鳥苷或腺苷中的一種或者兩種。
3.根據權利要求2所述的他立韋林的製備方法，其特徵在於所述步驟C中I-β-D-呋喃核糖基-1Η-1，2，4-三氮唑-3-氰基與氯化銨的摩爾比為I: I. O I: I. 5。
4.根據權利要求I所述的他立韋林的製備方法，其特徵在於所述步驟A菌種發酵是指將菌种放入菌種培養基進行發酵處理，所述菌種培養基的重量百分比配製為葡萄糖O.1% I. 0%,酵母粉I. 0% 5. 0%,磷酸氫二鉀O. 35% I. 50%,磷酸二氫鉀O. 15% I. 50%,氯化鈉O. 15% I. 00%，自來水90. 00% 98. 25%，發酵液pH值控制在6. O 6. 9。
5.根據權利要求4所述的他立韋林的製備方法，其特徵在於所述步驟A菌種發酵的發酵控制是採用發酵罐通風發酵；罐壓為O. 010 O. 015MPa，發酵溫度為35°C 40°C，發酵時間為25小時 35小時。
全文摘要
本發明公開了一種他立韋林的製備方法，採用乙醯短桿菌Brevibacterium acetylicum ATCC39311菌株作為菌種，包括如下步驟A、將菌種先進行發酵得菌種發酵液，再將菌種發酵液進行催化底物反應；B、催化反應液的後處理； C、氨解反應與純化。與現有技術本相比，本發明具的優點和效果是1)菌種發酵液催化反應相比化學法條件溫和。2)原料成本低。3)步驟簡便。4)他立韋林總收率高，達到87.5%～91.5%。
文檔編號C12R1/13GK102978264SQ20121045840
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者任洪發, 魯立, 鄭明英, 歐仁樹, 林曉, 黃桂基, 寧異真 申請人:廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司