疫苗或與其相關的改進的製作方法

2023-05-23 14:35:51

專利名稱：疫苗或與其相關的改進的製作方法
技術領域：
本發明涉及疫苗或與其相關的改進，具體地說，涉及一種用於如含有合成抗原的疫苗的新佐劑。
許多成功的人用和獸用疫苗都使用減毒的活病原體。然而，近年來對大範圍病原體感染的研究已能夠分辨出潛在保護性種屬特異性抗原，這些抗原能用重組DNA技術和改良的培養，收穫和純化技術大批量地生產。生產模擬天然抗原(亞單位疫苗)重要表位的全合成肽抗原現在也是可行的。使用計算機模擬技術可以設計出適宜的肽。這種人造疫苗具有許多潛在的優點，包括純淨、穩定、保護水平高，特異和確保無任何病原體性質(這些性質有時在含有減毒病原體的疫苗上觀察到)。
不足的是，不論用化學合成還是重組方法製備的低分子量抗原都存在一種固有的低抗原性;通常，它們是免疫反應的弱激活劑。即使與一個載體蛋白如純化的結核菌素蛋白衍生物(PPD)結合，它們的免疫原性也常常不足以誘發足量的反應。
使用佐劑能夠克服這個問題，但是，這種佐劑帶來進一步的困難。目前準許用於人的佐劑只有氫氧化鋁。然而，由於它不能促進細胞調節免疫(CMI)(成功抗細胞內病原體如利什曼和弓形體的疫苗的一種本質特性)，所以氫氧化鋁不被認為是一種對所有抗原都適當的佐劑。弗氏完全佐劑(FCA)確實能夠刺激細胞免疫，但是由於它促進肉芽瘤的形成，粘連和其它毒副作用而不適合人用或獸用。FCA還會引起持續數月的局部炎性反應。迫切需要能提高細胞免疫力(CMI)，尤其與用FCA觀察到的水平類似的非毒性新佐劑。確實，如果認識到(realised)亞單位疫苗的全部潛力，這種佐劑將是必要的。
現在我們已經發現包裹有抗原的非離子表面活性劑囊(泡)能用作有效的免疫佐劑，即使使用短肽抗原，它也固有地激發弱的免疫反應。我們確實觀察到它與使用FCA作佐劑相比，抗體效價的數量級相同，T細胞刺激指數率較高，然而，不存在毒性。而且，免疫反應可能在質量上和數量上改變，這在後面作更詳細的討論。
最為熟悉的囊(泡)是有磷脂雙層的脂質體。然而，其它兩親分子(包括非離子型表面活性劑(NIS))也能被製備形成囊(泡)。這種NISV確實已經被建議用作了藥物載體，例如，作抗癌劑的氨甲蝶呤和doxorubicin。但是，我們並沒有完全清楚即使當單獨抗原只能誘發一個最小反應時，NISV也能極大地加強這種肽疫苗的反應的所有原因。
因而，一方面我們的發明提供了一種疫苗，它含有至少一種包裹於NISV中的抗原，特別是合成或重組來源的一種肽。
另一方面我們的發明是一種增強至少一種抗原在哺乳動物或非哺乳動物中的免疫反應的方法，包括使用包裹在NISV中的至少一種所說的抗原。
我們的發明另一個目的是一種製備疫苗的方法，包括把至少一種抗原，(如合成或重組起源的肽)包裹在NISV中。
用於製備NISV的非離子表面活性劑可以是任何藥理學上可接受的具有適當表面活性性質的物質。這種物質優選的例子是甘油酯類。這種甘油酯類可以包含一種或兩種高級脂肪族醯基。例如，在每個醯基部分含有至少10個碳原子。優選甘油單酯類，特別是含C12-C20鏈烷醯基或鏈烯醯基(例如己醯基，月桂醯基，肉豆蔻醯基，棕櫚醯基、油基或硬脂醯基)部分的那些。最佳的表面活性劑是1-棕櫚醯基甘油酯。
含醚鍵的表面活性劑也可以用作為本發明的NISV所包括的非離子型表面活性劑。這類物質的優選例是基於甘油或甘醇，尤其是4個碳原子以下的低級脂肪族甘醇，最佳為1，2-亞乙基二醇的含醚鍵的表面活性劑。以這種甘醇為基礎的表面活性劑可以含一個以上的甘醇單元，優選的是不多於5個甘醇單元，最佳的為2或3個甘醇單元。例如二甘醇鯨蠟醚或聚氧乙烯基-3-月掛醚。甘醇或甘油單醚是優選的，特別是含C12-C20鏈烷基或鏈烯基例如辛基、月掛基、肉豆蔻基、鯨蠟基、油基或硬脂烷基部分的那些。
可用於本發明的環氧乙烯縮合產物含括在WO88/06882中公開的那些，即，聚氧乙烯高級脂肪族醚類和胺類表面活性劑，特別優選的含醚鍵的表面活性劑是1-單鯨蠟基甘油醚和二甘醇鯨蠟基醚。然而，為用於本發明必須選擇藥理學上可接受的物質，優選那些在哺乳動物體中容易被生物降解的。為此，我們推薦用前面已提到的甘油酯來製備囊(泡)，以通過皮下，肌肉內，表皮內或腹膜內注射給藥，或者通過黏膜如口腔的，鼻的、支氣管的、泌尿生殖的或直腸的方式給藥，優選口腔給藥。
為了形成有效囊(泡)，將需要把非離子型表面活性劑與一種能形成雙層結構的適宜的高分子量疏水性物質(特別是一種甾族化合物，如一種甾醇象膽甾醇)混合。這種甾族化合物的存在有助於形成決定囊(泡)生理特性的雙層結構。
NISV可以摻合一種產生電荷的兩親物。使NISV帶有一個負電荷。酸性物如高級鏈烷和鏈烯酸(例如棕櫚酸，油酸);或其它含有酸性基團的化合物，例如，磷酸酯象二烷基、最好是聯(高級烷基)磷酸酯，例如聯十六烷基磷酸酯，或磷脂酸或脂醯絲氨酸;或者磺酸-酯如磺酸高級烷酯，例如，磺酸鯨蠟酯，都可以用於這種目的。
這種甾族化合物可以例如含有非離子型表面活性劑的20-120%(重量百分比)，優選60-100%。產生一個負電荷的兩親物可以例如含有非離子型表面活性劑的1-30%(重量百分比)。
產生電荷的兩親物穩定該囊(泡)的結構並提供有效的擴散。
非離子型表面活性劑和形成膜的疏水性物質可以通過剪切力存在下的水合作用轉變為非離子型表面活性劑囊(泡)。使用的這種剪切力的設備是已知的，適宜儀器例如在WO88/06882中提到的。聲處理和超聲處理也是形成非離子型表面活性劑囊(泡)或改變它們顆粒大小的有效方法。
Collins等在J.Pharm.Pharmocol.42，53(1990)中公開一種生產NISV的有效方法。它包括把非離子型表面活性劑，甾族化合物和兩親物(如果使用的話)的混合物融化並在含水緩衝液存在下強烈攪拌使水合。然後在升高的溫度(足以使形成的NISV混合物保持在融化狀態)下，把這種混懸液擠壓多次通過多微孔的聚碳酸酯膜。
從一種有機溶劑，例如，一種烴或氯化烴溶劑象氯仿中蒸發環形膜也能形成NISV。然後可把所得薄膜在有抗原和任意其它表面活性劑存在的磷酸鹽緩衝液中水合(RussellandAlexander，J.Immund、140.1274(1988))。在這種情況當中，NISV形成的同時抗原也被包裹在其中，使用已知分離方法，如用凝膠過濾或離心分離(例如超離心分離法)通過清洗把囊(泡)外的抗原從囊(泡)混懸液中除去。
把抗原包裹進位備好的NISV的方法是脫水-再水合方法(KirbyandGregoriadis，Biotechnology2979(1984))，其中把水相中的抗原包裹進已製備好的囊(泡)中是用急驟冷凍接著升華乾燥和冷凍-融化技術(Pick，Arch、Biochem、Biophys、212，195(1981))。在後一種技術中，把囊(泡)與抗原混合併在液氮中反覆急驟冷凍並且例如加溫到60℃(即，相關表面活性劑的臨界溫度之上)。
把囊(泡)可作進一步處理來除去任何沒有被包裹進去的抗原，例如，衝洗和離心分離。應該注意到我們的結果清楚地表明單獨非離子型表面活性劑並不是有效的佐劑，也就是說，囊(泡)的形成對獲得理想的有效作用是必要的。如果要達到所要求的佐劑效果必須把抗原包裹在非離子型表面活性劑囊(泡)中。
抗原優選含有例如8-50，最好為10-20個胺基酸單位的合成或重組來源的肽。這種抗原可以模擬病原生物體的一個或多個B細胞，或B細胞和T細胞的表位，從而使疫苗能誘發中和抗體抵抗那種病原生物體(參見，例如，我們的WO88/10267和WO91/13909中的HIV合成抗原的說明書)。
從另一方面來說，這種肽能夠誘發抗其它生物活性物質，特別是具有激素活性的物質的免疫反應。後一類型的例子是誘導內源黃體化激素(endogenousluteinisinghormone)-釋放激素(LHRH)的免疫反應。能例如被用於農場動物雄激素抑制或免疫去勢的治療以及雄激素敏感的或雌(甾)酮敏感的惡性腫瘤的治療(參見我們的GB-B-2196969)。包裹在NISV中用作疫苗的這種肽抗原自身常具有足夠的免疫原性;特別是在該肽含有很好識別的表位並包含大約至少12個，最好是至少15個胺基酸殘基時的情況下。
在有些情況下，最好是把這種肽與一種載體結合來增強它的免疫原性。適宜的載體是本領域熟知的，例如，蛋白載體象結核病菌素的淨蛋白衍生物(PPD)，破傷風類毒素，霍亂毒素質和它的B亞單位，卵清蛋白，牛血清清蛋白，大豆胰蛋白酶抑制劑，胞壁醯二肽和它們的類似物，以及Braund′s脂蛋白。當使用結核菌素淨蛋白衍生物(PPD)作載體時，如果疫苗受體藉助早期BCG接種已對結核菌素敏感，就會得到較高的抗體效價。
使用藥學上常規的方法能把這種包裹在NISV中的抗原製備成疫苗，如懸浮在一個無菌的非腸道可接受的含水載體中。
儘管合成或重組肽是用於本發明最好的抗原，但是當把蛋白抗原包裹在NISV中時也能觀察到一個強的佐劑作用。例如，使用牛血清清蛋白(BSA)作抗原已獲得強陽性結果，更加顯著的是，通過免疫接種兔弓形蟲的破裂細胞上清液，用非離子型表面活性劑囊(泡)佐劑接種已證明有抗弓形體病的有效保護作用。
我們已經發現皮下接種通常是注射給藥的最有效的方法，特別是常比腹膜內給藥更有效。肌肉內和表皮內注射也是有效的，也許因為它導致了在注射部位形成抗原貯存。儘管這樣，注射部位沒有發生由FCA經常產生的慢性炎症反應。注射給藥能誘發一個全身免疫反應，也就是，既有體液又有細胞調節免疫。在一個黏膜表面(如鼻)接種預料在其它黏膜表面(如支氣管)引起起一種黏膜免疫反應。按照本發明該疫苗也能黏膜線路給藥。
按照我們發明的其它意外且有價值的特徵，當口服包裹在NISV中的抗原時通常會產生一種有效水平的免疫反應。Niosomes似乎至少在某種程度上能保護抗原不被胃腸道消化，穿過腸壁不發生變化，這樣獲得迄今僅是胃腸外給藥所能獲得的結果。
因此，本發明提供了一種製備一種作為口服活性疫苗的抗原的方法，包括把所說的抗原包裹在NISV中。
通過口服例如一種合成肽獲得佐劑效果的能力是本發明疫苗的最大有效特點，也是現有技術中從未完成的特徵。口服途徑給藥比現有的注射途徑給藥有許多優點，避免了伴隨注射的象源於使用沒有滅菌的針頭引起的注射危害。除誘導一個全身免疫反應外，口服也可以誘導一種黏膜反應。這種黏膜反應在抗許多病原體如HLV，弓形體的免疫保護作用中被認為是重要的。此外，對患者來說對口服的組合物有更高的可接受性。
在製備用作疫苗特別是口腔給藥的囊(泡)中，優選含酯鍵的表面活性劑，儘管也可使用含醚鍵的表面活性劑特別是1-鯨蠟酸甘油醚和二甘醇鯨蠟酸醚。已經發現醚鍵比相應的酯鍵酸穩定性更大並被認為它在哺乳動物的胃的酸性環境中有更大的經受分解的能力。
由本發明新疫苗引起的免疫反應的進一步分析意外地表明比例較高的抗體是與釋放IL-2和IFN-r有關的IgG2a型抗體。這些細胞分裂素由CD4+T淋巴細胞的Th1子集分泌。高水平的IgG2a被以為與細胞調節免疫的發生有關。另一方面，氫氧化鋁優選刺激Th2細胞，引起IgG1抗體的產生，而且通常與提高細胞調節免疫有關的弗氏完全佐劑也產生較高的長期性的IgG1抗體效價。Th2細胞不僅是IgG1而且是IgE合成的主要調節節(由IL-4分泌)。因而持續產生原生質中的高水平IgG1是不理想的因為它也表明IgE的過度產生。
近來離體研究已經證實Th1和Th2細胞具有不同的處理抗原的要求。Th1細胞需由巨噬細胞提供抗原而Th2細胞則可最好被B-細胞提供的抗原所刺激(Gajewski等，Immund，Rer，Ⅲ，79(1989)和Gajewski等，J.Immund，146，1750(1991)。巨噬細胞似乎能攝取脂質體並因此包裹在囊(泡)中的抗原將有助於Th1的激活和ThG2a抗體的合成，導致高水平的CMI。
我們的結果表明按照本發明的新疫苗能誘發IgG2a的效值，開始遠大於由弗氏完全佐劑所產生的，但過一段時間最終與弗氏完全佐劑所產生的效價相類似。按照本發明對疫苗的初始反應與由弗氏完全佐劑所得到的相比似乎相對於Th2淋巴細胞來說優先激發Th1淋巴細胞。我們的結果還表明使用本發明疫苗所獲得的誘發的IgG1效價是與弗氏完全佐劑所產生的效價同級的，因此本發明疫苗在調節體液免疫方面也是有用的。
因此我們發明的另外一方面是配製至少一種抗原以通過Th1T淋巴細胞通道刺激抗體產生的方法，它包括把所說的至少一種抗原包裹在非離子型表面活性劑囊(泡)中。
按照本發明的抗原配方也能經Th2T淋巴細胞通道刺激抗體產生。這種抗原可配方成與經Th2T淋巴細胞通道刺激抗體產生相比優先經Th1T淋巴細胞通道刺激抗體的產生，特別是與使用弗氏完全佐劑產生的抗體水平相比較時。
而且，用NISV強化的疫苗免疫接種激發的抗體效價實際上高於使用弗氏完全佐劑(FCA)所獲得的，而完全避免了弗氏完全佐劑的強毒性作用。所以我們的發明的另一方面是把至少一種抗原的免疫原性提高到至少等同於使用弗氏完全佐劑所獲得的水平的方法，包括把所說的至少一種抗原包裹進NISV中。
NISV可認為是用於抗那些需要細胞或體液免疫的疾病的疫苗的理想佐劑。作為佐劑的NISV(特別是含有醚鍵的表面活性劑的那些)的另一個主要優點是在一般的外界環境條件下的穩定性。特別是它們不經歷與蛋卵磷脂為基礎的脂質體相同方式的破壞性自氧反應。
NISV作為佐劑用於疫苗的另一個重要優點是與現有技術中佐劑相反，NISV基本上無毒。我們已經發現給小鼠腹膜內注射包裹在含1-單棕櫚醯基甘油酯(monopalmitoylglycerolester)的囊(泡)中的LHRH類似物LHRH-Gly-Gys(如我們的EP-A-0293530中所述的)沒有引起任何毒副作用，特別是與弗氏完全佐劑或甚至鋁凝膠有關的毒副作用。在實驗動物中沒有觀察到可察覺的病狀。
按本發明完成的疫苗主要適用於哺乳動物，因而在人用和獸用藥物領域中能夠應用。我們也觀察到NISV對一些非哺乳動物象，魚和家禽的接種，也是一個有效的佐劑。
以下實施例詳細說明NISV的佐劑特性。
實施例1-用LHRH-Gly-Cys-PPDNISV組成物免疫小鼠摩爾比為5∶4∶1的非離子型表面活性劑，膽甾醇和磷酸聯十六烷酯(Sigma，Poole，Dorset，OK)，混合製備囊(泡)。下列顯示微摩爾數和重量毫克數
用Collins等(在上)的技術製備囊(泡)。接著在Metter電子水浴近距離聲波定位器(50
，Pasadena，(A)中把囊(泡)製劑在20℃下聲處理5分鐘。在我們的EP-A-0293530中描述了抗原LHRH-Gly-Cys，一種促黃體激素(Luteinising hormone)一釋放激素的類似物。用於Kirby和Gregoriadis描述的脫水一再水合技術(Biotechndogy，2，979(1984))。把抗原包入製備好的囊(泡)中。簡單地說，在聚丙烯離心管(Elkay Produets，Inc.，Shrewsbury，MA)中把5ml(150μ mol)囊(泡)溶液與1ml PBS中的抗原(0.5mg/ml)混合，在液氮中用旋轉方法急驟冷凍為薄層。然後在冷凍乾燥器中把製劑在0.1乇下凍幹過夜，再用0.5ml蒸餾水
水合。剩餘試樣持續30分鐘，然後用蒸餾水加至6ml。
a)用有和沒有BCG起動及佐劑的LHRH-Glys-Cys-PPD免疫給人組雄性CopenhagenFisherF，雜交鼠腹膜內注射0.2ml的LHRH-Cly-Cys-PPD磷酸緩衝生理鹽水、包裹在NISV中的LHRH-Gly-Cys-PPD、在FCA中的LHRH-Gly-Cys-PPD乳化液和吸附在氫氧化鋁上的LHRH-Gly-Cys-PPD。每支注射液載有的LHRH-Gly-Cys的量在生理鹽水，FCA/FIA和釩中是50μg，在NISV中是5μg。
在首次注射(LHRH-Gly-Cys-PPD結合的前4周給四組小鼠首先注射BCG。四次結合液的注射總共有兩周的間隔。
抗LHRH抗體的測定用ELISA方法測定間隔獲得的血漿試樣中的抗LHRH抗體。在96孔級的組織培養微量滴定板上以0.1μg/孔塗LHRH-Gly-Cys-BSA(在PBS中，pH7.2)並在37℃培養1小時。把這些孔按上述方法清洗並把用PBS稀釋的50μl試樣加到相同孔中。把試樣在37℃下培養1小時，如前清洗這些孔。把50μl的用PBS稀釋到1∶5000的辣根過氧化物酶羊抗鼠IgG軛合物(Sigma)的等分試樣加到每個孔上在如上清洗前在37℃下培養45分鐘。底物溶液的製備是把4μl過氧化氫和250μl的貯備在二甲基亞碸中的四甲基聯苯胺(6mg/ml)加到25ml的0.1M乙酸構櫞酸緩衝液(pH5.5)中。
在室溫黑暗中培養5分鐘前每個孔中盛有100μl所加的底物物。加入10%硫酸中止反應並測量在450nm處的吸收。ELISA的結果用陽性對照的百分值表示。整個測定中使用的恆定標準以便能進行內和處對照。這個恆定標準是一個許多用在FCA中的LHRH-Gly-Cys-PPD免疫的大量鼠的血清池。這個陽性對照有一個100%的任意值。
結果ELISA的結果在

圖1和圖2中顯示。圖1描述了用LHRH-Gly-Cys-PPD與生理鹽水(A)，niosomes(B)，弗氏完全和不完全佐劑(C)以及氫氧化鋁(b)的軛合物免疫的Copenhagen-Fisher雄性鼠的抗體反應。儘管使用FCA/FIA或釩時對LHRH-Gly-Cys的抗體反應似乎較大，但使用這些佐劑的肽的用量比摻到NISV中時多10倍。因此，NISV表現出比氫氧化鋁或弗氏完全佐劑在輔助較低量的肽軛合物上有更強的作用。圖2顯示了起動對LHRH-Ghy-Cys-PPD軛合物的抗體反應的BCG的作用。用和不用起動均可看到相似數量的免疫反應。而且用FCA和釩所得到的抗體效價比較高。然而，使用這些佐劑時免疫原的給藥量是用NISV的十倍。
b)為了更精確地證實NISV的佐劑作用，在被注射在FCA中的LHRH-Ghy-Cys-PPD和在如上所述製備的NISV囊(泡)中的LHRH-Ghy-Cys-PPD的BALB/C鼠中測量了等量抗原的抗體反應。
用LHRH-Ghy-Cys-PPD免疫給3隻雄性BALB/C小鼠皮下注射0.2ml在FCA中的LHRH-Gly-Cys-PPD(PBS中軛合物FCA的體積比為1∶1)。兩周後用皮下注射0.2ml在FIA中的LHRH-Gly-Cys-PPD(PBS中的共軛物∶FIA體積比為1∶1)增加小鼠用藥量。
給5隻雌性BALB/C小鼠類似地皮下注射0.2ml包裹在NISV中的LHRH-Gly-Cys-PPD並在兩周後再用0.2ml增加劑量。沒有使用BCG起動。每次注射給藥等量於100μgLHRH-Gly-Cys-PPD。
抗-LHRH抗體的測定在第二次免疫接種後一周取尾部放出的血液，把血清試樣匯集起來，用基本上如上所述的ELISA方法測定總抗體反應，但是用系列稀釋液來確定終止效價。
結果結果如圖3所示。能清楚地看到在同等免疫試樣下，NISV是一個強烈的佐劑，並能誘發比用FCA所獲得的更高的特異抗體水平。
圖1和圖2的圖解A沒有佐劑(生理鹽水)BNiosomesCFCA和FIAD氫氧化鋁箭頭表示免疫的時間。
圖1LHRH-Gly-Cys-PPD圖2BCG+LHRH-Gly-Cys-PPD圖3LHRH-Gly-Cys-PPD實施例2用牛血清清蛋白(BSA)免疫鼠從實施例1所描述組分用實施例1所描述的方法或者用旋轉薄膜蒸發法從氯仿中製備囊(泡)。在PBS和抗原(5mg/ml)中或用洗滌劑(1%辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷，Sigma)和PBS中的抗原(5mg/ml)把所得到的膜水合。(如Rllseel和Alexander(見上)所描述的有關脂質體的方法)。為除去洗滌劑(如使用了的話)和任何未包裹的抗原，把製備物以84000克40-45分鐘離心並使顆粒懸浮於PBS中。重複清洗兩次。
在每組中使用4到5隻8-10周齡的BALB/C鼠。在第一天，各組小鼠皮下或腹膜內注射包裹BSA的NISV(NISV/BSA)，或BSA的FCA乳化液(FCA+BSA∶Sigma)，在每隻注射液中的BSA的最終濃度為0.5mg/ml並且每隻鼠接受100μg劑量的BSA。在第二次激發之前14天給小鼠初次注射。在圖4的柱狀圖中的14、28等天是指第二次激發後的時間。
用ELISA測定抗BSA抗體水平。圖4中，(a)部分代表IgG1抗體效價，和(b)部分表示IgG2a的效價。畫有斜線的柱狀圖是指NISV/BSA而實心柱狀圖是指BSA+FCA。在(a)和(b)每一種情況中圖左邊方柱表示腹膜內注射所得到的結果，而右邊方柱表示皮下注射所獲得的結果。
將會看到用腹膜內接種，FCA+BSA產生了非常高的IgG1效價，維持到70天;NISV/BSA的效價則隨時間下降。用皮下給藥，NISA/BSA免疫開始產生高於FCA的效價，但到70天，這些效價已下降到遠低於用FCA+BSA所獲得的效價。
與此相反，在圖(b)部分對IgG2a的試驗表明不論用腹膜內還是皮下方式NISV/BSA誘發的最初效價遠遠高於由FCA+BSA所得到的，但是到70天，由於由FCA+BSA產生的IgG2a水平隨時間增加，兩種佐劑配方產生的效價相似。
引人注意的是，在皮下注射FCA後觀察到的肉芽瘤的形成在注射NISV後完全沒有出現。
實施例3從各種表面活性劑中製備的NISV的佐劑活性從(a)1-單棕櫚醯基甘油酯(MPG)(如實施例1和2中的)或(b)聚氧乙烯-3-月桂醚(POE)二者之一，按實施例1所述的表面活性劑∶膽甾醇∶磷酸聯十六烷酯5∶4∶1製備NISV。按實施例2中所述的方針對8-10周齡雌性BALB/C小鼠組(每組5隻)，在第一天皮下注射包裹於NISV中的BSA或在PBS乳化液中的BSA二者之一。在第二次激發後14、35和70天用ELISA測定總Ig，IgG1和IgG2a的水平。為便於分析，把血漿稀釋到1/8000分析總抗體效價，1/15000分析IgG1，1/1000分析IgG2a，並且個體鼠血漿中存在的抗體效價用由ELISA測得的吸收值表示。圖5中顯示出了所得的結果，其中圖5a顯示了第二次接種後在不同時間測得的總免疫球蛋白;圖5b和5c分別顯示了IgG1和IgG2a的水平。
將能看出在從每一個表面活性劑生產的NISV包裹BSA與BSA沒有佐劑相比顯著地提高了抗體效價。對被分析的所有抗體亞類，在第二次注射後14天BSA包裹在以MPG為基質的囊(泡)中比BSA包裹在以POE為基質的囊(泡)中產生更高的抗體效價。到第二次感染後35天，用MPG比用POE為基質的囊(泡)有較高的Ig和IgG1和效價，然而IgG2a的水平相似。到70天，兩者的囊(泡)製劑在總抗體效價;或兩者的分析的免疫球蛋白亞類上沒有顯著性區別。
因此能夠看出NISV的佐劑活性是廣泛適用的並不依賴於任何一種表面活性劑。
實施例4在同類品系鼠中NISV的佐劑活性已知現有技術中的某些佐劑因個體間免疫反應上遺傳決定的不同應用上受到限制。為了證明NISV的佐劑活性不被遺傳性所限制，測定了在三種BALB鼠(BALB/C，BALB/B和BALB/K)中對單獨給藥的BSA(即，在PBS中)，包裹在NISV中或在弗氏完全佐劑乳化液中的BSA的抗體反應。按照實施例1和2製備NISV和給這些小鼠組皮下注射。用ELISA測得抗體水平並在圖6A、B和C中顯示。在圖6A中，表示的是從在第二次接種後14天(圖a)，35天(圖b)和70天(圖c)收集的血液製備的血漿所測得的特異性BSA總抗體效價，其中結果用在450nm測得的平均吸收值來表示(+/-S.E.)。在IgG1(圖6B)和IgG2a(圖6e)中顯示了相似數據。為了ELISA，血漿試樣被稀釋到1/15000，所用軛合物稀釋度為1/1000(6A)，血漿和軛合物的相應的圖分別是1/30000和1/8000(6B)和1/1000和1/800(6C)。
將會看出對各種小鼠來說，NISV/BSA都產生了既對總抗體又對特殊的異型IgG1和IgG2a的高抗體效價。儘管相應的效價與用BSA和FCA的效價相比隨第二次刺激後的時間以及不同品種而變化，但是NISV在被實驗的三個品種中都能夠起到輔助作用，誘發的抗體反應或者大於由BSA/FCA所產生的或者至少與其在一個級別。
實施例5抗先天性弓形體病的疫苗製備弓形體病是由原蟲兔弓形蟲引起的一種鳥類和哺乳動物的疾病。在非保護的活動中這種疾病能從母親到胎兒垂直傳染而且這種傳遞能導致胎兒死亡。但是在感染前用疫苗可產生一定程度的保護性免疫。它被以為這是由CD8+T細胞和Th1 CD4+子集間的協同作用產生的。用BALB/C和BALB/K兩種鼠作實驗模型研究了特別與T細胞的這些子集有關的NISV包裹抗原的疫苗特性。
小鼠在常規條件下飼養近親交配的BALB/C和BALB/K小鼠和遠親交配的StrathclydeA系族小鼠。當小鼠為8-10周齡時使用，並且每個實驗組含有5-10隻動物。
感染12周前被用兔弓形蟲RRA(Beverly)種感染的A系族小鼠大腦被用作組織囊腫的來源，它是按以前的描述(Roberts和Alexander1992，Parasitor，104.19-23)被收穫和計數的。實驗中的感染都用口腔方式以及先天性感染模型也是如以前所描述的(RobertsandAlexander1992)。簡單地說，在受孕11～12天用20個組織囊腫感染BALB/C小鼠。然後存活的後代被轉移到感染的養畜母親，並用ELISA方法在出生後8-9周測定先天性感染的發生率。合適的是用死亡率或者用大腦中總囊腫數監控感染的嚴重程度。
抗原製備冷凍-融化殺滅的tachyzoites(KP)，tachyzoite排洩/滲出的抗原(ESAg)，膜抗原和可溶性抗原(STAg)都被用於接種研究。從感染的棉花鼠腹膜滲出液中獲得RH株的兔弓形蟲tachyzoites，並用生理鹽水洗3次。採用5×1010tachyzoites接種在40ml PBS中過夜的方法獲得ESAg。Tachyzoites被用離心分離法在1000g下除去並且收集上層清液。用Bradford測定法(Bradford.1976 Analyt、Biochem、72，248-254)測得所有的蛋白濃度。按照使用Braun勻漿器(homogeniser)在低滲緩衝液(40ml，10mM tris-HCl，2mMEDTA，pH7.8)中碎裂5×1010寄生物繼之以4℃和10000g下離心脫水30分鐘得到Tachyzoite可溶性和膜抗原部分。該上層清液含有STAg和丸狀膜部分。該膜抗原用1%辛基葡萄糖苷進一步純化繼之以在100，000g下離心。收集上層清液在4℃對PBS透析過濾以除去洗滌劑。
疫苗製備在感染前2周和4周，所有要接受疫苗製劑的動物皮下接種50μgtachyzoite抗原。用於接種的抗原可以以游離的形式或者乳化於弗氏完全佐劑中或者包裹在非離子型表面活性劑囊(泡)中。
囊(泡)製備用實施例1中所述的方法將STAg包裹於1-單棕櫚氧基甘油NISV中。
結果所得到的結果顯示在圖7A-D中。圖7A顯示了皮下接種包裹在NISV中的STAg，單獨STAg或在感染前2和4周與NISV混合的STAg之後通過口腔用20個囊腫在BALB/K鼠感染後4周的囊腫平均數(+/-S.E.)。能夠看到，與其它組比較包裹在NISV中的STAg顯著降低囊泡數。
圖7B顯示了平均血漿抗體水平，圖7C顯示了用20個囊腫口服感染後8周的BALB/C雌鼠大腦中的囊腫平均數。小鼠在受孕11-12天時被感染。接種組已經在感染前2和4周皮下接種包裹在NISV中的STAg(50μg)。能夠看到，與對照組相比，用NISV包裹的抗原接種既能顯著地降低大腦中的囊腫數又顯著地降低抗體水平。
圖7D顯示了接種和無接種小鼠的出生幼鼠的死亡情況。能夠看到，儘管對免疫鼠來說有超過50%的出生的後代被感染，但與非免疫試樣相比(多於一些的幼鼠在出生或出生後24小時內死亡)，沒有死亡在免疫的出生幼鼠中發生。
因此我們已證明在NISV中的可溶性抗原的包裹提高了佐劑功效，即提高了這種抗原對成熟鼠的保護性和完全消除了胎兒的死亡。
實施例6用作合成的T細胞表位佐劑的NISV的能力肽的製備「Giles」肽，是麻疹F蛋白258-277的殘基，用常規的FMOC化學法合成。這種肽具有序列GILESRGIKARITHVDTESY並含有T和B細胞二者的表位。
按照Collins方法(見上)從1-單棕櫚醯基甘油酯中製備NISV，並用Pick的冷凍-融化技術(見上)包裹抗原。
免疫接種每組4隻8-10周齡雌性BALB/C小鼠以25μg在PBS中包裹在NISV中或在FCA中乳化的肽免疫。一周後，摘除它們的脾臟並用胸腺嘧啶脫氧核苷摻合驗定法(Corradin等，J.Immurd、119，1048-1053(1977))測量這種肽的特異T細胞增生反應。
結果該結果顯示於圖8和圖9中。在試驗測定的所有濃度中，來源於用NISV包裹抗原的免疫小鼠的脾細胞比源於接受PBS或FCA中肽的鼠的細胞在體外增生程度更大(圖8)。
在刺激48小時後移去已用50μg/mlGILES刺激的培養物中的上清液並用ELISA試驗IFN-r的存在。從圖9能看到，源於用GILES和佐劑一起接種的小鼠脾細胞比用PBS中的GILES接種的鼠的脾細胞明顯產生更多的IFN-r，並且NISV包裹的抗原比FCA中的抗原產生更多的IFN-r。因此NISV能作為相應於較大病毒蛋白的肽的佐劑，也能夠作為激素的佐劑。而且，NISV比FCA能在更大程度上起動小鼠的抗原特異T細胞增殖到較高程度。在培養物上清液中存在的IFN-r暗示了CD4+Th1細胞和/或CD8+T細胞的活化。
實施例7口頭結醫試驗用NISV包裹的BSA對鼠口頭給藥囊(泡)按實施例1所描述的以表面活性劑∶膽甾醇，二鯨蠟基磷酸鹽5∶4∶1比率從二甘醇鯨蠟基醚(DGCE)或1-單棕櫚醯基甘油酯(MPG)組成。囊泡按Rnssell和Alexander(見上)描述的從氯仿中用旋轉薄膜蒸發製備。形成薄膜的150μmoles表面活性劑在含有100mgBSA的碳酸鹽緩衝液中水合。混合物在60℃用水浴聲波處理機處理5分鐘之前在60℃振搖2小時。
每一個處理組中使用5支8-10周齡雌性BALB/C鼠，每組接受下列(a)在碳酸鹽緩衝液中的BSA(b)在DGCENISV中的BSA(c)在MPGNISV中的BSA鼠在第1天被用管飼養法給藥首次接受0.1ml口服藥劑(每支鼠240μg)。第12天，第二次口服劑量(每隻鼠500μgBSA)被給藥。在第20天和24天收集血樣品並分析IgG效價。
權利要求
1.一種疫苗，包含至少一種包裹於非離子型表面活性劑囊(泡)中的抗原。
2.如權利要求1所要求的疫苗，其中的抗原是一種肽。
3.如權利要求2所要求的疫苗，其中的肽是合成的或重組來源的。
4.如權利要求3所要求的疫苗，其中的肽含有8到50個胺基酸單元。
5.如權利要求4所要求疫苗，其中的肽含有10到20個胺基酸單元。
6.如權利要求3到5中的任一所要求的疫苗，其中的肽是連結到一種載體上。
7.如權利要求1所要求的疫苗，其中的抗原選自兔弓形蟲原蟲的抗原和黃體化激素釋放激素和其分子式為PGln-His-Trp-Ser-Tyr-X-Len-Arg-Pro-Gly-Y-Z的類似物，其中X表示Gly或一個D-胺基酸，Y表示一個或多個胺基酸殘基，它們可以相同也可不同，Z表示Cys或Tys，這樣所說的類似物的溶液構象基本上相似於棄置的LHRH的構象。
8.如上述權利要求中任一個所要求的疫苗，其中所說的非離子型表面活性劑包含一種甘油酯。
9.如權利要求8所要求的疫苗其中所說的甘油酯是含有C12-C20鏈烷氧基或鏈烯氧基部分的甘油單酯。
10.如權利要求9所要求的疫苗，其中的甘油酯是1-單棕櫚醯基甘油酯。
11.如權利要求1到7中任一個所要求的疫苗，其中的囊(泡)含有基於甘油或低級脂肪甘醇的醚。
12.如權利要求11所要求的疫苗，其中的醚是甘油醚或基於含C12-C20鏈烷基或鏈烯基部分的低級脂肪族甘醇單醚。
13.如權利要求12所要求的疫苗，其中的單醚包含5個以下的甘醇單位。
14.如權利要求12所要求的疫苗，其中的甘油醚是1-單鯨蠟基甘油醚或者其中的低級脂肪族甘醇醚是二甘醇鯨蠟基醚。
15.如上述權利要求中任一個所要求的疫苗，其中的裹(泡)包括帶電荷的兩親性分子。
16.如權利要求15所要求的疫苗，其中的帶電荷兩親性分子含有選自羧酸鹽(酯)，磷酸鹽(酯)或磺酸鹽(酯)的一種酸性基團。
17.如上述權利要求中任一個所要求的疫苗，其形式適合於皮下，肌肉內或表皮肉給藥。
18.如權利要求1到16中任一個所要求的疫苗，其形式適合於黏膜給藥。
19.如權利要求1到16中任一個所要求的疫苗，其形式適合於口腔給藥。
20.一種疫苗的製備方法，包括在非離子型表面活性劑囊(泡)中包裹至少一種抗原。
21.把一種抗原製備為一種口服有活性的疫苗方法，包括在非離子型表面活性劑中包裹所說的抗原。
22.如權利要求20或21所要求的方法，其中的疫苗是如權利要求2到19中任何一個所定義的。
23.製備至少一種抗原經Th1T淋巴細胞通道刺激抗體產生的方法，包括在非離子型表面活性劑裹(泡)中包裹至少一種所說的抗原。
24.把至少一種抗原的免疫原性增強到至少與使用弗氏完全佐劑所獲得的相同水平的方法，包括在非離子型表面活性劑裹(泡)中包裹至少一種所說的抗原。
25.如權利要求23或24所要求的方法，其中所說的抗原是如權利要求2到7中任一個所定義的，所說的囊(泡)是如權利要求8到16中任一個所定義的。
26.如權利要求20到25中任一個所要求的方法，其中的抗原是包裹在製備好的囊(泡)中。
27.具有至少一種包裹的抗原的非離子型表面活性劑囊(泡)在刺激細胞或體液免疫上的用途。
28.如權利要求27中所要求的用途，作為一種可口腔給藥的免疫佐劑。
29.如權利要求27到28所要求的用途，其中的抗原是如權利要求2到7中任何一個所定義的。
30.如權利要求28或29中所要求的用途，其中的囊(泡)包含鍵合酯的表面活性劑分子。
31.在非離子表面活性劑囊(泡)中包裹的至少一種抗原在製備用於在哺乳動物或非哺乳動物對象中增強對所說至少一種抗原的免疫反應的產品方面的用途。
32.包裹在非離子型表面活性劑囊(泡)中的至少一種抗原在製造用於在哺乳運物或非哺乳動物對象中刺激對所說的至少一種抗原的細胞調節和體液免疫應答的產品方面的用途。
33.包裹在非離子型表面活性劑囊(泡)中至少一種抗原在製造用於在哺乳動物或非哺乳動物對象中經Th1T淋巴細胞通道刺激應答所說的至少一種抗原的抗體產生的產品方面的用途。
34.如權利要求31到33中任一個所要求的用途，其中所說的對象是哺乳動物。
35.如權利要求31到33中任一個所要求的用途，其中所說的抗原是如權利要求2到7中任一個所定義的，所說的囊(泡)是如權利要求8到16中任一個所定義的。
36.一種在哺乳動物或非哺乳動物對象中提高對至少一種抗原的免疫應答的方法，包括給所說的對象使用包裹於非離子型表面活性劑囊(泡)中所說的至少一種抗原。
37.一種在哺乳動物或非哺乳動物對象中刺激應答至少一種抗原的細胞調節和體液免疫的方法，包括給所說的對象服用包裹在非離子型表面活性劑囊(泡)中所說的至少一種抗原。
38.一種在哺乳動物或非哺乳動物對象中經TH1T淋巴細胞通道刺激應答至少一種抗原的抗體產生方法，包括給所說的對象服用所說的包裹於非離子型表面活性劑囊(泡)中的至少一種抗原。
39.如權利要求36到38中任一個所要求的方法，其中所說的對象是哺乳動物。
40.如權利要求36到39中任一個所要求的方法，其中所說的對象是哺乳動物。
41.如權利要求36到40中任一個所要求的方法，其中所說的抗原是如權利要求2到7中任何一個中所定義的，所說的囊(泡)是如權利要求8到16中任一個中所定義的。
42.一種含有包裹在非離子型表面活性劑囊(泡)中的至少一種抗原的產品，其形式是粉劑，片劑、糖漿、膠囊或顆粒劑。
全文摘要
本發明提供了一種疫苗，它含有至少一種包裹於NISV中的抗原，特別是合成或重組來源的一種肽。
文檔編號C07K14/12GK1085449SQ9310522
公開日1994年4月20日 申請日期1993年4月7日 優先權日1992年4月7日
發明者J·亞利山大, J·M·布魯爾 申請人:普羅託斯分子設計有限公司