膽鹽刺激的脂酶變異體、編碼其之dna分子和轉基因非人類哺乳動物的製作方法
2023-05-23 08:06:26 3
專利名稱：膽鹽刺激的脂酶變異體、編碼其之dna分子和轉基因非人類哺乳動物的製作方法
技術領域：
本發明涉及作為膽鹽刺激的脂酶(BSSL；EC 3.1.1.1.)變異體的新的多肽。也涉及編碼所述多肽的DNA分子，涉及含所述DNA分子的亞產品。此外本發明涉及生產所述BSSL變異體和生產能表達BSSL變異體的轉基因非人類哺乳動物的方法。而且本發明涉及所述的轉基因動物及含此轉基因動物乳的嬰兒膳食配方。本發明還涉及含所述多肽的藥物組合物，所述多肽及製造藥物的DNA分子的用途。
背景技術：
膳食脂類的水解膳食脂類是一種重要的能量來源。富含能量的三脂醯甘油佔這些脂類的95％以上。一些脂類，如某些脂肪酸和脂溶性維生素，是必需的膳食成分。在胃腸吸收之前，三脂醯甘油和微量成分，如酯化的脂溶性維生素、膽固醇及二脂醯磷脂醯甘油，需要酯鍵水解以得到疏水性弱、可吸收的產物。通過稱為脂酶的特異性酶類催化這些反應。
在人類中，相關的必需脂酶有，胃脂酶、共脂酶依賴的胰脂酶(水解三-和二脂醯甘油)、胰磷脂酶A2(水解二脂醯磷脂醯甘油)和羧基酯水解酶(CEH)(水解固醇酯和脂溶性維生素酯及三、二和單脂醯甘油)。對哺乳的新生兒，膽鹽刺激的脂酶(BSSL)在水解上述提到的幾種脂類過程中發揮著重要的作用。脂類消化產物和膽鹽一起形成混合的吸收微團或單層吸收囊泡(Hernell et al.，1990)。膽鹽刺激的脂酶膽鹽刺激的脂酶(BSSL)在有限幾個種類，如人類、大猩猩、貓和狗中是乳中成分(Hernell et al.，1989，Hamosh et al.，1986)。在上部小腸內容物中與膽汁混合後，BSSL被初級膽鹽(Hernell，1975)特異地激活。約佔總乳蛋白1％的BSSL，和乳一起經過胃時不降解，在十二指腸內容物中膽鹽保護其不被如胰蛋白酶和糜蛋白酶的胰蛋白酶類失活。
加熱處理人乳(巴斯德消毒法62.5℃，30分鐘)，使BSSL完全失活(Bjrksten et al.，1980)，使早產兒的脂肪吸收係數降低約1/3(Williamson et al.，1978，Atkinson et al.，1981)，因此由於BSSL和同樣脂肪成分的嬰兒膳食配方比，新鮮人乳中三脂醯甘油較好利用(Hernell et al.，1991，Chapell et al.，1986)。
BSSL是一種非特異性脂酶(EC 3.1.1.1)，它不但大量水解三脂醯甘油，而且水解二和單脂醯甘油，膽固醇酯類及脂溶性維生素酯類(Blckberg Hernell，1983)。因此，活化後，BSSL本身有能力水解人乳中的大部分脂類，縱使人乳三脂醯甘油的最有效利用需要胃脂酶(EC 3.1.1.3)，共脂酶依賴的胰脂酶(EC 3.1.1.3)和BSSL(Bernbck et al.，1990)的協同作用。
最近研究表明，乳酶對於新生兒利用長鏈多不飽和脂肪酸是特別重要的(Hernell et al.，1992)。這些脂肪酸是eicosanoids的重要前體並有助於神經系統的發育。新生兒，尤其早產兒，從前體合成這些脂肪酸的能力有限。因此，認為出生後在一段還未確定的時期內仍然需要它們。
最近從幾個實驗室研究中已描述了乳脂酶和胰羧基酯水解酶(CEH)(E.C.3.1.1.1)兩者cDNA結構的特徵(Baba et al.，1991；Hui et al.，1991；Nilsson et al.，1990；Reue etal.，1991)，結論為，乳酶和胰酶是同一基因的產物。BSSL或CEH基因的cDNA序列及推導出的胺基酸序列(SEQ ID NO1)也公開在WO91/15234(Oklahoma Medical Research Foundation)和WO 91/18923(Aktiebolaget Astra)中。
BSSL是一種單鏈糖蛋白。推導出的蛋白質(SEQ ID NO3)含722個胺基酸殘基，而且高度糖基化(Abouakil et al.，1989)。這種蛋白質N-端部分的一半同乙醯膽鹼脂酶及其它一些脂酶有顯著同源性(Nilsson et al.，1990)。
一個暫定的絲氨基殘基活性位點定位在第194位絲氨酸；這個絲氨酸兩側的序列同絲氨酸水解酶的共有活性位點序列是一致的。一個暫定的N-糖基化位點、在活性位點絲氨酸N-端的僅7個殘基處(Nilsson et al.，1990)。
BSSL在其C-端含16個脯氨酸豐富的重複序列，每個重複序列由11個胺基酸殘基組成。重複序列數量的不同似乎主要解釋了源於不同種之相應酶之間分子大小和胺基酸構成上的差異(Han et al.，1987；Fontaine et al.，1991；Kyger et al.，1989)。這些重複序列帶有佔此蛋白15-20％的糖類的大部分(Baba et al.，1991；Abouakil et al.，1989)。
在BSSL和典型的脂酶之間獨一無二的結構差別在多肽鏈的C-端，即由11個胺基酸殘基組成的16個富含脯氨酸的重複序列。牛和大鼠相應的胰酶分別只有3和4個重複序列(Han et al.，1987；Kyger et al.，1989)。因此，可以假設即，C-端，或至少部分C-端對於脂酶活性抗乳化的長鏈三脂醯甘油的活性是必不可少的。脂類吸收異常脂類吸收異常及由此引起的營養不良，一般原因是管腔內共脂酶依賴的胰脂酶和/或膽鹽的水平降低。這種脂酶缺乏的典型例子是囊性纖維性變患者，其中80％的人由於普遍的遺傳性紊亂導致終生缺陷，再就是慢性胰腺炎，通常由慢性酒精中毒引起。
目前，治療胰脂酶缺乏的患者，是口服很大劑量的豬胰酶粗製品。然而，共脂酶依賴的胰脂酶通常由於胃內pH低而失活。使用大劑量的酶不能完全克服此影響。因此大劑量口服胰酶對多數患者是不夠的，而且該製品不純且口味差。
已制定配方的某種藥片，能通過胃的酸性區，只在空腸的相對鹼性環境中釋放出酶。但是，許多胰病患者空腸呈不正常的酸性，在那些情況下藥片不能釋放酶。
而且，由於目前市場上的製品為非人類來源，有產生免疫反應的危險性，對患者產生有害作用或降低療效。
此製品進一步的弊端是，和共脂酶依賴的脂酶比，其它脂解活性的內容物尚未陳述。實際上，它們多半含很低水平的BSSL/CEH活性。這可能是許多患囊性纖維性變的患者儘管用補充療法，但仍患有脂溶性維生素和必需脂肪酸缺乏的一個原因。
因此，強烈需要具有人類脂酶特性和結構並具有廣泛底物特異性的產品。此產品能給患一或幾種胰脂解酶缺乏的患者口服。使用本發明的產品本身或同含其它脂酶的製品結合滿足了這種需要。本發明構思簡述按照本發明，重組BSSL變異體有穩定的催化活性，但比全長BSSL含較少糖基化位點，由此其生產可能降低糖類的異質性程度。這種複雜性的降低使此重組蛋白易於純化及描述特徵，將導致更有效地生產具有BSSL活性的多肽。
另一方面，糖基化程度的降低減少了對宿主的要求，並允許幾種宿主細胞有較高水平的生產。但在另一方面，BSSL變異體糖基化位點數的降低，允許較低等真核生物進行高效生產並限制可引起免疫反應的異常糖基化的潛在危險。這種大小的降低，糖基化複雜性較低也表明與具有很複雜及含大量糖類部分的蛋白質相比較，宿主範圍比較廣闊。
治療用BSSL變異體的大小較小，但是活性相等，這意謂著補充所需的物質重量減少了。進一步，重組BSSL變異體缺乏大多數或全部O-糖基化重複單位，可能的優點是降低接受個體中產生免疫反應的危險性。這是因為依賴於產生它的細胞，O-連接的糖可能是很有異源性的。
科學文獻指出，天然BSSL粘著在小腸粘液中並通過其吸收。篩選的降低了吸收率的BSSL變異體在較長時期內對膳食脂類底物是有活性的，進而產生高效的腔內消化。這種變異體的例子是具有降低的糖基化的分子。
如上所述，已證實BSSL對新生兒神經系統發育上發揮重要作用的長鏈多不飽和脂肪酸(Herne1l et al.，1993)和維生素的利用是特別重要的。
按照本發明，在此方面更有效的BSSL變異體可經已知方法篩選。截短的酶可能有不同的構象，所述構象影響對不同的脂類底物的特異性。
本發明公開一方面，本發明涉及編碼短於722個胺基酸的BSSL變異體的核酸分子，所說的BSSL變異體含SEQ ID NO3中所示536-722殘基部分胺基酸序列。
術語「部分胺基酸序列」理解為含一個胺基酸及幾個胺基酸的序列或幾個結合的所述序列。
術語「BSSL變異體」理解為多肽，具有BSSL活性，並且含序列表SEQ ID NO3所示的人BSSL之部分胺基酸序列。
術語「具有BSSL活性的多肽」理解為至少含有下列特性的多肽(a)適於口服；(b)能被特異性膽鹽活化；(c)在小腸內容物中起非特異性脂酶的作用，即能水解脂類，相對地與其化學結構和物理狀態(乳化的、微團的、可溶的)無關；並且可選擇地有一或更多下述特性(d)水解有不同鏈長度及不同不飽和程度之脂肪酸的三脂醯甘油的能力；(e)也有水解二脂醯甘油、單脂醯甘油膽甾烯基酯、溶血磷脂醯甘油、視黃基和其它脂溶性維生素酯的能力；(f)不但有水解三脂醯甘油的sn-1(3)酯鍵的能力，而且有水解sn-2酯鍵的能力；(g)不但具有和初級膽鹽相互作用的能力，而且有和次級膽鹽相互作用的能力；(h)最佳活性依賴膽鹽；(i)在胃內容物中穩定，對其催化效率的影響不會達到任何實質程度；(j)若膽鹽存在，穩定地抗胰酶，如胰蛋白酶失活；(k)結合肝素和肝素衍生物，如硫酸肝素的能力；
(l)和脂-水界面結合的能力；(m)對低壓凍幹法足夠穩定；(n)當和食物成分，如人乳或乳膳食成分混合時穩定。
另一些方面，本發明涉及如上所述的核酸分子，其中所說BSSL變異體在其C-端位置有一個苯丙氨酸殘基，或在其C-端部分含一個穀氨醯胺-蛋氨酸-脯氨酸(Gln-Met-Pro)序列，另一方面在其C-端部分可替換含有SEQ ID NO3中第712-722殘基所示的胺基酸序列。
在本發明中，術語「C-端位置」命名為最後的C-端殘基位置，而術語「C-端部分」可理解為組成BSSL變異體C-端的約50個胺基酸殘基。
如上所述本發明進一步涉及核酸分子，其中所說的BSSL變異體含不到16個的重複單位。本發明中術語「重複單位」命名為33個核苷酸的重複單位之一，所述每一核苷酸均在序列表SEQ ID NO1中有說明。
另一些方面，本發明涉及上述編碼一種多肽的核酸分子，所述多肽的胺基酸序列與序列表中的SEQ ID NO5、6或9所示的胺基酸序列有至少90％的同源，並涉及編碼一種多肽的核酸分子，所述多肽的胺基酸序列與序列表SEQ ID NO7所示的胺基酸序列至少有90％的同源，但編碼187位置上有一個天冬醯胺的多肽的那些核酸分子除外。
本發明也涉及序列表中SEQ ID NO5、6、7、或9所示的多肽以及如上所說的核酸序列編碼的多肽。
本發明還涉及一種含上述核酸分子的雜種基因，一種含所述雜種基因的可複製的表達載體以及含有所述雜種基因的細胞。所述細胞可以是原核細胞、單細胞真核有機體或源於多細胞有機體如哺乳動物的細胞。
在本發明中，「雜種基因」意思是核酸序列，它一方面包含編碼如上定義的BSSL變異體的核酸序列，另一方面含有能調控所述雜種基因產物表達的基因之核酸序列。術語「基因」意思是在所需組織能調控和定位雜種基因表達的一個完整的基因和其亞序列。通常，所說的亞序列至少有一或多個啟動子區、一個轉錄起始位點、3′和5′非編碼區和結構序列。
優選地，雜種基因通過在體外將編碼BSSL變異體的核酸序列插入到用現有技術能調控表達的基因中而形成的。另外，編碼BSSL變異體的核酸序列在體內可通過同源重組插入。
在本發明中，術語「可複製的」意思是指載體能在給定類型的它被導入的宿主細胞中複製。緊接核酸的序列上遊可提供一個編碼信號肽的序列，信號肽的存在保證了由含載體的宿主細胞表達的BSSL變異體的分泌。信號序列可以是天然和核酸序列有關的，或是其它來源的。
載體可以是適於重組DNA方法的任何載體，載體的選擇通常依賴於它被導入的宿主細胞。因此，載體可以是自主複製載體，即作為染色體外單位存在的載體，其複製不依賴染色體複製；此類載體的例子育質粒、噬菌體、粘粒、微小染色體或病毒。另外，載體可以是這樣的載體，當其引入宿主細胞時，整合進宿主細胞基因組中，與其整合的染色體一起複製。適宜的載體例子是細菌表達載體和酵母表達載體。本發明的載體可攜帶上述定義的本發明的任何核酸序列。
另一方面，本發明涉及重組多肽的生產方法，所說方法包括(i)在能於特異性宿主細胞或有機體中複製的雜種基因中插入上述核酸分子；(ii)將所得的重組雜種基因導入宿主細胞或有機體；(iii)在培養基內或上使所得的細胞生長，或鑑定並繁殖有機體，以表達多肽；和(iv)回收多肽。
用於生長細胞的培養基可以是適於此目的的任何常規培養基。合適的載體可以是上述任何載體，而合適的宿主細胞可以是上述列出的任何類型細胞。用於構建載體和使其引入宿主細胞的方法可以是重組DNA領域中用於此目的的任何已知方法。可以分泌細胞表達的人重組BSSL變異體，即通過細胞膜輸出，這依賴於細胞的類型和載體的構成。
如果BSSL變異體由重組宿主細胞內產生，即，細胞不分泌出BSSL變異體，則可通過標準方法，包括通過機械方法，如聲處理或勻漿化，或通過酶學或化學方法使細胞裂解，接著進行純化而回收。
為了分泌，編碼BSSL變異體的DNA序列之前應有一編碼信號肽的序列，其存在保證了BSSL變異體從細胞中分泌，以致將至少相當比例的表達的BSSL變異體分泌到培養基中並回收。
本發明也涉及到一種表達系統，包括在含有所說的雜種基因的宿主細胞或有機體中可以表達的雜種基因，當雜種基因表達時產生重組多肽，通過將上述核酸序列插入能調節所說雜種基因表達的基因中產生所述的雜種基因。
生產本發明的重組BSSL變異體可能的方法是使用能將BSSL變異體分泌到其乳中的轉基因非人類哺乳動物。轉基因非人類哺乳動物的使用，其優點是可以以合理的成本獲得高產率的重組BSSL變異體，尤其若非人類哺乳動物是母牛時，在乳中生產作為例如嬰兒膳食配方的正常組分的重組BSSL變異體以便當使用重組BSSL變異體作為以乳為基本的產品中的營養添加劑時不必過度純化。
而且在較高等有機體如非人類哺乳動物中生產通常會對哺乳動物蛋白進行正確的加工，如有關上述的翻譯後加工過程和適當摺疊，也可以得到大量基本上純的BSSL變異體。
因此，上述表達系統可以是哺乳動物表達系統，其包括編碼BSSL變異體的DNA序列，此序列插入到編碼非人類哺乳動物乳蛋白的基因中，以便形成在成年哺乳動物雌性乳隙內可表達的雜種基因，所述哺乳動物含有所說雜種基因。
通常認為，作為表達組織的乳腺和編碼乳蛋白的基因特別適合於在轉基因非人類哺乳動物中生產異源蛋白質，由於乳蛋白在乳腺中通常以高表達水平生產。而且易於大量收集和使用乳。在本發明中，在重組BSSL變異體的生產中使用乳蛋白基因的進一步的益處是，利用表達調節及生產位置(乳腺)在類似其自然生產條件的條件下進行生產。
當在轉基因哺乳動物中使用時，上述雜種基因優選地含有編碼信號肽的序列，以便能將雜種基因產物正確地分泌到乳腺內。信號肽典型地通常是在所述研究的乳蛋白基因中發現的或是與編碼BSSL變異體的DNA序列相關的。但是，能調節雜種基因產物使其分泌到乳腺內的其它信號序列，也是相關的。當然，雜種基因的各種元件應以如此方式融合，以便使基因產物進行正確表達及加工。因此，應將編碼所需信號肽的DNA序列與編碼BSSL變異體的DNA序列的N-末端部分精確融合。在雜種基因中，編碼BSSL變異體的DNA序列，通常含有其終止密碼子，但不是其自身的信息裂解和聚腺苷酸位點。通常保留編碼BSSL變異體的DNA序列的下遊，乳蛋白基因的mRNA加工序列。
許多因素被認為對某個特別雜種基因的實際表達水平有影響。啟動子及上述其它調節序列的能力、哺乳動物基因組中表達系統的整合位點、編碼BSSL變異體的DNA序列在乳蛋白編碼基因中的整合位點、賦予轉錄後調節元件及其它類似因子對獲得的表達水平是相當重要的。根據對影響雜種基因表達水平的各種因子的認識，本領域技術人員知道怎樣設計用於本發明目的的表達體系。
所用的乳蛋白基因可源於與表達體系所插入的乳蛋白基因之種相同，或源於別的種。就此而論已表明，乳腺靶基因表達的調節元件在功能上跨躍了種的界限，這也許是由於可能的共同祖先(Hennighausenet al.1990)。
在構建本發明表達體系中所用的編碼乳蛋白適宜的基因或其有效的亞序列通常發現於不同哺乳類源的乳清蛋白之中，如乳清酸蛋白(WAP)基因，優選的是鼠源的；和β-乳球蛋白基因，優選的是羊源的。而且可能發現不同來源的酪蛋白基因也適於BSSL變異體的轉基因生產，如牛αS1-酪蛋白和兔β-酪蛋白。目前優選的基因是鼠WAP基因，因發現其可在不同轉基因動物乳中使許多外源人類蛋白質的高水平表達(Hennighausen et al.1990)。
另一個和本發明表達系統相關的優選序列是能調節高水平表達的所謂表達穩定序列。強有力證據表明，此穩定序列發現於乳蛋白基因附近和上遊。
本發明也包括生產能表達BSSL變異體的轉基因非人類哺乳動物的方法，包括(a)將上述表達系統進入受精卵或非人類哺乳動物胚胎細胞以便使表達系統摻入哺乳動物種系；和(b)使所得的受精卵或胚胎發育成為成年雌性非人類哺乳動物。
可使用任何合適的技術，如在「Manipulating the MouseEmbryo」，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press 1986中描述的將表達系統摻入哺乳動物種系。例如，幾百個分子的表達系統可直接注射進受精卵，如受精的一個細胞卵或其卵原核，或所用哺乳動物的胚胎，此後將微注射的卵轉入假孕代育母親的輸卵管，使其發育。
生產能表達BSSL變異體的轉基因非人類哺乳動物的方法也包括其中所說的哺乳動物基本上不能表達來自哺乳動物本身的BSSL的方法。所述方法包括(a)損害哺乳動物的BSSL表達能力以便基本上不表達哺乳動物BSSL，並按上述將一個表達系統以使在哺乳動物中表達BSSL變異體的方式插入哺乳動物種系，和/或(b)用如上限定的表達系統取代哺乳動物BSSL基因或其部分。
通過在導致BSSL表達的DNA序列中引入突變可以方便地破壞哺乳動物的BSSL表達能力。所述突變可以包括使DNA序列脫離框架、引入終止密碼、缺乏DNA序列的一或多個核苷酸。
可用上述的表達系統或通過熟知的同源重組原理用編碼BSSL變異體的DNA序列取代哺乳動物BSSL基因或其部分。
在更重要的方面，本發明涉及在其基因組中有如上DNA序列的轉基因非人類哺乳動物。所說DNA序列可優選地存在於哺乳動物的胚系及哺乳動物的乳蛋白基因中。優選地可從包括小鼠、大鼠、兔、羊、豬和牛篩選轉基因非人類哺乳動物。
本發明也包括如上轉基因非人類哺乳動物的後代及從所述轉基因非人類哺乳動物獲得的乳。
本發明進一步涉及含如上乳的嬰兒配方及上述含BSSL變異體的嬰兒配方。嬰兒配方可使用常規方法製備，而且可含任何必需的添加劑礦物質、維生素等。
進一步，本發明涉及含如上BSSL變異體的藥物組合物及所述BSSL變異體在治療中的應用。
更進一步，本發明涉及用上述BSSL變異體製造用於治療與外分泌胰腺功能不全膽囊纖維化、慢性胰腺炎、脂肪吸收障礙、脂溶性維生素吸收不良、由於病理原因造成的脂肪吸收不良相關的病理狀態之藥物。本發明也涉及用於藥物製造的BSSL變異體對於改善膳食脂類利用的用途，尤其在早產兒中。
實施例1.重組BSSL在真核及原核細胞中的表達1.1實驗方法1.1.1重組質粒被克隆進pUC19中的含2.3kb 人BSSL cDNA(NilSSon et al.1990)的質粒pS146經HindIII和SalI酶解，將BSSL cDNA導入牛乳頭瘤病毒(BPV)表達載體，pS147(圖1)。此載體含有位於鼠金屬硫因1(mMT-1)控制增強子及啟動元件之下(PaylakisHamer，1983)的人BSSL cDNA。mRNA加工信號通過含部分外顯子II、內含子II、外顯子III及兔β-球蛋白基因下遊元件的基因組片段提供。將該轉錄單位克隆進含整個BPV基因組的載體中。對BPV和BSSL轉錄單位來說，轉錄是單方向的。為了使此載體在大腸桿菌中繁殖，該載體還包含pML2d，它是pBR322的衍生物(Sarver et al.1982)。
表達載體pS147和在Harrey肉瘤病毒5′-長未端重複序列及SV40多腺苷酸化信號(Lusd Botchan，1984)驅動下的編碼新黴素抗性基因的載體共轉染。
為了在大腸桿菌中表達BSSL，從質粒pT7-7(Ausubel et al，1992)中將BSSL cDNA作為NdeI-BamHI片段亞克隆到pGEMEX-1(Promega，Madison，WI，USA)(Studier Moffat，1986)中。用這種克隆方法，T7基因10編碼序列被前面加起始密碼子的編碼成熟蛋白質的BSSL基因置換。最終表達載體pGEMEX/BSSL通過使用特異的BSSL內引物，經DNA測序證實。1.1.1.2誘變指定起始密碼ATG中的A為核苷酸1號。對於胺基酸序號，信號肽中的第一個蛋氨酸號為-23，將成熟蛋白質中第一個胺基酸殘基，丙氨酸，指定為1號。
為構建缺失變異體A(SEQ ID NO4)，合成了兩個PCR引物，PCR-1和PCR-2(表1)。為了克隆進不同的質粒，產生了HindIII、SalI和BamHI位點。沒有改變胺基酸序列，在BSSL序列中產生了BclI位點。這樣做為了便於加入合成的DNA，以獲得其它變異體。引物PCR-2含兩個合成的終止密碼子。所得的PCR片段經BamHI和HindIII酶解並克隆進pUC18以便序列分析。該質粒命名為pS157。正確的PCR片段通過在獨一無二的Asp700位點(BSSL cDNA中1405位置)和β-球蛋白基因片段前部的SalI位點與BSSL序列融合而插入到BPV表達載體，結果產生pS257。
通過使用3、4、7和8號寡核苷酸(表1)獲得了B-變異體構建體(SEQ ID NO5)。退火的寡核苷酸正好編碼C-未端胺基酸序列相當於全長蛋白質中的賴氨酸712至苯丙氨酸722。此片段和穀氨醯胺525融合。一個翻譯終止子直接插入到最後一個苯丙氨酸後。此片段在5′端含一個BclI位點並在3′端含一個SalI位點，使其能夠導入pS157。所得的質粒用Asp700和SalI酶解，將313bp片段導入上述的表達載體。產生的質粒命名為pS258。表1.
用於構建BSSL變異體的合成的寡核苷酸在限制性位點的核苷酸下面劃了線。翻譯終止信號由黑體字標出。變異體N中可變密碼在PCR-3中用黑體字和星號標出。<
為了構建編碼C-變異體(SEQ ID NO6)的基因，使用1至6號寡核苷酸(表1)。退火的DNA片段含兩個重複序列，編碼11個胺基酸與共有序列(Nilsson et al.1990)一致，在穀氨醯胺535和賴氨酸712-苯丙氨酸722序列之間插入。此片段也含一個5′端的BclI位點及一個3′端SalI位點，以允許與上述相同的克隆策略。所得的質粒命名為pS259。
為構建變異體N(非-N-糖基化的變異體，SEQ ID NO7)，合成了兩個PCR引物(PCR-3和PCR-4，表1)。產生EcoRI和BamHI位點，以使360bp的PCR產物克隆進pUC19中進行序列分析。將潛在N-連接的糖基化位點，在天冬醯胺187，變成穀氨醯胺。分離作為BalI-HindIII片段的修飾的序列然後與含mMT-1啟動子和5′端BSSL cDNA的SacI和BalI片段一起克隆進SacI和HindIII消化過的pUC19，一個約1.2kb的SacI-DraIII片段由此質粒分離到，然後分別插入到在表達載體之內的mMT-1元件和BSSL cDNA序列中。所得的質粒命名為pS299。1.1.3.哺乳動物細胞培養和轉染根據磷酸鈣沉澱法(Graham Van der Eb，1973)將載體共轉染進鼠細胞系C127(ATCC CRL 1616)。
在補充10％胎牛血清的Ham′s F12-Dulbecco′s ModifiedEagle′s培養基(DMEM)(1∶1)中培養C127細胞。用1.5mg×ml-1的G418篩選新黴素抗性細胞克隆，10-15天後，抗性細胞克隆從主平皿中分離，傳代，用於分析。1.1.4細菌菌株和培養條件為了表達實驗將載體pGEMEX/BSSL轉化到大腸桿菌菌株JM109(DE3)和BL21(DE3)pLysS中。表達實驗按Studier等人(1986)的描述進行。收集細菌後，通過離心(4℃，5,000xg 10分鐘，)沉澱細胞。為製備周質和胞質部分，將沉澱重懸於每克沉澱4ml20mM Tris-Cl/20％蔗糖，pH8.0，200μl0.1MEDTA及40μl的溶菌酶(15mg/每ml水)中。重懸液置冰上40分鐘。每克沉澱物加160μl0.5M MgCl2，此後在12000xg，離心懸液20分鐘，產生的上清液含周質蛋白質，沉澱物代表細胞質部分。另外，為製備可溶性蛋白質，將細胞懸於40mM Tris-Cl，0.1mMEDTA，0.5mM(苯基甲基磺醯氟化物pH8.2)，凍融和聲處理幾次使其溶解。離心細胞溶解液(25℃，30,000xg 30分鐘)。1.1.5.核酸分析從分離的哺乳動物細胞系或大腸桿菌細胞(Ausubel et al，1992)製備RNA和DNA。在瓊脂糖凝膠中使RNA或DNA分離，轉印到GeneScreen Plus(New England Nuclear)上，按供應商的說明雜交。1.1.6.天然酶的製備按前述的方法(Blckberg Hernell，1981)從人乳中純化膽鹽刺激的脂酶。純化的製品經SDS-PAGE判斷同源性，當用長鏈三脂醯甘油為底物檢測時，比活性為每分鐘，每mg釋放100μmol脂肪酸。1.1.7酶分析使用阿拉伯樹膠乳化的三油酸甘油酯為底物，按所述的方法(Blckberg Hernell，1981)進行酶檢測。用10mM膽酸鈉為激活的膽鹽，進行培養。當檢測膽鹽依賴性時，加入膽鹽(膽酸鈉或脫氧膽酸鈉，Sigma Chem. Co)達到表3中所給的濃度。1.1.8 Western印跡為了在印跡實驗中獲得有意義的反應，通過Blue Sepharose(Pharmaci LKB Biotechnology)層析濃縮條件培養基。將各個培養基和Blue Sepharose(每ml凝膠約10ml培養基)混合。用含0.1MKCl的0.5M Tris-Cl緩衝液，pH7.4洗滌凝膠(每ml膠10ml)。酶活性用同一緩衝液的1.5M KCl洗脫。用此方法濃縮了25-30倍，純化了3-5倍。按Laemmli(1970)方法，必要地在10％聚丙烯醯胺凝膠上進行SDS-PAGE。轉移至硝酸纖維素膜上，與抗純化的BSSL的多克隆兔抗血清一起孵育後，用和鹼性磷酸酶結合的山羊抗兔IgG及來自Bio-Rad的發育試劑盒進行測定結果。1.1.9用N-糖苷酶F處理加1μl 1M的β-巰基乙醇和0.5μl 10％(w/v)的SDS到含BSSL活性為每分鐘釋放2.5μmol脂肪酸的10μl變異體B中。煮沸5分鐘後，加入10μl 0.1M磷酸鈉緩衝液pH8.0，6μl0.1M EDTA，4μl 7.5％(w/v)Nonidet P40和5μl(IU)N-糖苷酶F(Boechringer Mannheim)。作為對照，處理了同等量的變異體B，除無糖苷酶加入外。在37℃溫育過夜後樣品經SDS-PAGE電泳，並使用多克隆兔BSSL抗血清進行印跡。1.2.結果1.2.1構建BSSL變異體在表2和圖1中概括了關於全長BSSL，BSSL變異體的修飾。用於產生這些變異體的策略在1.1.部分描述了。對變異體A(SEQ IDNO4)而言，終止密碼引入到穀氨醯胺535位置後，去除了全長蛋白質的最後187個胺基酸。對變異體B(SEQ ID NO5)而言，編碼正巧11個胺基酸的區域和原始翻譯終止子與穀氨醯胺-535融合，因此，這種變異體缺乏所有的重複序列。對變異體C(SEQ IDNO6)而言，含兩個重複序列的片段，插入到穀氨醯胺-535和賴氨酸-712至苯丙氨酸722序列之間。所述重複序列含有與共有序列(Nilsson et al，1990)相同的序列。
為了分析唯一不明確的N-連接的碳水化合物結構(其位置接近活性位點絲氨酸-194)的重要性構建變異體。通過將天冬醯胺-187變成穀氨醯胺而改變潛在的N-糖基化位點獲得變異體N(SEQ IDNO7)。表2和人類BSSL相關的BSSL變異體的胺基酸序列
1.2.2哺乳動物細胞系重組DNA的特徵描述重組DNA樣品從用編碼不同BSSL變異體的表達載體轉染的細胞系中製備。製備的DNA用BamHI消化，在瓊脂糖凝膠上分開，並轉移至雜交膜上。使用的探針是32P標記的BSSL cDNA。雜交結果證實了重組基因的存在，而且載體拷貝數在不同的細胞系大約相等(圖2)。雜交片段的位置反映了各種BSSL序列的長度並與期望大小一致。位置也類似於起源於細菌的用於轉染實驗的DNA，表明在細胞系中沒有主要的載體DNA的重排(圖2)。代表變異體A的DNA一樣品中上邊的雜交信號可能歸因於部分消化。1.2.3在哺乳動物細胞中全長和突變BSSL mRNA的表達為分析不同重組BSSL基因的表達，從分離的細胞系中製備了mRNA。Northern印跡實驗和用32P-標記的BSSL cDNA雜交實驗表明，在含有BSSL裁體(圖3)的所有細胞系中都可檢測到重組mRNA。在對照樣品中沒有雜交，所述對照樣品得自含除BSSL cDNA外的相同載體的細胞系(圖3)。
雜交mRNA的不同長度與cDNAs的修飾一致。在不同樣品中重組BSSLmRNA變異體的穩定狀態水平除了變異體A(圖3)外，幾乎是相同的。變異體A mRNA積累降低的原因尚未知曉，但觀察到兩個細胞系群及分離的克隆。在不同樣品中等量RNA的存在，通過用鼠β-actin探針(圖3，較低組)雜交證實1.2.4生產哺乳動物全長和BSSL變異體收集了源於單個克隆的用全長BSSL及其不同突變形式轉染的C127-細胞培養基並分析BSSL的活性(圖4)。對於全長分子和變異體N、B和C，最高表達克隆的活性範圍是每分鐘每毫升培養基釋放0.7-2.3μmol脂肪酸。和天然人乳中BSSL的比活性比較，此表達水平為每毫升培養基7-23μg。對變異體A而言，所有分析的克隆其活性低於每分鐘每毫升培養基釋放0.05μmol脂肪酸。在Blue-Sepharose柱上濃縮和冷凍乾燥顯示最高活性的克隆，表明的確表達了有活性的酶，儘管表達水平較低不能排除。通過相當低比活性解釋以變異體A部分獲得的低活性可能性。
源於不同轉染實驗克隆的Western印跡顯示於圖5A。BSSL變異體明顯的Mr正如所望。但是應注意到，對全長BSSL及變異體B和C而言，出現了雙條帶。因為所有這三個都有單一完整的N-糖基化位點，而沒出現雙條帶的變異體N缺少N-糖基化位點，所以可能解釋為，雙條帶產生於N-糖基化的差別。因此變異體B應該用N-糖苷酶F消化。如圖5B所示，上面的帶只保留痕量，而下面的帶強度增加，表明只有部分表達的變異體N-糖基化了。
BSSL的特性之一是其可通過初級膽鹽，如膽酸鹽(Hernell，1975)將異性活化。所有不同重組形式的BSSL證明了膽酸鹽活化的相同濃度依賴性(圖6)。在使用的實驗體系中約10mM獲得了最大活性。當將膽酸鹽換成脫氧膽酸鹽(次級膽鹽)，無此活化產生。因此，重組全長及不同的變異體證明了膽鹽活化的同一特異性。1.2.5.大腸桿菌中全長BSSL的表達及生化特性用含位於T7啟動子控制下的人BSSL cDNA的表達載體pGEMEX/BSSL轉化兩個大腸桿菌菌株JM109(DE3)和BL21(DE3)pLysS(Studier et al.，1986)。鑑別來自於兩個菌株的轉化體，將其培養並用IPTG誘導約90分鐘(Studier et al.，1986)。通過使用BSSL cDNA為32P標記的探針，經Northern印跡分析總mRNA表明，兩個菌株中均有效地誘導了表達而且轉錄受到密切調節(圖7A)。明顯的重組BSSL mRNA的大小約2.4kb，和期望長度一致。蛋白質樣品的SDS-PAGE分離及用抗BSSL抗體的免疫測定表明在大腸桿菌中有效地產生了全長BSSL(圖7B)。BL21(DE3)pLysS菌株比JM109(DE)(圖7B)菌株有更多的蛋白質被分泌到周質。
IPTG誘導的大腸桿菌培養基含相當於0.5-4μg蛋白質/ml培養基的活性可溶的BSSL。Western印跡證明20-60％的反應物在不溶的沉澱物中。未誘導的細菌不包含任何明顯的BSSL活性。
來自培養細菌的脂酶活性表明和天然乳中BSSL有同樣的膽鹽依賴性。2.重組全長和突變的膽鹽刺激脂酶的純化及特徵描述2.1.實驗方法2.1.1.酶和酶變異體如上所述構建和表達了重組全長BSSL和BSSL變異體B、C和N。和天然的酶比較，變異體B(SEQ ID NO5)缺少所有16個獨一無二的，O-糖基化的，富含脯氨酸、C-未端重複序列(aa 526-711)，但含有大部分的融合於穀氨醯胺-535的C-未端片段(aa712-722)。變異體C(SEQ ID NO6)含同樣的C-未端片段和在穀氨醯胺-535與賴氨酸-712之間的兩個11個殘基的重複單位。在變異體N(非-N-糖基化變異體，SEQ ID NO7)，負責唯一連接糖的天冬醯胺-187換成了穀氨醯胺殘基。天然BSSL從人乳中按所述方法純化(Blckberg Hernell，1981)。2.1.2.酶分析用阿拉伯乳化的三油酸甘油酯為底物，如所述(Blckberg Hernell，1981)測定了脂酶活性，用膽酸鈉(10mM)為活化膽鹽。此測定的不同變化在
中給出。2.1.3.製備免疫吸附劑按製造者的描述用CMBr，使純化的乳BSSL(5mg)結合到Sepharose上。抗純化的乳BSSL兔產生的多克隆抗血清40ml通過此柱。用0.1M甘氨酸-HCl pH2.5洗脫特異抗體。用固態Tris使pH立即調至8左右。脫鹽和凍幹後，將6mg親和純化抗體與上述Sepharose結合。2.1.4.純化方法含5-25μg重組表達BSSL或BSSL變異體的條件培養基，以每ml配好凝膠10ml培養基與Blue Sepharose混合(Pharmacia，Swedan)。徹底混合30分鐘後，用0.05M Tris-Cl pH7.0，0.05MKCl流洗凝膠；脂酶活性用0.05M Tris-Cl，pH7.0，1.5MKCl洗脫。收集活性峰，對5mM佛多那鈉，pH7.4，0.05M NaCl透析。透析液用於肝素-Sepharose柱。此柱用在5mM佛多那鈉緩衝液，pH7.4中的梯度0.05-1.0M NaCl洗脫。收集含脂酶活性的組分，用於免疫吸附柱，用0.05M Tris-Cl pH7.5，0.1 5M NaCl流洗後，0.1M甘氨酸-HCl、pH2.5洗脫結合的脂酶。用固態Tris使組分的pH立即調到8左右。2.1.5.電泳基本根據Laemmli(1970)方法，進行了十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白質用考馬斯亮藍染色。2.1.6.N-未端序列分析在Applied Biosystems公司的477A脈衝液相測序儀及帶有來於製造商的規範循環程序和化學品的連網苯硫乙內醯脲120A分析儀上進行胺基酸序列分析。從測得的標準蛋白質序列(β-乳球蛋白)計算，最初及重複產量分別為47％和97％。2.2.結果2.2.1.重組BSSL和BSSL變異體的純化主要用在Blue Sepharose柱上層析條件培養基作為濃縮步驟。接著在肝素-Sepharose柱上層析主要是去除培養基中存在的大部分白蛋白得到初步純化。此步驟也說明，重組BSSL分子都具有肝素結合能力。免疫吸附後，所有BSSL變異體，象經SDS-PAGE(圖8)制定的那樣，純度超過90％。全長酶及變異體B和C作為成對物遷移。不同變異體的表觀Mr列於表3。N-未端序列分析對所有8個循環的變異體測出了一個單一順序Ala-Lys-Leu-Gly-Ala-Val-Tyr-Thr-。2.2.2.脂酶活性表3顯示了不同製品的表觀分子量。製品的比活性範圍是每分鐘每毫克蛋白質釋放游離脂肪酸75-120μmol。因此沒有觀察到全長BSSL和BSSL變異體間活性的顯著差別。
所有製品說明絕對需要對抗長鏈三脂醯甘油的初級膽汁鹽(膽酸鈉)活性(圖9A)。脫氧膽酸鈉不能提供任何變異體活性(資料未列出)。但是，一旦結合不同的膽鹽，脫氧膽酸鹽就有雙重作用(圖9B和C)。首先它降低活化必需的膽酸鹽濃度，其次在較高膽鹽濃度下抑制酶的活性。表3重組全長BSSL和BSSL變異體的表觀Mr
2.2.3.重組BSSL和BSSL變異體的穩定性重組BSSL和BSSL變異體與天然乳BSSL顯示了同樣的pH穩定性(圖10)。pH在2.5-3左右所有情況下都有失活發生。pH在3以上，所有變異體是完全穩定的，提供的蛋白質濃度足夠高。這通過加入小牛血清白蛋白或卵清蛋白達到(資料未列出)在所有測試的pH，稀釋的樣品都是不太穩定的，但閾值是一樣的(資料未列出)。圖11顯示和天然乳酶比較，重組酶的熱穩定性。在37-40℃此活性開始降低。變異體(B、C、N)穩定性比全長重組酶和乳酶略低。但是，如果蛋白質濃度通過加入小牛血清白蛋白得到提高，所有變異體在40℃也是穩定的(圖11)。
天然乳BSSL和所有重組變異體對胰蛋白酶都敏感。一種依賴時間的失活獲得了(圖12)。但是，如果膽鹽，即膽酸鹽存在於緩衝液中，脂酶變異體就得到了保護，脂酶活性保留下來(圖12)。
因此，鑑於許多體外特徵，即膽鹽活化、肝素結合、pH和溫度穩定性及對蛋白酶失活的膽鹽保護將不同的BSSL變異體與天然乳BSSL比較，沒有發現顯著差異。3.在轉基因動物中表達3.1.表達裁體的構建為了構建在轉基因動物乳中生產重組人BSSL變異體的表達載體，使用了下列策略(圖13)。
應用Lidberg等人(1992)敘述的方法，獲得了含人BSSL基因不同部分的質粒(pS309、pS310、pS311)。質粒pS309含一個SphI片段，此片段包含5′-非轉錄區至第四內含子的部分序列。質粒pS310含一個SacI片段，此片段含有一從第一內含子的部分序列至第六內含子的部分序列的BSSL變異體基因序列。最後質粒pS311含一個BamHI片段，此片段含BSSL基因的第五內含子的主要部分及缺失第十一外顯子的內含子/外顯子結構的其餘部分。缺失的序列是231bp，它能產生一個編碼BSSL變異體的序列，此變異體實際上含77個胺基酸或比全長BSSL少七個重複單位。產生BSSL變異體(變異體T)的核苷酸序列列於序列表SEQ ID NO8中。變異體T的胺基酸序列列於序列表SEQ ID NO9中。
由於在人BSSL基因第十一外顯子有高度的重複序列，在這種序列克隆進質粒或在細菌中繁殖時，可設想有相當高的重排頻度。根據這種假設，含有截短第十一外顯子的所需BSSL變異體基因得到了鑑定、分離、進行了序列分析。另一個質粒pS283，含部分在HindIII和SacI位點克隆進pUC19的部分人BSSL cDNA，用於基因組序列的融合。質粒pS283也用於獲得合適的限制酶酶切位點，KpnI位於BSSL5′非翻譯前導序列中。
用NcoI和SacI消化質粒pS283，通過電泳分離到一約2.7kb的片段。用NcoI和BspEI消化質粒pS309，分離到一包含BSSL基因5′-部分約2.3kb的片段。用BspEI和SacI消化質粒pS310，分離到一含BSSL基因中間段部分約2.7kb的片段。這三個片段連接在一起，轉化感受態大腸桿菌菌株TG2，經氨基苄青黴素篩選分離轉化體。
從許多轉化體製備了質粒，一個含所要構建物的質粒，叫pS312(圖14)，用於進一步研究。
為了獲得pS311的修飾形式，位於終止密碼下遊的BamHI位點換成SalI位點，便於進一步克隆，使用了下列方法通過BamHI部分消化，使質粒pS311線性化。分離到線性化的片段，將BamHI換成SalI位點的合成DNA接頭(5′-GATCGTCGAC-3′)插入，破壞了BamHI位點。由於有兩個潛在的用於整合合成接頭的位置，所以通過限制酶切割分析所得的質粒。在11外顯子下遊理想位置插入接頭的質粒得到分離，命名為pS313。
為了獲得含有人BSSL變異體基因組序列的最終表達載體構建體，使用現有的表達載體pS314，設計它來調節泌乳期乳腺細胞的階段和組織特異性表達。質粒pS314含一個克隆為NotI片段的鼠乳清酸性蛋白(WAP)基因(Campbell et al.1984)的基因組片段。
基因組片段含約4.5kb的上遊調節序列(URS)，所有四個鼠WAP外顯子及所有內含子序列、約3kb的最後外顯子的下遊序列。獨一無二的KpnI位點位於天然WAP翻譯起始密碼上遊第一個外顯子24bp內。另一個獨一無二的限制酶位點位於第三外顯子內SalI位點。
人BSSL變異體基因組序列用下列方法插入到KpnI和SalI位點間，第一，用KpnI和SalI消化pS314，電泳分離代表裂解質粒的片段，第二，用KpnI和BamHI消化pS312一個約4.7kb，代表BSSL基因5′部分的片段得到分離。第三，用BamHI和SalI消化pS313，分離到人BSSL基因的3′一部分。這三個片段連接起來，轉化感受態大腸桿菌，經氨基苄青黴素選擇後分離轉化體。
質粒從幾個轉化體中得到製備，通過限制酶圖譜和序列分析仔細分析。確定了代表所需的表達載體的一個質粒，命名為pS317(圖15)。
為了移去原核質粒序列，用NotI消化pS317。此後，含人BSSL變異體基因組片段和側翼的鼠WAP序列的重組載體因子經瓊脂糖電泳分離。分離的片段在注進鼠胚胎之前進一步經電洗脫純化。
在轉基因鼠乳中表達人BSSL變異體的重組基因顯示於圖16。3.2.轉基因動物的產生按照3.1.部分從質粒pS317分離一個NotI片段。此DNA片段含連接到編碼人BSSL變異體基因組序列的鼠WAP啟動子。這種分離片段以3ng/μl的濃度，將其注射進從供體小鼠獲取的350C57B1/6J×CBA/2J-f2胚胎的原核中，供體小鼠預先用5IU懷孕母馬牛清用於排卵過速的促性腺激素處理。C57B1/6J×CBA/2J-f1動物從Bomholtgard Breeding和Research Center LTD，Ry，Denmark獲得。從輸卵管採集胚胎後，用M2培養基(Hogan etal.1986)中的透明質酸酶處理，從丘細胞分離胚胎。清洗後，將胚胎轉至M16培養基(Hogan et al，1986)，保存在5％CO2孵箱中。使用液壓微操作器和帶有Nomarski鏡片的Nikon倒置顯微鏡，在輕石蠟油下的M2微粒中進行注射。注射後，267個看上去健康的胚胎埋植進12個假孕的，經腹膜內注射0.3個ml，2.5％AvertinC57B1/6J×CBA/2J-f1受體中。從動物生後三周獲得的尾屍檢標本DNA，經PCR分析，識別整合轉基因的小鼠。用Southern Blot分析證實了陽性結果。
為收集乳，雌性泌乳期動物用2IU催產素經腹膜內注射，十分鐘後用0.40ml，2.5％的Avertin腹膜內麻醉。集乳器通過一個矽化過的管附在乳頭上，通過輕輕按摩哺乳動物腺體，將乳收集到一個1.5ml的Eppendorf管中。乳量隨泌乳天數改變，每個小鼠及每次收集在0.1和0.5ml之間。3.3.轉基因小鼠中BSSL變異體的表達通過剪尾樣本製備的DNA分析鑑別轉基因鼠。組織樣品與蛋白酶K溫育，經酚/氯仿抽提。如存在代表表達載體片段的異源引入的DNA擴增特異的片段的帶引物的聚合酶鏈反應中使用分離的DNA。用DNA雜交實驗分析動物以證實PCR數據並檢測可能的重排，整合載體元件的結構並得到有關整合載體元件拷貝數的資料。
在一套實驗中，用兩種方法分析了31隻小鼠，結果表明，一隻鼠帶有pS317的異源DNA載體元件。PCR分析和雜交實驗的結果一致(圖17)。
總共65個測試動物，有10個是pS317轉基因的。
將鑑定帶有載體DNA元件(建立者動物)的小鼠配對，F1動物用同樣的方法進行轉基因分析。
通過瓊脂糖福馬林凝膠電泳分離在泌乳期從pS317轉基因雌性動物不同組織中分離的RNA，然後轉至濾紙上，以32P一標記的BSSLcDNA為探針雜交。獲得的結果證明，在泌乳期表達在乳腺表達受限制(圖18)。
從麻醉的用催產素處理誘導泌乳的建立者動物收集乳樣品，分析重組BSSL變異體的存在。此是通過SDS-PAGE電泳，轉移至硝酸纖維素膜，及與產生的抗天然人BSSL的多克隆抗體孵育實現。
獲得的結果證實了轉基因小鼠乳中重組人BSSL變異體的表達。圖19證實了轉基因小鼠乳中重組8SSL變異體的存在。SDS-PAGE分離及源於不同pSB17轉基因小鼠的乳樣品免疫印跡分析顯示，和全長源於轉基因pS314的小鼠乳中重組BSSL比較，帶有還原性表觀分子量的重組BSSL產量高。質粒pS314類似pSB17，不同的是，pS314含全長人BSSL cDNA，不含基因組變異體。出現在所有鼠乳樣品中的雙帶代表鼠BSSL，並因此顯出抗血清的交叉反應。出現在圖19的第9泳道明顯的雙帶(包含純化的鼠BSSL)的觀察進一步支持這個結論。
穩定的轉基因動物系產生了。
用相似的方法，也可製備能表達人BSSL變異體的其它轉基因動物，如兔、奶牛或綿羊。保藏根據布達佩斯條約在DSM(Deutsche Sammlung VonMikroorganismen und Zellkulturen)保藏了下列質粒
附圖概述圖1A.用於表達不同BSSL變異體的BPV為基本載體的圖譜。B.分析不同BSSL變異體的圖例說明。FL表示全長BSSL。活性位點用圓圈表示，潛在的N-連接的碳水化合物位點用三角形表示。含重複序列的區域用條線區表示，保守的C-未端用塗滿黑色區表示。圖2源於表達BSSL變異體細胞系的DNA的Southern印跡分析。分析了從表達全長BSSL(FL)、變異體A(A)、變異體B(B)、變異體C(C)和變異體N(N)製備的DNA。用BamHI消化5μg各自製備的細胞DNA(左)及1ng純化的細菌裁體DNA(右)。DNA樣品在瓊脂糖凝膠上分離，轉移至GeneScreen Plus膜上，與32P-標記的人BSSL cDNA雜交。圖3從表達BSSL變異體的細胞系分離的RNA的Northern印跡分析。分析了從生產全長BSSL(FL)、變異體A(A)、變異體B(B)、變異體C(C)、變異體N(N)的細胞系製備的10μg總RNA。用來自C127細胞系的RNA作負對照(-)(上邊組)所述細胞系含有與圖1中載體相同的BPV-載體，除了編碼一個與BSSL不相干的蛋白質外，用32P-標記的BSSL cDNA與濾膜雜交。用鼠β-肌動蛋白cDNA為探針，與濾膜再次雜交。β-肌動蛋白mRNA信號(下邊組)用作上樣到每一泳道mRNA量的內標對照。圖4在用全長和突變形式的人BSSL轉染的C127細胞中BSSL的表達活性。C127細胞用不同的BSSL構建體轉染全長BSSL(FL)、變異體N(N)、變異體C(C)、變異體B(B)、變異體A(A)。起始生長期後，篩選個別克隆，使之成長至匯合。篩選的克隆(n)數表示在圖中。在條件培養基上確定脂酶活性。其數值用每ml條件培養基每分鐘釋放的游離脂肪酸的μmol表示。圖5A.全長和突變的重組BSSL的Western印跡分析。脂酶活性的量表示為，每分鐘釋放脂肪酸的μmol，用於凝膠是，全長0.2(泳道1)、變異體NO.16(泳道2)、變異體C0.6(泳道3)、變異體B0.8(泳道4)及天然BSSL0.1(泳道5)。所用的抗血清是在抗從人乳純化的BSSL的兔中產生的。分子大小標記(Prestained SDS-PAGEStandard，Low Range，BioRad)標在左邊。B.N-糖苷酶F處理的變異體B的Western印跡。用實驗方法所述的N-糖苷酶F消化變異體B。泳道1是未處理的，泳道2是處理的變異體B。圖6全長及突變BSSL的膽鹽依賴性。在改變濃度的膽酸鈉(實線)或脫氧膽酸鈉(斷線)存在的情況下，在來自全長重組BSSL(*)、變異體A(□)、變異體B(▲)變異體C(■)、變異體N(●)及純化的人乳BSSL(○)的條件培養基上確定脂酶活性。對A變異體而言，按實驗方法所述，在Blue Sepharose上濃縮條件培養基。除了最大活性只有其它酶的1/10變異體A外，選擇各來源的酶量以獲得同樣的最大活性水平。對照實驗表明生長培養基不影響活性水平或天然BSSL的膽鹽依賴性(數據未列出)。圖7A.使用pGEMEX通過不同的大腸桿菌菌株產生的BSSL Northern印跡。細菌用實驗方法中所述的IPTG進行誘導。
實驗條件見圖2所示。泳道1，菌株BL21(DE3)pLysS，未誘導的泳道2，菌株BL21(DE3)pLysS，誘導的；泳道3，菌株JM109(DE3)，未誘導的；泳道4，菌株JM109(DE3)，誘導的。B.使用抗純化的乳BSSL的抗體8-18％SDS-PAGE Western印跡表明，使用pGEMEX在不同大腸桿菌菌株中重組BSSL的表達。用IPTG誘導細菌，按實驗方法所述從裂解液製備細胞質和周質蛋白質。上樣至泳道2-5(周質製品)和7-10(胞質製品)的細菌蛋白質量代表了使菌株和生產水平成比例的相同培養量。泳道1，Pharmacia分子大小標記；泳道2和3，菌株JM109(DE3)，誘導的；泳道3和7，菌株JM109(DE3)，未誘導的；泳道4和10，菌株BL21(DE3)pLysS，誘導的；泳道5和9，菌株BL21(DE3)pLysS，未誘導的；泳道6，25ng純化的天然BSSL。圖8純化的重組BSSL及BSSL變異體的SDS-PAGE。全長重組BSSL(FL)和BSSL變異體N、B及C按所述純化。除了B用1.5μg外，每種用3μg純化的天然乳BSSL(NAT)用5μg。分子大小標記的位置在左邊。圖9通過膽酸鈉，脫氧膽酸鈉對重組BSSL及BSSL活化的作用。在無(左邊組)或存在5mM(中間組)或10mM(右邊組)脫氧膽酸鹽的條件下，用不同濃度的膽酸鈉分析了純化的重組全長BSSL(●)、重組BSSL變異體B(○)、C(■)和N(▲)、及純化的天然乳BSSL(□)製品的脂酶活性。圖10重組BSSL和BSSL變異體在不同pH的穩定性。在37℃，pH2-8的不同緩衝液中溫育天然BSSL、重組全長BSSL及BSSL變異體。所有緩衝液均含1mg/ml牛血清白蛋白，30分鐘後，撤去分裝品，分析脂酶活性，符號的解釋見圖9的說明。圖11重組BSSL和BSSL變異體的熱穩定性。在50mM Tris-Cl緩衝液pH7.5，指定的溫度下溫育純化的重組全長BSSL.BSSL變異體及天然乳BSSL。一組牛血清白蛋白(BSA)樣品加至1mg/ml。30分鐘後撤出樣品並分析脂酶活性。活性表示為在0分鐘每份樣品的活性百分比，符號的解釋見圖9的說明。圖12膽鹽對通過胰蛋白酶使重組BSSL及BSSL變異體失活的影響。在25℃，有(實線)無(斷線)10mM膽酸鈉存在條件下，將純化重組全長BSSL、BSSL變異體及天然乳BSSL(15μl含14μg)加到含10μg胰蛋白酶(TPCK-胰蛋白酶、Boehringer-Mannheim)60μl，1.0M Tris-Cl pH7.4的溶液中。在指定時間，撤除測定樣品，分析脂酶活性。數值表示為無胰蛋白酶條件下對照溫育中獲得值的百分比。符號解釋見圖9的說明。圖13生產質粒pS317的方法，更詳細資料見3.1部分圖14質粒pS312的圖示結構。圖15質粒pS317的圖示結構。圖16表示3.1部分所述WAP第一外顯子內人BSSL變異體基因組結構物理上引入的物理圖譜。圖17A.用於轉基因動物鑑定的PCR引物的定位圖示。5′-引物位於在融合上遊位置-148bp開始的WAP序列內，所述融合在WAP和BSSL變異體之間。3′-引物位於編碼融合點下遊400bp的第一BSSL變異體內含子中。B.使用的PCR引物序列C.瓊脂糖凝膠顯示潛在建立者動物典型的PCR分析。M分子量標記。泳道1產生於質粒pS317的對照PCR產物。泳道2-13；從潛在建立者動物製備的DNA進行PCR反應。圖18從pS317轉基因雌性小鼠分離的不同組織製備的RNA Northern印跡分析。在泌乳第四天分離組織。通過瓊脂糖-甲醛分離分析源於每一組織的10μg總RNA，轉移其至濾膜上，與32P-標記的人BSSLcDNA進行雜交。泳道含Mg乳腺Li肝；Ki腎；Sp脾；He心；Lu肺；Sg唾液腺；Br腦。RNA的核苷酸大小在右邊標出。圖19從pS317轉基因小鼠、全長cDNA載體pS314轉基因小鼠及對照動物乳的Western印跡。樣品經SDS-PAGE分離，轉移至Immobilon濾膜上，用抗天然人BSSL產生的抗血清進行免疫印跡分析。泳道1分子量標記；泳道2、3和42μl來自3個pS317建立者FO#91F1雌仔的乳(F1 30、31和33)。泳道52μl來自建立者#90pS317的乳。泳道6、7和82μl源於非BSSL轉基因動物乳；泳道9純化的鼠BSSL；泳道10純化的人天然BSSL。參考文獻Abouakil，N.，Rogalska，E.，and Lombardo，D.(1989)Biochim.BiophysActa 1002，225-230Atkinson，S.A.，Brvan，M.H.，and Andersson，G.H.(1981)J.Pediatr.99，617-624Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.(eds.)inCurrent Protocols in Molecular Biology(JohnWiley Sons，New York；edition of 1992)Baba，T.，Downs，D.，Jackson，K.W.，Tang，J. and Wang，C.S.(1991)Biochemistry 30，500-510.Bembck，S.，Blckberg，L.，and Hernell，O.(1990)J.Clin.Invest.85，1221-1226Bjrksten，B.，Burman，L.G.，deChateau，P.，Fredrikzon，B.，Gothefors，L.Hemell，O.(1980)Br.Med.J.201，267-272.Blckberg，L. Hernell，O.(1981)Eur.J.Biochem 116，221-225.Blckberg，L.and Hemell，O.(1983)FEBS Lett.157，337-341Campbell，S.M.，Rosen，J.M.，Hennighausen，L.G.，Strech-Jurk，U.andSippel，A.E.(1984)Nucleic Acid Res.12，8685-8697.Chappell，J.E.，Clandinin，M.T.，Kearney-Volpe，C.，Reichman，B.，andSwyer，P.W.(1986)J.Pediatr.108，439-447Fontaine，R.，Carter，C.，and Hui，D.(1991)Biochemistry 30，7008-1014Graham，F.L.，and Van der Eb，A.J.(1973)Virology 52，456-467Hamosh，M.，Freed，L.M.，York，C.M.，Sturman，J.A，and Hamosh，P.(1986)Fed.Proc.45，1452Han，J.H.，Stratowa，C.，and Rutter，W.J.(1987)Biochemistry 26，1617-1625Hennighausen，L.，Ruiz，L. Wall，R(1990)Current Opinion inBiotechnology 1，74-78.Hernell，O.(1975)Eur.J.Clin.Invest.5，267-272Hernell，O.，Blckberg，L.，and Lindberg，T.inTextbook ofgastroenterology and nutrition in infancy(Lebenthal，E.ed)pp.209-217(Raven Press，New York 1989)Hernell，O.，Staggers，J.E.and Carev， M.C.(1990)Biochemistry 29，2041-2056Hernell，O.and Blckberg，L.inEncyclopedia of human biology(Dulbecco，R.ed.)Vol.3，pp.47-56(Academic Press，San Diego 1991)Hernell，O.，Blckberg，L.，Chen，Q.，Sternby，B.and Nilsson，(1993)J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.(In press)Hogan，B.，Constantini，F.and Lacy，E.(1986)Manipulating the mouseembryo.A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Hui，D.and Kissel，J.A.(1990)Febs Lett.276，131-134.Kyger，E.M.，Wiegand，R.C.，and Lange，L.G.(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.164.1302-1309Laemmli，U.K.(1970)Nature(London)227，680-685Lidberg，U.，Nilsson，J.，Strmberg，K.，Stenman，G.，Sahlin，P.，Enerbck，S.G.and Bjursell，G.(1992)Genomics 13，630-640Lusky，M.，and Botchan，M.R.(1984)Cell 36，391-401Nilsson，J.，Blckberg，L.，Carlsson，P.，Enerbck，S.，Hemell，O.andBjursell，G.(1990)Eur.J.Biochem.192，543-550.Pavlakis，G.N.，and Hamer，D.H.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，397-401Reue，K.，Zambaux，J.，Wong，H.，Lee，G.，Leete，T.H.，Ronk，M.，Shively，J.E.，sternby，B.，Borgstrm，B.，Ameis，D.and Schotz，M.C.(1991)J.Lipid.Res.32，267-276.Sarver，N.，Byme，J.C.，and Howell，P.M.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79，7147-7151Studier，F.W.and Moffat，B.A.(1986)J.Mol.Biol. 189，113-130Willamson，S.，Finucane，E.，Ellis，H.，and Gamsu，H.R.(1978)Arch.Dis.Childhood 53，555-563
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)名字AB ASTRA(B)街道Kvarnbergagatan 16(C)市 Sodertalje(E)國家Sweden(F)郵編(ZIP)S-151 85(G)電話+46-8-553 260 00(H)電傳+46-8-553 288 20(I)電掛19237 astra s(ii)發明題目新多肽(iii)序列數9(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC可容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release #1.0，Version #1.25(EPO)(vi)在先申請資料(A)申請號SE 9300686-4(B)申請1993.3.1(vi)在先申請資料(A)申請號SE 9300722-7(B)申請日1993.3.4(2)SEQ ID NO1的資料
(i)序列特徵(A)長度2428bp(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(iii)假設無(iii)反義無(vi)來源(A)有機體Homo sapiens(F)組織類型乳腺(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置82..2319(D)其它資料/產物＝「膽鹽刺激的脂酶」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置985..1173(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)應置1174..1377(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置1378..1575(ix)特徵
(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置1576..2415(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞mat_肽(B)位置151..2316(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞polyA_信號(B)位置2397..2402(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_區域(B)位置1756..2283(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞5′UTR(B)位置1..81(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1756..1788(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1789..1821(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1822..1854(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位
(B)位置1855..1887(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1888..1920(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1921..1953(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1954..1986(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1987..2019(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置2020..2052(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置2053..2085(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置2086..2118(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置2119..2151
(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置2152..2184(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置2185..2217(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置2218..2250(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置2251..2283(xi)序列描述SEQ ID NO1ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTCTCAAGA TAATGCAAAG 60AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG CAA CTG GTT111Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val-23 -20 -15GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC GCG AAG CTG159Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu-10 -5 1GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA GGC GTC AAT AAG AAG207Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys5 l0 15CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC ATC CCC TTC255Leu Gly Leu Leu Gly Asp Set Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe20 25 30 35GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA CAT CCT GGC TGG303Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp40 45 50CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC351Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala55 60 65ACC ATC ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC399Thr Ile Thr Gln Asp Set Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu70 75 80AAC ATT TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA GTC TCC CGG GAC CTG CCC 447Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg Asp Leu Pro85 90 95GTT ATG ATC TGG ATC TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT 495Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Set Gly His100 105 110 115GGG GCC AAC TTC CTC AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC 543Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala120 125 130ACA CGC GGA AAC GTC ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC 591Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro135 140 145CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA GGT AAC TAT GGC 639Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly150 155 160CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGC AAT ATC GCG 687Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala165 170 175GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG GAG TCT GCT 735Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala180 185 190 195GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC AAG GGC 783Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly200 205 210CTC ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTG GCC CTG AGT CCC TGG 831Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp215 220 225GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG GTG GCT GAG AAG 879Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys230 235 240GTG GGT TGC CCT GTG GGT GAT GCC GCC AGG ATG GCC CAG TGT CTG AAG 927Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys245 250 255GTT ACT GAT CCC CGA GCC CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA 975Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala260 265 270 275GGC CTG GAG TAC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT GTC ATT1023Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val 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395 400CAC AGA GCC AAT GCC AAG AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC1407His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser405 410 415CAT CCC TCT CGG ATG CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT1455His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp Hls420 425 430 435GCA GAT GAC ATT CAG TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG1503Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr440 445 450GGC TAC CGG CCC CAA GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC1551Gly Tyr Arg Pro Gin Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr455 460 465TGG ACC AAC TTT GCC AAA ACA GGG GAC CCC AAC ATG GGC GAC TCG GCT1599Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala470 475 480GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG GAA AAC AGC GGC TAC CTG1647Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Ash Ser Gly Tyr Leu485 490 495GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC ATG AAG CGG AGC CTG AGA1695Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg500 505 510 515ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC TAT CTG GCG CTG CCC ACA1743Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr520 525 530GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC CCC ACA GGG GAC TCC GAG1791Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu535 540 545GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG1839Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro550 555 560CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC1887Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser565570575GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG1935Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val580 585 590 595CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC1983Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp600 605 610TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC2031Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro615 620 625GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT2079Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly630 635 640GAC GCC GGG CCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC2127Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro645 650 655CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG ACC CCC ACG2175Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Thr Pro Thr660 665 670 675GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC2223Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala680 685 690CCC CCT GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCT GAG GCT GCC CCT GTG CCC CCC2271Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro Val Pro Pro695 700 705ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATG CCT GCA GTC ATT AGG TTT TAGCGTCCCA 2326Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile Arg Phe710 715 720TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGAGT GGGACCCCAG GGGCTCCCCT CCCATCTTGA 2386GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCTA AAAAAAAAAA AA 2428(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特徵(A)長度745個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val Val Leu Gly Leu Thr Cys-23 -20 -15 -10Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu-5 1 5Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp10 15 20 25Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala30 35 40Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala45 50 55Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser60 65 70Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln75 80 85Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr90 95 100 105Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His Gly Ala Ash Phe Leu Asn110 115 120Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile125 130 135Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr140 145 150Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met155 160 165Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro170 175 180 185Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser190 195 200Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile205 210 215Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro220 225 230Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly235 240 245Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala250 255 260 265Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met270 275 280Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro285 290 295Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile300 305 310Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met315 320 325Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr330 335 340 345Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys350 355 360Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln365 370 375Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe380 385 390Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys395 400 405Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro410 415 420 425Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr430 435 440Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp445 450 455Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys460 465 470Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu475 480 485Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met490 495 500 505Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr510 515 520Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala525 530 535Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro540 545 550Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly555 560 565Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro570 575 580 585Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser590 595 600Gly Ala Pro Pro Val Pro Prc 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715 720Arg Phe(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特徵(A)長度535個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質
(iii)假設無(vi)來源(A)有機體Homo sapiens(F)組織類型乳腺(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置1..535(D)其它資料/標記＝變異體_A(xi)序列描述SEQ ID NO4Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1 5 10 15Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly20 25 30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His35 40 45Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys50 55 60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65 70 75 80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg85 90 95Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly100 105 110Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu115 120 125Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val lle Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg130 135 140Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly145 150 155 160Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg165 170 175Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly180 185 190Glu Ser Ala Gly Gly 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His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser485 490 495Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg500 505 510Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala515 520 525Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile530 535 540Arg Phe545(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特徵(A)長度568個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(vi)來源(A)有機體Homo sapiens(F)組織類型乳腺(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置1..568(D)其它資料/標記＝變異體_C(xi)序列描述SEQ ID NO6Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1 5 10 15Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly20 25 30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His35 40 45Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys50 55 60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65 70 75 80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg85 90 95Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly100 105 110Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu 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Pro Pro Thr Gly Asp Ser Lys Glu Ala545 550 555 560Gln Met Pro Ala Val Ile Arg Phe565(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特徵(A)長度722個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(vi)來源(A)有機體Homo sapiens(F)組織類型乳腺
(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置1..722(D)其它資料/標記＝變異體_N(xi)序列描述SEQ ID NO7Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1 5 10 15Ash Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly20 25 30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His35 40 45Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys50 55 60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65 70 75 80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg85 90 95Asp Leu Pro Val Met Ile Trp lle Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly100 105 110Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu115 120 125Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg130 135 140Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly145 150 155 160Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg165 170 175Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Gln Ile Thr Leu Phe Gly180 185 190Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr195 200 205Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu210 215 220Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val225 230 235 240Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln245 250 255Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val260 265 270Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val275 280 285Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr290 295 300Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp305 310 315 320Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn325 330 335Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr340 345 350Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr355 360 365Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val370 375 380Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala385 390 395 400Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr405 410 415Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly420 425 430Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala435 440 445Thr Pro Thr Gly Tyr Ar9 Pro Gln Asp Ar9 Thr Val Ser Lys Ala Met450 455 460Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly465 470 475 480Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser485 490 495Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg500 505 510Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala515 520 525Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly530 535 540Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Set Glu Thr Ala545 550 555 560Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr565 570 575Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala580 585 590Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro595 600 605Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly610 615 620Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro625 630 635 640Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser645 650 655Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val660 665 670Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp675 680 685Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro690 695 700Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile705 710 715 720Arg Phe(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特徵(A)長度2184bp(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假設無(iii)反義無(vi)來源(A)有機體Homo sapiens(F)組織類型乳腺(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置82..2088
(D)其它資料/標記＝變異體_T(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞mat_肽(B)位置151..2085(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_區域(B)位置1756..2052(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1756..1788(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1789..1821(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1822..1854(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1855..1887(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1888..1920(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1921..1953
(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1954..1986(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置1987..2019(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞重複_單位(B)位置2020..2052(xi)序列描述SEQ ID NO8ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTCTCAAGA TAATGCAAAG60AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG CAA CTG GTT 111Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val-23 -20 -15GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC GCG AAG CTG 159Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu-10 -5 1GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA GGC GTC AAT AAG AAG 207Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys5 10 15CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC ATC CCC TTC 255Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe20 25 30 35GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA CAT CCT GGC TGG 303Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp40 45 50CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC 351Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala55 60 65ACC ATC ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC 399Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu70 75 80AAC ATT TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA GTC TCC CGG GAC CTG CCC 447Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg Asp Leu Pro85 90 95GTT ATG ATC TGG ATC TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT 495Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His100 105 110 115GGG GCC AAC TTC CTC AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC 543Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala120 125 130ACA CGC GGA AAC GTC ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC 591Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro135 140 145CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA GGT AAC TAT GGC 639Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly150 155 160CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG AAT ATC GCG 687Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala165 170 175GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG GAG TCT GCT 735Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala180 185 190 195GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC AAG GGC 783Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly200 205 210CTC ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTG GCC CTG AGT CCC TGG 831Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp215 220 225GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG GTG GCT GAG AAG 879Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys230 235 240GTG GGT TGC CCT GTG GGT GAT GCC GCC AGG ATG GCC CAG TGT CTG AAG 927Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys245 250 255GTT ACT GAT CCC CGA GCC CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA 975Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala260 265 270 275GGC CTG GAG TAC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT GTC ATT 1023Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile280 285 290GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG ATC AAC CTG TAC GCC AAC GCC 1071Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala295 300 305GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC GGC CAC ATC 1119Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile310 315 320TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG AAA GTC 1167Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val325 330 335ACG GAG GAG GAC TTC TAC AAG CTG GTC AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG 1215Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys340 345 350 355GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG ACC TTT GAT GTC TAC ACC GAG TCC TGG 1263Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp360 365 370GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG AAT AAG AAG AAG ACT GTG GTG GAC TTT1311Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe375 380 385GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG GTG CCC ACC GAG ATT GCC CTA GCC CAG1359Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln390 395 400CAC AGA GCC AAT GCC AAG AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC1407His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser405 410 415CAT CCC TCT CGG ATG CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT1455His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His420 425 430 435GCA GAT GAC ATT CAG TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG1503Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr440 445 450GGC TAC CGG CCC CAA GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC1551Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr455 460 465TGG ACC AAC TTT GCC AAA ACA GGG GAC CCC AAC ATG GGC GAC TCG GCT1599Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala470 475 480GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG GAA AAC AGC GGC TAC CTG1647Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu485 490 495GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC ATG AAG CGG AGC CTG AGA1695Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg500 505 510 515ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC TAT CTG GCG CTG CCC ACA1743Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr520 525 530GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC CCC ACA GGG GAC TCC GAG1791Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu535 540 545GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG1839Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro550 555 560CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC1887Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser565 570 575GGG CCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG1935Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val580 585 590 595CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC1983Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp600 605 610TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCT2031Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro615 620 625GTG CCC CCC ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATG CCT GCA GTC ATT2079Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile630 635 640AGG TTT TAGCGTCCCA TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGAGT GGGACCCCAG 2135Arg Phe645GGGCTCCCCT CCCATCTTGA GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCT 2184(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特徵(A)長度668個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val Val Leu Gly Leu Thr Cys-23 -20 -15 -10Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu-5 1 5Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp10 15 20 25Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala30 35 40Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala45 50 55Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser60 65 70Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln75 80 85Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr90 95 100 105Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn110 115 120Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile125 130 135Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr140 145 150Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met155 160 165Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro170 175 180 185Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser190 195 200Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile205 210 215Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro220 225 230Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly235 240 245Asp Ala Ala Arg Met Ala G1n Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala250 255 260 265Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met270 275 280Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro285 290 295Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile300 305 310Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met315 320 325Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr330 335 340 345Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys350 355 360Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln365 370 375Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe380 385 390Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys395 400 405Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro410 415 420 425Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr430 435 440Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp445 450 455Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys460 465 470Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu475 480 485Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met490 495 500 505Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr510 515 520Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala525 530 535Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro540 545 550Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly555 560 565Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro570 575 580 585Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Prc Pro Thr Gly Asp Ser590 595 600Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val605 610 615Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Asp Asp620 625 630Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile Arg Phe635 640 645 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis) INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis) INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis) INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis) INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis) INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis) INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis) INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis) INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis)
權利要求
1.一種編碼不到722個胺基酸的多肽的核酸分子，所述多肽是一種BSSL變異體，所說BSSL變異體含SEQ ID NO3所示第536-722個殘基的部分胺基酸序列。
2.根據權利要求1的核酸分子，其中所說的BSSL變異體在其C-末端有一個苯丙氨酸殘基。
3.根據權利要求1或2的核酸分子，其中所說BSSL變異體在其C-末端部分含有序列Gln-Met-Pro。
4.根據權利要求1-3的任一權利要求的核酸分子，其中所說BSSL變異體在其C-末端部分含SEQ ID NO3中殘基第712-722所示的胺基酸序列。
5.根據權利要求1-4的任一權利要求的核酸分子，其中所述BSSL含不到16個重複單位。
6.根據權利要求1的編碼多肽的核酸分子，所述多肽的胺基酸序列與序列表SEQ ID NO5、6或9所示的胺基酸序列至少90％同源。
7.根據權利要求6的編碼多肽的核酸分子，所述多肽含序列表SEQ ID NO5、6或9所示的胺基酸序列。
8.一種編碼多肽的核酸分子，所述多肽的胺基酸序列與序列表SEQ ID NO7所示的胺基酸序列至少90％同源，但編碼在187位置為天冬醯胺的多肽的那些核酸分子除外。
9.根據權利要求8的編碼多肽的核酸分子，所述多肽含序列表SEQ ID NO7所示的胺基酸序列。
10.序列表SEQ ID NO5、6、7或9所示的多肽。
11.由根據權利要求1-9的任一權利要求的核酸序列編碼的多肽。
12.基本上純的形式的權利要求10或11的多肽。
13.含根據權利要求1-9的任一權利要求的核酸分子的雜種基因。
14.一種含權利要求13的雜種基因的可複製的表達載體。
15.根據權利要求14的載體，所述載體為牛乳頭狀瘤病毒載體pS258、pS259或pS299。
16.含有權利要求13雜種基因的細胞。
17.根據權利要求16的細胞，此細胞來自鼠細胞系C127或大腸桿菌。
18.一種生產重組多肽的方法，所說方法包括(i)將按照權利要求1-9的任一權利要求的核酸分子插入能在特異的宿主細胞或有機體中複製的雜種基因，(ii)將所得的重組雜種基因引入宿主細胞或有機體；(iii)在培養基內或上鑑定和生長產生的細胞，或鑑定和繁殖有機體，以便表達多肽；(iv)回收多肽。
19.根據權利要求18的方法、其中雜種基因含於牛乳頭狀瘤病毒裁體pS258、pS259或pS299。
20.一種表達系統，包含能在含所述雜種基因的宿主細胞或有機體中表達的雜種基因，以致於當雜種基因表達時生產重組多肽，所說雜種基因是通過將權利要求1-9的任一權利要求的核酸序列插入能調節所述雜種基因表達的基因中而產生。
21.產生能表達BSSL變異體的轉基因非人類哺乳動物的方法，該方法包括(a)將權利要求20的表達系統引入非人類哺乳動物受精卵或胚胎細胞，以便將表達系統摻入哺乳動物種系，(b)將所得的被引入的受精卵或胚胎發育成成年雌性非人類哺乳動物。
22.生產能表達BSSL變異體並實質上不能由哺乳動物本身表達BSSL的轉基因非人類哺乳動物的方法，包括(a)損壞哺乳動物的BSSL表達能力，以致於實質上沒有哺乳動物BSSL表達，然後將權利要求20的表達系統插入哺乳動物種系，這樣在哺乳動物中表達BSSL變異體；和/或(b)用按照權利要求20的表達系統替代哺乳動物BSSL基因或其部分基因。
23.在其基因組中含權利要求1-9的任一權利要求的DNA序列的轉基因非人類哺乳動物。
24.根據權利要求23的轉基因非人類哺乳動物，其中所述DNA序列存在於哺乳動物種系中。
25.根據權利要求23或24的轉基因非人類哺乳動物，其中所述DNA序列存在於哺乳動物乳蛋白基因中。
26.根據權利要求23-25的任一權利要求的轉基因非人類哺乳動物，選自小鼠、大鼠、兔、綿羊、豬和牛。
27.基據權利要求23-26的任一權利要求的轉基因非人類哺乳動物的後代。
28.從根據權利要求23-27的任一權利要求的轉基因非人類哺乳動物獲取的乳。
29.含有根據權利要求28乳的嬰兒膳食配方。
30.含有根據權利要求10-12的任一權利要求多肽的嬰兒膳食配方。
31.用權利要求10-12的任一權利要求的多肽補充嬰兒食物配方的嬰兒膳食配方生產方法。
32.權利要求10-12的任一權利要求的多肽作為嬰兒食物補充劑的用途。
33.含權利要求10-12的任一權利要求的多肽的藥物組合物。
34.在治療中應用的權利要求10-12的任一權利要求的多肽。
35.按權利要求10-12的任一權利要求的多肽在製備用於治療與外分泌胰腺功能生理障礙相關的藥物中的應用。
36.根據權利要求35的應用，用於製造治療膽囊纖維化藥物。
37.根據權利要求35的應用，用於製造治療慢性胰腺炎的藥物。
38.根據權利要求35的應用，用於製造治療脂肪吸收不良的藥物。
39.根據權利要求35的應用，用於製造治療脂溶性維生素吸收不良的藥物。
40.根據權利要求35的應用，用於製造治療由生理原因所致脂肪吸收不良的藥物。
41.根據權利要求35的應用，用於製造改進膳食脂類的利用的藥物。
42.根據權利要求35的應用，用於製造提高早產兒膳食脂類的利用率的藥物。
全文摘要
本發明涉及作為膽鹽刺激的脂酶(BSSL；EC3.1.1.1)變異體的新多肽。還涉及編碼所述多肽的DNA分子，及含所述DNA分子的亞產物。本發明還涉及生產所述的BSSL變異體以及生產能表達BSSL變異體的轉基因非人類哺乳動物的方法。此外，本發明涉及所述的轉基因動物以及含有來自所述轉基因動物的乳的嬰兒配方。本發明還涉及含所述多肽的藥物組合物，以及所述多肽和DNA分子對於藥物製造的用途。
文檔編號C12N15/85GK1121355SQ94191848
公開日1996年4月24日 申請日期1994年2月25日 優先權日1993年3月1日
發明者L·布拉克堡, M·艾龍, L·漢森, O·赫奈爾, L·隆德堡, M·施特龍維斯特, J·特奈爾 申請人:阿斯特拉公司