腫瘤抗原蛋白及其基因和用途的製作方法

2023-08-13 11:16:46 1

專利名稱：腫瘤抗原蛋白及其基因和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的腫瘤抗原蛋白和編碼相同蛋白的基因、抗所述腫瘤抗原蛋白的抗體以及採用這些物質治療、防止或診斷腫瘤的方法。
雖然長期以來不了解CTL攻擊自身腫瘤細胞的靶分子，但是免疫學和分子生物學的最近進展已經逐漸揭示了這類靶分子。準確地說，已經發現CTL利用T細胞受體(TCR)識別稱為腫瘤抗原肽的肽和主要組織相容性複合體Ⅰ類抗原(MHCⅠ類抗原，在人類稱為HLA抗原)之間的複合物，由此攻擊自身腫瘤細胞。
腫瘤抗原肽產生自腫瘤特異性蛋白即腫瘤抗原蛋白。因此，該蛋白在細胞內合成，然後在細胞質被蛋白酶體降解為肽。另一方面，在內質網形成的MHCⅠ類抗原(HLA抗原)當結合至上述腫瘤抗原肽時，經高爾基體內側轉運到高爾基體外側即成熟側，然後攜帶到它們作為抗原提呈的細胞表面。腫瘤特異性CTL識別作為抗原提呈的該複合物，並通過細胞毒性效應或產生淋巴因子呈現其抗腫瘤效應(Rinsho-Menneki，27(9)1034-1042，1995)。因為這一系列作用的闡明，已經成為可能的是，通過使用在患者中增強腫瘤特異性CTL的腫瘤抗原蛋白或腫瘤抗原肽作為所謂的癌症疫苗來治療腫瘤。
作為這樣的腫瘤抗原蛋白，T.Boon等於1991年首次鑑定了來自人黑素瘤細胞並命名為MAGE的蛋白(Science，2541643-1647，1991)，此後從黑素瘤細胞已經鑑定了數個另外的腫瘤抗原蛋白。
如T.Boon等的綜述(J.Exp.Med.,183725-729，1996)，迄今鑑定的腫瘤抗原蛋白可以分為以下四類。
屬於第一類的腫瘤抗原蛋白對於正常組織僅在睪丸組織中表達，而對於腫瘤組織它們表達於黑素瘤、頭頸部癌症、非小細胞肺癌、膀胱癌以及其它腫瘤。上述的MAGE和組成12個以上成員的家族的類似蛋白(J.Exp.Med.,178489-495，1993)以及BAGE(Immunity，2167-175，1995)和GAGE(J.Exp.Med.,182689-698，1995)屬於此類腫瘤抗原蛋白，所有這些腫瘤抗原蛋白均已經在黑素瘤細胞中鑑定。
雖然部分該類腫瘤抗原蛋白高表達於黑素瘤，但是其表達僅在10-30％的非黑素瘤的特定腫瘤患者中觀察到，因此它們不能廣泛用於各種腫瘤的治療或診斷。
屬於第二類的腫瘤抗原蛋白僅表達於正常組織中的黑素細胞和視網膜以及腫瘤組織中的黑素瘤。由於這些組織特異性蛋白高表達於黑素瘤，所以它們可以用作黑素瘤特異性腫瘤抗原蛋白。酪氨酸酶(J.Exp.Med.,178489-495，1993)、MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，913515，1994)、gp100(J.Exp.Med.,1791005-1009，1994)和gp75(J.Exp.Med.,181799-804，1995)屬於該類腫瘤抗原蛋白。編碼這些蛋白的基因均已經從黑素瘤細胞克隆。已經證實單獨分離的Melan-A(J.Exp.Med.,18035，1994)與MART-1相同。
然而，這類腫瘤抗原蛋白不能廣泛用於各種腫瘤的治療或診斷，因為它們不在非黑素瘤的腫瘤中表達。
屬於第三類的腫瘤抗原蛋白因為腫瘤特異性突變使其表達為CTL識別的腫瘤抗原肽。突變的CDK4(Science，2691281-1284，1995)、β-連環蛋白(J.Exp.Med.,1831185-1192，1996)和MUM-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,927976-7980，1995)屬於該類腫瘤抗原蛋白。在CDK4和β-連環蛋白中，單個胺基酸突變增加了該肽與MHCⅠ類抗原的結合親和力，這使其可以被T細胞識別。在MUM-1中，正常不被翻譯的內含子因為突變而被翻譯，所產生的肽被T細胞識別。然而因為這類突變發生的頻率低，所以它們不能廣泛用於各種腫瘤的治療或診斷。
屬於第四類的腫瘤抗原蛋白廣泛表達於正常組織而且也被CTL識別，其實例包括從黑素瘤細胞鑑定的P15(J.Immunol.1545944-5955，1995)。
如上所述，一些已知的腫瘤抗原蛋白僅在有限的諸如黑素瘤的腫瘤中表達，而其它腫瘤抗原蛋白即使在各種腫瘤中有表達，但也僅在特定腫瘤患者中的少部分人中表達，因此它們不能廣泛用於各種腫瘤的治療或診斷。所以，在把由細胞內降解產生的腫瘤抗原蛋白或腫瘤抗原肽用於治療或診斷各種腫瘤前，有必要鑑定可廣泛用於各種腫瘤的腫瘤抗原，例如發病率顯著高於黑素瘤的扁平細胞癌(例如食管癌、肺癌)。在這方面，本發明人已經對編碼得自食管癌的扁平細胞癌細胞的腫瘤抗原蛋白的基因進行了克隆，並首次成功克隆了編碼來自非黑素瘤的腫瘤細胞的腫瘤抗原蛋白(SART-1)的基因(國際公開WO 97/46676)。
關於腫瘤的診斷，目前利用抗腫瘤相關抗原的抗體正在製備各種方法，該類方法包括例如用放射免疫測定、ELISA等檢測血中的抗原物質；用免疫組織化學方法如酶聯免疫吸附測定或螢光抗體技術進行組織細胞診斷；或者進行腫瘤成像(Fishman,W.H.等，「Oncodevelopmental Markers」,Academic Press,1983)。然而，目前使用的主要腫瘤標記在良性疾病產生較高頻率的假陽性。所以，極其需要鑑定高度腫瘤特異性的腫瘤抗原蛋白以及分離抗所述腫瘤抗原蛋白的抗體以用於診斷。
而且，當特定腫瘤抗原蛋白或腫瘤抗原肽用作例如疫苗時，在將所述蛋白/肽用於病人前，需要診斷和選擇出表達腫瘤抗原蛋白和對用所述腫瘤抗原蛋白/肽治療可能有反應的病人。相信具有高度腫瘤特異性的腫瘤抗原蛋白或抗所述抗原的抗體在選擇這類易患病人中是非常有用的診斷劑。鑑於此，需要鑑定具有較高腫瘤特異性並可用於各種腫瘤病人的腫瘤抗原蛋白，以及鑑定產生的抗所述抗原蛋白的抗體。
為此，本發明人已經建立了一種衍生自食管癌的扁平細胞癌細胞系KE-4(此後稱為食管癌細胞系KE-4或簡稱為KE-4)，而且還建立了識別對在所述KE-4中表達的MHCI類抗原(HLA-A2601和HLA-A2402)限制性的腫瘤抗原肽的CTL(此後稱為KE-4CTL)(CancerRes.,554248-4253，1995)。
用由KE-4製備的cDNA文庫的重組質粒和含有HLA-A2601cDNA的重組質粒共轉染成纖維細胞系VA-13。然後用KE-4CTL處理轉化體並檢測所產生的IFN-γ量以篩選活化的KE-4-CTL。在重複進行所述篩選後，本發明人已經成功克隆了編碼新的腫瘤抗原蛋白的基因。克隆基因的核苷酸序列示於SEQ ID NO1。
然後，本發明人將編碼一種新的腫瘤抗原蛋白的基因插入表達一種具有GST的融合蛋白的質粒載體，用所得的載體轉化大腸桿菌細胞，製備GST和本發明新的腫瘤抗原蛋白之間的融合蛋白。利用通過用上述融合蛋白免疫家兔獲得的抗體，通過蛋白質印跡分析對各種細胞系和組織進行分析。結果，儘管在除了睪丸和胎兒肝臟以外的任何的所有正常組織、黑素瘤和白血病中未觀察到表達，但是在所檢查的100％頭頸部扁平細胞癌、60％食管扁平細胞癌、50％肺扁平細胞癌和50％肺腺癌中觀察到分子量約43千道爾頓(Kd)的新的本發明腫瘤抗原蛋白的表達。還證實腫瘤特異性CTL的確識別並破壞蛋白印跡分析陽性的癌細胞(表達本發明腫瘤抗原蛋白的癌細胞)。
如上所述，因為本發明腫瘤抗原蛋白在各種扁平細胞癌和腺癌中特異性而且高頻率地表達，所以，它可以用作活化患有這類癌症的患者的抗腫瘤免疫的藥物。此外，抗本發明腫瘤抗原蛋白的抗體應該有效地用於診斷癌症病人和選擇易患病人。
編碼約43kDa的本發明腫瘤抗原蛋白的DNA核苷酸序列相當於始於編碼腫瘤抗原蛋白SART-1的DNA的第1517位的核苷酸序列，所述DNA序列描述於國際公開WO 97/46676(在WO 97/46676中標示為SEQ ID NO2)。但是，相信本發明腫瘤抗原蛋白的體內(在腫瘤組織或腫瘤細胞中)表達獨立於SART-1，因為在上述蛋白印跡分析中，於各種腫瘤組織和腫瘤細胞中檢測到一種分子量約43kDa的蛋白，而且它顯示與推定分子量約125kDa的SART-1不一致的表達型。
根據這些發現確立了本發明。
因此，本發明涉及以下(a)或(b)的DNA(a)一種示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA；或(b)一種在嚴格條件下與示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA雜交並編碼具有腫瘤抗原活性的蛋白的DNA。
本發明還涉及含有所述DNA的表達質粒、通過表達所述DNA可獲得的腫瘤抗原蛋白、識別所述腫瘤抗原蛋白的抗體、以及它們的用途。
圖2顯示在採用抗本發明的新的腫瘤抗原蛋白(約43kD))和GST(約27kD)之間的融合蛋白(約70kD)的抗血清進行的蛋白質印跡中的電泳結果。在圖2A中，「因子Xa(-)」表示沒有用因子Xa處理本發明的腫瘤抗原蛋白和GST之間的融合蛋白，而「因子Xa(+)」表示通過用因子Xa處理對所述融合蛋白進行了切割。在圖2B中，PBMC表示健康人外周血單核細胞；KE-4和TE-9表示食管癌細胞系；E95-24、E96-18、E96-34、E96-26和E96-30表示食管癌組織；以及KL79、KL80、KL81、KL82、KL83和KL84表示肺癌組織。
一種「示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA」按照描述於此後的實施例中的方法可以克隆。另一方面，用示於SEQ ID NO1的全部或部分鹼基序列作雜交探針或PCR引物，對得自例如食管癌細胞系KE-4(FERM BP-5955)的cDNA文庫進行篩選，可以進行克隆。參考標準教科書如「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」，第二版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989，本領域技術人員可以容易地實施所述克隆。
而且，示於SEQ ID NO1的鹼基序列相當於編碼腫瘤抗原蛋白SART-1的DNA的第1517位及其以後的核苷酸序列，所述DNA序列描述於本發明人的PCT申請的國際公開WO97/46676(在WO97/46676中標示為SEQ ID NO2)。含有編碼所述SART-1的DNA的大腸桿菌JM 109(K3)已經保藏於國立生物科學和人體技術研究所(The National Institute of Bioscience and Human Technology,1-1-3Higashi,Tsukuba,Ibaraki，日本)(保藏號FERM BP-5951，保藏日期1997年5月22日)。因此，人們利用包含於所述保藏微生物中的質粒可以獲得示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA。
本文所用的「在嚴格條件下與示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA雜交的DNA」是指其鹼基序列類似於示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA序列並在嚴格條件下與其雜交的DNA。實例包括在示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA中含有一個或多個鹼基的取代、缺失和/或添加的DNA。
用示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA的一部分作探針或引物，按照描述於例如「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」，第二版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989中的方法，對各種cDNA文庫進行篩選可以獲得所述DNA。另一方面，通過定點誘變或描述於上述「Molecular Cloning」的PCR方法，也可以製備上述在示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA中含有一個或多個鹼基的取代、缺失和/或添加的DNA。
在這方面，術語「嚴格條件「是指例如在含有6×SSC(20×SSC意指333mM構緣酸鈉和333mM NaCl)、0.5％SDS和50％甲醯胺的溶液中於42℃進行雜交，然後在0.1×SSC和0.5％SDS的溶液中於68℃洗滌的該類條件，或者是指描述於Nakayama等，「Bio-Jikken-Illustrated」，第2卷，「Idenshi-Kaiseki-no-Kiso (Basis for GeneAnalysis)」，第148-151頁，Shujunsha,1995的那些條件。
本文所用的短語「具有腫瘤抗原活性」是指所述蛋白具有在細胞內被降解產生腫瘤抗原肽的特異性特徵，所述腫瘤抗原肽與MHCⅠ類抗原(HLA抗原)結合併被CTL識別。因此，「編碼具有腫瘤抗原活性的蛋白的DNA」是指當表達時可以提供細胞內降解產生的腫瘤抗原肽的DNA，所述肽與MHCⅠ類抗原(HLA抗原)結合併被CTL識別。因此，當這種DNA表達時，所產生的蛋白在細胞內降解得到能夠結合MHCⅠ類抗原的部分肽。所產生的部分肽片段與MHCⅠ類抗原形成複合物並提呈於細胞表面，所述複合物然後被特異性CTL結合，產生細胞毒性效應並誘導細胞因子。編碼產生這種肽片段的蛋白的DNA是本發明的「編碼具有腫瘤抗原活性的蛋白的DNA」。
例如通過以下方法可以確定候選DNA是否可能是「編碼具有腫瘤抗原活性的蛋白的DNA」。
首先，將一種含有候選DNA的表達質粒和另一種含有編碼MHCⅠ類抗原的DNA的表達質粒雙重轉染入不表達腫瘤抗原蛋白的細胞內，例如得自非洲綠猴腎臟的COS-7(ATCC CRL 1651)或成纖維細胞VA-13(RIKEN CELL BANK,The Institute of Physical and ChemicalResearch)。例如通過採用脂質轉染胺試劑(GIBCO BRL)的脂質轉染法可以實現所述轉染。接著將限於所用的特定MHCⅠ類抗原的腫瘤效應性CTL加入到用於反應的轉染試劑中，用例如ELISA檢測所述CTL在應答中產生的各種細胞因子(例如IFN-γ)量，以確定所述候選DNA是否是編碼具有腫瘤抗原活性的蛋白的DNA。例如按照已知的方法(Nakao等，Cancer Res.,554248-4252(1995))，可以製備含有編碼特定MHCⅠ類抗原的DNA的表達質粒。
通過採用本發明的DNA，按照重組DNA技術能夠大量產生腫瘤抗原蛋白。按照許多出版物和文獻例如上述的「Molecular Cloning」的描述可以實現通過表達本發明DNA產生腫瘤抗原蛋白。在任選將調節基因如控制轉錄的啟動子(例如trp、lac、T7或SV40早期啟動子)與所述DNA上遊連接後，將需要表達的DNA插入合適的載體(例如pSV-SPORT1)中，從而能夠構建在宿主細胞中複製和表達的表達質粒。然後將所述表達質粒引入合適的宿主細胞中以獲得轉化體。宿主細胞的實例包括原核細胞如大腸桿菌，單細胞真核生物如酵母和得自多細胞真核生物如昆蟲或動物的細胞。用已知的方法如磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖法或電脈衝法能夠實現用表達質粒轉化宿主細胞。當用常規方法在適合所述轉化體的培養基中培養時，所獲得的轉化體產生所需要的蛋白。按照標準生化方法可以分離和純化由此獲得的腫瘤抗原蛋白。
此外，可以將編碼本發明腫瘤抗原蛋白的DNA插入一種表達融合蛋白的質粒載體中，所述融合蛋白具有例如GST(穀胱甘肽S-轉移酶)(例如，pGEX-5X-3，Pharmacia Biotech)，從而也可以使用所產生的表達載體。例如，當用這樣一種表達載體轉化一種宿主如大腸桿菌菌株DH5α時，所產生的轉化體能夠產生本發明腫瘤抗原蛋白和GST之間的融合蛋白。利用例如穀胱甘肽瓊脂糖凝膠(GlutathioneSepharose)能夠容易地純化所述融合蛋白。儘管所述純化的融合蛋白可能具有上述腫瘤抗原活性，但是仍然需要用酶因子X等分離出GST部分，以獲得非融合的腫瘤抗原蛋白。
所述表達產物是一種本發明DNA編碼的蛋白，並因其表達而產生。因此，該蛋白作為腫瘤抗原蛋白具有在細胞內降解產生與MHCⅠ類抗原結合併被CTL識別的腫瘤抗原肽的特徵。
此外，本發明提供含有由示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA，或者在嚴格條件下與示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA雜交的DNA的表達質粒，而且所述表達質粒編碼一種具有腫瘤抗原活性的蛋白。
另外，本發明提供已經用所述表達質粒轉化的轉化體。
此外，本發明提供具有腫瘤抗原活性、可以通過表達本發明上述DNA產生的蛋白。
一種該蛋白的具體實例是通過表達示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA可獲得的一種蛋白。在還原條件下的SDS-PAGE中，該蛋白在分子量約43kD處顯示一條帶。
在一個實施方案中，本發明腫瘤抗原蛋白包括示於SEQ ID NO2的胺基酸序列。示於SEQ ID NO2的胺基酸序列由示於SEQ ID NO1的鹼基序列從第590位至第922位的區段編碼，並至少含有其HLA-A26-和HLA-A24-限制性腫瘤抗原肽部分。
如上所述，示於SEQ ID NO1的鹼基序列相當於編碼腫瘤抗原蛋白SART-1的DNA的第1517位及該位以後的序列，所述DNA序列由本發明人公開並描述於國際公開WO 97/46676(在國際公開WO97/46676中標示為SEQ ID NO2)。同樣，示於SEQ ID NO2的胺基酸序列相當於所述SART-1(在國際公開WO 97/46676中標示為SEQID NO1)胺基酸序列的第690位以及該位以後的序列，本發明人已經證明各種腫瘤抗原肽部分存在於第690位及其該位以後的該部分序列中(參見國際公開WO 97/46676)。
本發明的上述腫瘤抗原蛋白及其基因(DNA)可體內及體外用於各種目的，包括治療、預防和診斷腫瘤，如下所詳述。具體來說，本發明DNA及其表達產物即腫瘤抗原蛋白可以廣泛用作常見癌症如扁平細胞癌的抗腫瘤藥物或診斷試劑。就此而論，扁平細胞癌是一種最常見的人類癌症，尤其是已知食管癌或肺癌中的扁平細胞癌對現有的化學治療或放射治療抗性較高。
因此，本發明提供包含作為活性成分的本發明的DNA或腫瘤抗原蛋白的藥物。
包括作為活性成分的本發明腫瘤抗原蛋白的藥物可以與佐劑一起給予或者以顆粒劑型給予，以有效建立細胞免疫。當所述腫瘤抗原蛋白給予到活體時，腫瘤抗原肽以高密度提呈於抗原提呈細胞的MHCⅠ類抗原上，這使得腫瘤特異性CTL有效增殖而實現治療或防止腫瘤。為了此目的，可應用描述於文獻(Clin.Microbiol.Rev.,7277-289，1994)中的佐劑。另外，還設計了使外源性抗原肽有效地在MHCⅠ類抗原提呈的劑型，如脂質體製劑、其中所述腫瘤抗原蛋白或肽結合到直徑數μm的珠粒上的顆粒劑或其中所述蛋白或肽結合到脂質上的製劑。例如通過皮內、皮下或靜脈注射可以實現給予。此外，設計了其中給予抗原提呈細胞如提呈所述腫瘤抗原肽的樹突細胞或巨噬細胞、或者給予已經引入編碼所述腫瘤抗原蛋白的DNA的細胞的方法。儘管本發明腫瘤抗原蛋白在用於給予的製劑中的量可以根據例如需要治療的疾病、特定患者的年齡和體重調適，但是，通常劑量為0.0001mg-1000mg、優選0.001mg-1000mg，並優選以每隔數天至數月給予。
通過將含有作為活性成分的編碼本發明腫瘤抗原蛋白的DNA的藥物給予到患有腫瘤的患者，可以治療或防止腫瘤。當給予本發明的DNA時，所述腫瘤抗原蛋白在所述細胞中表達程度相當高，而且所產生的腫瘤抗原肽結合到MHCⅠ類抗原並以高密度提呈於細胞表面上。這將引起體內的腫瘤特異性CTL有效增殖，由此實現治療或防止腫瘤。給予以及為這些目的將DNA引入細胞的方法是本領域已知的。方法實例包括一種應用病毒載體的方法和描述於文獻(Nikkei-Science，1994年4月，第20-45頁；Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994)；Jikken-Igaku-Zokan，12(15)，1994，以及其中引用的參考文獻)的方法，這些方法的任何方法均可以用於本發明中。
使用病毒載體的方法的實例包括這些方法，其中將本發明的DNA引入DNA病毒或RNA病毒如反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質炎病毒或新培斯病毒中，然後引入細胞中。其中特別優選採用反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒或痘苗病毒的方法。
還有其中將表達質粒直接肌內注射的另一種方法(DNA接種)、脂質體方法、脂質轉染法、顯微注射法、磷酸鈣法和電穿孔法。其中特別優選DNA接種和脂質體法。
為了使本發明的DNA用作實際應用的藥物，人們可以採用以下兩種方法中的一種方法體內法，其中DNA直接引入人體；或體外法，其中從人體取出某些種類的細胞，在體外將DNA引入所述細胞後再引入體內(Nikkei-Science，1994年4月，第20-45頁；Gekkan-Yakuji,36(1)，23-48(1994)；Jikken-Igaku-Zokan，12(15)，1994，以及其中引用的參考文獻)。儘管本發明的DNA可以通過任一方法給予，但是更優選體內法。
在體內法的情況下，DNA可以根據要治療的疾病和症狀以及其它因素通過任何合適的途徑給予。例如它可以通過靜脈、動脈、皮下、皮內或肌內途徑給予。在體內法的情況下，這類藥物可以以各種劑型如溶液給予，它們通常配製為含有作為活性成分的本發明DNA的注射劑，該注射劑需要時還可以包含常規載體。當將本發明DNA包含於脂質體或膜融合的脂質體(如仙臺病毒(HVJ)-脂質體)時，這類藥物可以為懸浮液、凍幹藥物、離心濃縮的凍幹藥物等形式。
儘管在這類製劑中的本發明的DNA量隨例如要治療的疾病、具體病人的年齡和體重而不同，但是通常每隔數天至數月給予本發明的DNA量優選為0.0001-100mg、更優選0.001-10mg。
除了上述藥物外，如上所述的本發明的DNA和蛋白也可以用作本領域研究試劑。而且，上述的本發明蛋白可以用作腫瘤診斷劑的活性成分。準確地說，需要時可以對本發明腫瘤抗原蛋白進行標記，並用於檢測在從懷疑患有腫瘤的病人獲得的樣品(如血液、腫瘤組織)中存在的抗體(抗所述腫瘤抗原蛋白的抗體)，以便診斷是否存在腫瘤。另外，本發明的蛋白還可以用作產生下述本發明抗體的免疫原。
本文所用的術語「抗體」是指抗本發明腫瘤抗原蛋白或包含其部分的部分蛋白的抗體。例如按照描述於「抗體實驗室手冊」(Lane,H.D.等編輯，冷泉港實驗室出版社，紐約，1989)中的方法，容易製備這類抗體。準確地說，採用本發明腫瘤抗原蛋白或含其部分的部分蛋白作免疫原以常規方式免疫動物，可以容易地製備本發明的抗體。這種免疫原的實例有本發明腫瘤抗原蛋白、含有本發明腫瘤抗原蛋白的部分的部分蛋白(包括一個肽片段)、本發明腫瘤抗原蛋白或包括其部分的部分蛋白和GST(穀胱苷肽S-轉移酶)之間的融合蛋白和本發明腫瘤抗原蛋白或含其部分的部分蛋白和Myc tag之間的融合蛋白。在這方面，根據能夠組成一個表位的最小長度，部分蛋白的長度通常是至少8個胺基酸。
另外，按照已知的方法可以製備對本發明腫瘤抗原蛋白特異性的單克隆抗體。已經將最初由Kohler和Milstein(Eur.J.Immunol.6，511(1976))描述的雜交瘤技術用於生產抗許多特異性抗原的單克隆抗體，並且本領域技術人員可以按照描述於文獻如「Bunshi-Seibutu-Gaku-Kennkyu-No-Tame-No-Tanpakushitu-Jikkenn-Ho」(第4章，Yodosha,1994)中的方法實施。
免疫宿主動物或培養得自所述宿主動物的抗體產生細胞的方法和程序與常規建立抗原刺激和產生技術一致。
可以用包括免疫新和層析、HPLC(高效液相層析)等已知的技術純化所獲得的抗體。
根據由此獲得的抗體，製備各種抗體片段也是可能的。這類抗體片段包括例如通過胃蛋白酶消化抗體可以產生的F(ab』)2片段、通過還原F(ab』)2片段中的二硫鍵可以產生的Fab』片段和通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體可以產生的2Fab或Fab片段，而且這類片段也在本發明範圍內。
而且，根據這類抗體或抗體片段，製備各種衍生物也是可能的。本文所用「衍生物」包括例如嵌合抗體和人源化抗體，而且例如按照描述於日本專利公開(Kokai)61-47500(1986)或Nature 321，522(1986)中的方法可以製備這類抗體。另外，用例如酶標記的上述抗體或抗體片段也包括在所述衍生物範圍內。酶標記方法的具體實例包括戊二醛法、過碘酸鹽法、馬來醯亞胺法和吡啶基-二硫化物法。用作標記物的酶的實例包括牛小腸鹼性磷酸酶和辣根過氧化物酶。本領域技術人員根據標準參考文獻如「Koso-Menneki-Sokutei-Ho」(Igaku-Shoin,1978)可以容易地製備這些標記抗體。此外，放射性同位素也可以用作標記物。
如上所述的抗體、抗體片段或其衍生物(此後總稱為「抗體等」)可以用作如下所述的腫瘤的診斷劑。
如在以下實施例4中所證實，用本發明的抗體對各種細胞系和組織進行蛋白印跡分析表明，儘管在除了睪丸和胎兒肝臟以外的任何的所有正常組織、黑素瘤和白血病中未觀察到表達，但是在所檢查的100％頭頸部扁平細胞癌、60％食管扁平細胞癌、50％肺扁平細胞癌和50％肺腺癌中觀察到本發明的新腫瘤抗原蛋白的表達。此外，還證實腫瘤特異性CTL的確識別並破壞在上述蛋白印跡分析陽性的癌細胞(表達本發明腫瘤抗原蛋白的癌細胞)。
因此證實本發明腫瘤抗原蛋白在各種扁平細胞癌和腺癌中特異性而且高頻率地表達，而在除了睪丸和胎兒肝臟以外的正常組織、黑素瘤和白血病中未檢測到表達。因此，相信抗本發明腫瘤抗原蛋白的抗體等能夠廣泛用於診斷這類癌症病人。此外，通過用這些抗體等檢測本發明腫瘤抗原蛋白，使得診斷早期腫瘤的發生、復發和轉移以及有效選擇適用含有本發明腫瘤抗原蛋白或肽、或編碼它們的DNA的藥物的腫瘤患者成為可能。因此，希望它們對治療和預防腫瘤非常有用。
因此，本發明提供抗本發明腫瘤抗原蛋白或抗包含其部分的部分蛋白、抗體片段、或其衍生物的抗體。
本發明也提供用於治療或診斷腫瘤、包含作為活性成分的這類抗體、抗體片段或衍生物中的任何一種的組合物。
本發明還提供用本發明的抗體或抗體片段或其衍生物診斷腫瘤的方法。
可以將本發明抗體等用作腫瘤診斷劑在合適緩中液如含有牛血清白蛋白的磷酸緩中液(pH7.0)中的活性成分。採用本發明診斷劑的免疫診斷的實例包括其中檢測腫瘤組織樣品中的腫瘤抗原蛋白或其中檢測血液或組織中存在的腫瘤抗原蛋白的診斷。更具體的實例包括免疫組織化學法、免疫印跡法、放射免疫測定(RIA)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)和螢光或發光測定、以及描述於以下實施例4中的蛋白質印跡分析。在標準參考文獻如「Koso-Menneki-Sokutei-Ho」(Igaku-Shoin，1978)中給出了這些測定的細節。
根據所述測定，可以採用包括酶標記抗體、染料、助色劑、阻化劑、標準品等的試劑盒形式的本發明診斷劑。
用其中可以將本發明腫瘤抗原蛋白特異性的單克隆抗體本身或作為與一種抗腫瘤藥物或毒素的綴合物給予到癌症患者以殺傷表達所述腫瘤抗原蛋白的腫瘤細胞的方法，能夠實施採用本發明的抗體等的治療。
此外，本發明的抗體等也可以用於親和層析或篩選cDNA文庫。
提供以下實施例以進一步說明本發明，而不能解釋為限制本發明的範圍。參考實施例1 建立針對食管癌細胞系的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)細胞系按照Nakao等(Cancer Res.,554248-4252(1995))公開的方法，從一個患者的外周血單核細胞建立針對根據組織類型分類屬於扁平細胞癌的食管癌細胞系KE-4的CTL，命名為KE-4CTL，並用於實驗。食管癌細胞系KE-4和KE-4CTL都已經分別以國際保藏號FERMBP-5955和FERM BP-5954於1997年5月23日保藏於國立生物科學和人體技術研究所(The National Institute of Biosclence and HumanTechnology,1-1-3 Higashi,Tsukuba,Ibaraki，日本)。此外，按照Nakao等的上述公開的方法對KE-4的HLAⅠ分子進行分類，證實它們是HLA-A2402、-A2601、B54、-B60、-Cwl和-Cw3。參考實施例2 HLA-A2601 cDNA的製備採用上述KE-4按照Nakao等(Cancer Res.,554248-4252(1995))公開的方法，將HLA-A2601 cDNA導入表達載體pCR3(INVITROGEN)從而製備重組質粒。參者實施例3 衍生自KE-4的cDNA文庫的製備通過分離總RNA部分並按照生產商的方案用mRNA純化系統(Pharmacia Biotech生產)在寡聚(dT)柱上進行純化，由KE-4製備Poly(A)+mRNA。採用SuperScriptTM質粒系統(Gibco BRL)按照生產商的方案，由mRNA製備具有連接到每個末端的NotⅠ接頭和ScaⅠ接頭的cDNA，然後將其連接至用限制酶NotⅠ和SalⅠ消化的表達載體即質粒pSV-SPORTl(Gibco BRL)，以產生重組質粒。在25μF和2.5kV的條件下，採用基因脈衝儀(Bio-Rad)電脈衝將所述重組質粒導入大腸桿菌ElectroMAX DH10B/p3TM細胞(Gibco BRL)中。在含氨苄青黴素(50μg/ml)的LB培養基(1％細菌用胰蛋白腖，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl，pH7.3)上選擇所述重組質粒已經導入的轉化體。參考實施例4 幹擾素-γ的定量測定用酶免疫測定(ELISA)進行幹擾素-γ(IFN-γ)的定量測定。將抗人IFN-γ的小鼠單克隆抗體吸附在96-孔微量培養板的孔中作為固相抗體，在用牛血清白蛋白封閉非特異性結合後，使其與樣品中的IFN-γ結合。然後使其與作為檢測抗體的抗人IFN-γ的兔多克隆抗體結合，在與用鹼性磷酸酶標記的抗兔免疫球蛋白的羊抗體結合後，與作為顯色底物的對-硝基苯基磷酸鹽反應。在加入等體積的1N NaOH猝滅反應後，於405nm檢測吸光度。所測得的吸光度與用標準IFN-γ獲得的吸光度進行比較，以確定所述上清液中的IFN-γ量。實施例1 新的腫瘤抗原蛋白基因的篩選從述於參考實施例3中的約100個轉化體的庫中如下回收重組質粒DNA。將100個轉化體加入並在含有LB培養基加氨苄青黴素(50μg/ml)的96孔U型底微量培養板的每個孔中培養。然後將部分培養物轉移到另一個每孔含有0.25ml TYGPN培養基的96孔U型底微量培養板中(F.M.Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley Sons,Inc.)，於37℃培養48小時。將所述微量培養板LB培養基中的餘下培養物冷凍保藏。在所述微量培養板中用鹼裂解法實現從培養於TYGPN培養基中的轉化體製備重組質粒DNA(F.M.Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley Sons,Inc.)。將經異丙醇沉澱回收的重組質粒DNA懸浮於含有20ng/ml RNA酶的50μl的10mM Tris,1mM EDTA,pH7.4中。
採用如下的脂質轉染法，用KE-4 cDNA的重組質粒和HLA-A2601 cDNA的重組質粒雙重轉染成纖維細胞系VA-13細胞(RIKENCELL BANK,The Institute of Physical and Chemical Research;Ann.Med.Exp.Biol.Fenn.,44242-254，1966)。將7000個VA-13細胞置入96孔平底微量培養板的每個孔中，並在含有10％FCS的100μl RPMI1640培養基中培養2天。採用脂質轉染試劑(Gibco BRL)，從70μl混合物中取30μl加入到待雙重轉染的VA-13細胞中，所述70μl混合物組成為25μl對應於約100個轉化體的KE-4 cDNA重組質粒、10μl(200ng)參考實施例2中所述HLA-A2601 cDNA重組質粒和35μl約35倍稀釋的脂質轉染試劑。復份製備轉染體。5小時後，將200μl含有10％FCS的培養基加入到所述轉染體中，再於37℃培養72小時。去除所述培養基後，每孔加入10，000個KE-4CTL細胞，在100μl含有10％FCS和25U/ml IL-2的培養基中於37℃培養24小時。回收所述培養基，用ELISA檢測其IFN-γ量。
關於其中觀察到高產量IFN-γ的四個組，將相應的約100個含有KE-4 cDNA重組質粒的轉化體的冷凍保藏庫用於以下篩選。將所述轉化體庫平板接種於含有氨苄青黴素(50μg/ml)的LB瓊脂培養基上以獲得菌落。如上所述，培養每組的200個菌落(總共800個菌落)使得每個孔中包含單一種類的轉化體，由此製備KE-4 cDNA的重組質粒DNA。然後，用KE-4 cDNA的重組質粒和HLA-A2601 cDNA的重組質粒雙重轉染VA-13細胞，然後與KE-4CTL共培養，如上所述定量檢測因KE-4CTL反應產生的IFN-γ，以便選擇陽性質粒。這樣，選擇了KE-4 cDNA重組質粒克隆。此外，用所述質粒克隆重複相似的方法以按照參考實施例4的方法確定KE-4CTL產生的IFN-γ量。結果示於

圖1。為了進行比較，採用不同類型的HLA(HLA-A0201)進行相似的實驗。在該圖中，■和□表示分另用HLA-A2601 cDNA和HLA-A0201 cDNA獲得的結果。水平軸表示上述質粒克隆的量(ng/孔)，而垂直軸表示KE4-CTL產生的IFN-γ量(pg/ml)。圖1說明用該質粒克隆轉染VA-13細胞誘導KE-4CTL產生IFN-γ，即所述質粒克隆代表編碼腫瘤抗原蛋白的基因。實施例2 新的腫瘤抗原蛋白基因的鹼基序列的測定將含有實施例1中選擇的重組質粒、所述腫瘤抗原蛋白基因的cDNA已經導入的轉化體在500ml含有氨苄青黴素(50μg/ml)的LB培養基中於37℃培養14-16小時，離心收集細菌細胞。用PLASMIDMAXⅪ試劑盒(QIAGEN)從所述細胞回收重組質粒。該cDNA已經導入定位於SP6 RNA聚合酶啟動子序列和T7 RNA聚合酶啟動子序列之間的部位。然後合成描述於文獻(DNA 4165，1985)的SP6啟動子引物和T7啟動子引物。用SP6啟動予引物或T7啟動子引物聯合Fluore-dATP標記混合物(Pharmacia Biotech)和AutoRead測序試劑盒(Pharmacia Biotech)進行雙脫氧測序反應，採用螢光DNA測序儀(Pharmacia Biotech)從兩端測定cDNA的鹼基序列。由此測定的鹼基序列(1011bp)示於SEQ ID NO1。示於SEQ ID NO1的鹼基序列相當於編碼腫瘤抗原蛋白SART-1的DNA的第1517位及其以後的序列，所述DNA序列描述於國際公開WO 97/46676(在WO 97/46676中標示為SEQ ID NO2)。實施例3 抗新的腫瘤抗原蛋白的抗體的產生採用兩種引物sf-15』-TGGGAATTCGATGAGGATCCCGAGC-3’sr-15』-TACGGGCGGCCGCTGTCACTTGGT-3』利用PCR擴增重組質粒，該重組質粒中已經導入在實施例2中獲得的新的腫瘤抗原蛋白基因的cDNA。
所擴增的片段具有相應於示於SEQ ID NO1的鹼基序列的第146-930位的部分序列。
用限制酶EcoRⅠ和NotⅠ切割所擴增的片段，並將其連接入表達具有穀胱甘肽S-轉移酶的融合蛋白的質粒載體pGEX-5X-3(PharmaciaBiotech)，獲得重組質粒。將該重組質粒導入大腸桿菌菌株DH5α，並選擇轉化體。大量培養轉化體，並在蛋白酶抑制劑PMSF和抑酶肽存在下聲處理破壞細菌細胞，以便提取本發明腫瘤抗原蛋白和GST之間的融合蛋白。然後採用穀胱甘肽Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)的親和純化和採用Superrose 12(Pharmacia Biotech)的凝膠過濾分離融合蛋白。所分離的融合蛋白用作抗原以常規方式免疫家兔以產生抗血清。實施例4 蛋白質印跡分析採用在實施例3中獲得的抗血清，通過蛋白印跡研究本發明腫瘤抗原蛋白在各種細胞系和組織中的表達。
在含有0.03TIU/ml抑酶肽的10mM Tris-HCl、pH7.4、150mMNaCl和0.5％Triton X-100中聲處理裂解各種細胞系和組織的每一種。將裂解物於14，000rpm離心20分鐘，上清液進行SDS-PAGE。將由此分離的蛋白轉移到Hybond-PVDF膜(Amersham)上，並與適量實施例3中獲得的抗血清於室溫下溫育4小時。蛋白質印跡法的其它細節與描述於Shichijo等，Journal of Immunological Methods，186∶137(1995)中的方法一致。
結果示於圖2。在實施例3中獲得的抗血清識別用於免疫的70kDa的融合蛋白。抗血清還識別用酶因子X切割融合蛋白產生的43kDa腫瘤抗原蛋白和27kDa GST(圖2A)。關於腫瘤抗原蛋白在各種細胞和組織中表達的研究表明，在所研究的5個健康人外周血單核細胞(PBMC)、16個白血病細胞系和2個黑素瘤細胞系中的任何一個的細胞中均未檢測到表達，但是在所檢查的5個頭頸部扁平細胞癌細胞系中的3個、6個食管扁平細胞癌細胞系中的4個、所有3個肺扁平細胞癌細胞系和6個肺腺癌細胞系中的3個的細胞中觀測到表達。在正常組織中，在全部所研究的1個胎兒肝臟、3個睪丸組織中觀察到表達，但是在全部所檢查的1個新生兒肝臟、1個成人肝臟、2個子宮、4個食管和1個胰腺組織中均未檢測到表達。在癌組織中，在10個白血病和10個黑素瘤中的任何一個癌組織中均未檢測到表達，但是在7個頭頸部扁平細胞癌的7個、30個食管扁平細胞癌中的18個、17個肺扁平細胞癌中的8個和35個肺腺癌中的16個的癌組織中觀察到表達。部分實例的結果示於圖2(B)。正如以上所述，證實本發明的新的腫瘤抗原蛋白在各種扁平細胞癌和腺癌中特異性而且高頻率地表達，所以，相信抗本發明的新的腫瘤抗原蛋白的抗體可用於診斷這類癌症細胞和癌症患者。實施例5腫瘤抗原蛋白在各種癌細胞中的表達和CTL的細胞毒性活性的檢測用EcoRⅠ和NotⅠ處理含有描述於WO 97/46676的SEQ ID NO2的鹼基序列的重組質粒(K3)(FERM BP-5951)以獲得DNA片段，將該片段插入表達具有穀胱甘肽S-轉移酶(GST)的融合蛋白的質粒載體pGEX-4T-2(Pharmacia Biotech)的EcoRⅠ和NotⅠ位點，獲得重組質粒。用所述質粒以與描述於實施例3的相似的方式製備具有GST的融合蛋白和抗所述蛋白的抗血清。所得到的抗血清識別描述於WO97/46676的分子量約125kDa的腫瘤抗原蛋白。採用抗約125kDa蛋白的所述抗血清和抗在實施例3中獲得的約43kDa蛋白以及針對本發明腫瘤抗原蛋白的抗血清進行蛋白質印跡分析，以便按照實施例4所述的方法檢測在各種HLA-A24-陽性的癌細胞系中的表達。另一方面，按照述於D.D.Kharkevitch等，Int.J.Cancer，58317(1994)的方法，其中將2×105KE-4CTL與用51Cr標記的104靶癌細胞反應，從而檢測KE-4CTL對各種癌細胞的細胞毒性活性(特異性裂解)。結果示於下表1。表1表達的蛋白特異性裂解細胞系 來源 43kD 125kD (％)KE-4 食管癌 + +27KE-3 食管癌 + +32TE-8 食管癌 + +23TE-11 食管癌 + +31PC9 肺癌 + +3911-18 肺癌 + +27SKG-1 子宮癌 + +25TE-10 食管癌 - +38LU65A 肺癌 - +6PERF-LC-AI肺癌 - +3LK79 肺癌 - +3* +表示在蛋白印跡上可以觀察到相應的帶，而-表示觀察不到相應的帶。
如表1所示，在所檢查的所有癌細胞中都觀察到125kDa蛋白的表達。在這些細胞系中，KE-4CTL表現出對表達43kDa蛋白的細胞系的細胞毒性效應。然而，除了TE-10外KE-4CTL對不表達43kDa蛋白的癌細胞系未表現出毒性效應。這些結果表明衍生自43kDa蛋白的抗原肽趨向於作為抗原提呈，並較衍生自125kDa蛋白的抗原肽更有效地被CTL識別。總之，抗43kDa蛋白的抗體在診斷可以用本發明腫瘤抗原蛋白、及其腫瘤抗原肽或編碼所述腫瘤抗原蛋白的DNA有效治療的癌症患者中更有用得多。工業適用性在各種扁平細胞癌或腺癌中高頻率表達的本發明的新的腫瘤抗原蛋白、編碼它們的基因以及抗所述新的腫瘤抗原蛋白的抗體可用於預防、治療或診斷各種腫瘤。
序列表#60110#62ITOH,Kyogo#60120#62腫瘤抗原蛋白、其編碼基因及其用途#60130#62661093#60160#624#60210#621#60211#621011#60212#62DNA#60213#62Homo sapiens#60400#621cgaggcggag ctggagctgc agaagcagct ggagaaggga cgccggctgc gacagttaca60gcagctacag cagctgcgag acagtggcga gaaggtggtg gagattgtga agaagctgga120gtctcgccag cggggctggg aggaggatga ggatcccgag cggaaggggg ccatcgtgtt180caacgccacg tccgagttct gccgcacctt gggggagatc cccacctacg ggctggctgg240caatcgcgag gagcaggagg agctcatgga ctttgaacgg gatgaggagc gctcagccaa300cggtggctcc gaatctgacg gggaggagaa catcggctgg agcacggtga acctggacga360ggagaagcag cagcaggatt tctctgcttc ctccaccacc atcctggacg aggaaccgat420cgtgaatagg gggctggcag ctgccctgct cctgtgtcag aacaaagggc tgctggagac480cacagtgcag aaggtggccc gggtgaaggc ccccaacaag tcgctgccct cagccgtgta540ctgcatcgag gataagatgg ccatcgatga caagtacagc cggagggagg aataccgagg600cttcacacag gacttcaagg agaaggacgg ctacaaaccc gacgttaaga tcgaatacgt660ggatgagacg ggccggaaac tcacacccaa ggaggctttc cggcagctgt cgcaccgctt720ccatggcaag ggctcaggca agatgaagac agagcggcgg atgaagaagc tggacgagga 780ggcgctcctg aagaagatga gctccagcga cacgcccctg ggcaccgtgg ccctgctcca 840ggagaagcag aaggctcaga agacccccta catcgtgctc agcggcagcg gcaagagcat 900gaacgcgaac accatcacca agtgacagcg ccctcccgta gtcggccctg cctcaacctt 960catattaaat aaagctccct ccttattttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a1011#60210#622#60211#62111#60212#62PRT#60213#62Homo sapiens#60400#622Glu Tyr Arg Gly Phe Thr Gln Asp Phe Lys Glu Lys Asp Gly Tyr Lys5 10 15Pro Asp Val Lys Ile Glu Tyr Val Asp Glu Thr Gly Arg Lys Leu Thr20 25 30Pro Lys Glu Ala Phe Arg Gln Leu Ser His Arg Phe His Gly Lys Gly35 40 45Ser Gly Lys Met Lys Thr Glu Arg Arg Met Lys Lys Leu Asp Glu Glu50 55 60Ala Leu Leu Lys Lys Met Ser Ser Ser Asp Thr Pro Leu Gly Thr Val65 70 75 80Ala Leu Leu Gln Glu Lys Gln Lys Ala Gln Lys Thr Pro Tyr Ile Val85 90 95Leu Ser Gly Ser Gly Lys Ser Met Asn Ala Asn Thr Ile Thr Lys100 105 110#60210#623#60211#6225#60212#62DNA#60213#62人工序列#60400#623tgggaattcg atgaggatcc cgagc 25#60210#624#60211#6224#60212#62DNA#60213#62人工序列#60400#624tacgggcggc cgctgtcact tggt 2權利要求
1．以下(a)或(b)的一種DNA(a)一種示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA；或(b)一種在嚴格條件下與示於SEQ ID NO1的鹼基序列組成的DNA雜交並編碼具有腫瘤抗原活性的蛋白的DNA。
2．含有權利要求1的DNA的表達質粒。
3．用權利要求2的表達質粒轉化的轉化體。
4．通過表達權利要求1的DNA產生的腫瘤抗原蛋白。
5．權利要求4的腫瘤抗原蛋白，它在還原條件下的SDS-PAGE分子量測定中顯示約43kDa的一條帶。
6．包括示於SEQ ID NO2的胺基酸序列的權利要求4或5的腫瘤抗原蛋白。
7．含有作為活性成分的權利要求1的DNA或權利要求4-6中任一項的蛋白的藥物。
8．含有作為活性成分的權利要求1的DNA或權利要求4-6中任一項的蛋白的腫瘤診斷劑。
9．抗權利要求4-6中任一項的腫瘤抗原蛋白或其部分組成的部分蛋白的抗體、抗體片段或其衍生物。
10．含有作為活性成分的權利要求9的抗體、抗體片段或其衍生物的腫瘤診斷劑。
11．診斷腫瘤的方法，其特徵在於它使用抗權利要求4-6中任一項的腫瘤抗原蛋白或其部分組成的部分蛋白的抗體、抗體片段、或其衍生物。
12．將具有腫瘤抗原活性的表達產物、或能夠識別具有腫瘤抗原活性的蛋白的片段或其衍生物用作抗原可以產生的抗體，其中通過用含有權利要求1的DNA的表達質粒轉化宿主細胞，並在適合所述DNA表達的條件下培養所獲得的轉化體，從而獲得所述表達產物。
全文摘要
包含SEQ ID NO:1所示的鹼基序列的DNA或在嚴格條件下與包含SEQ ID NO:1所示的鹼基序列的DNA雜交並編碼具有腫瘤抗原活性的蛋白的DNA;攜帶上述DNA的表達質粒;用所述表達質粒轉化的轉化體;上述DNA表達產生的腫瘤抗原蛋白;抗上述蛋白的抗體;及它們在治療、防止或診斷腫瘤中的用途。
文檔編號A61K48/00GK1284996SQ98813746
公開日2001年2月21日 申請日期1998年12月22日 優先權日1997年12月25日
發明者伊東恭悟, 七條茂樹, 今井康久 申請人:伊東恭悟