抑制補體激活的修飾的蛋白酶的製作方法

2023-05-23 19:16:36 2

專利名稱：抑制補體激活的修飾的蛋白酶的製作方法
技術領域：
本發明提供了調節補體系統的方法及化合物。本發明特別提供了抑制補體激活的化合物及促進補體激活的化合物。所述化合物由於其對於補體系統的作用而是治療劑。 因此，抑制補體激活的化合物可用於治療缺血性和再灌注疾病，包括心肌梗塞和中風、膿毒症、自身免疫疾病、炎症疾病及具有炎症成分的疾病，包括阿爾茨海默病及其它神經變性疾病。背景補體(C)系統是免疫系統的一部分，在消除侵入的病原體和引發炎症應答中起作用。人及其它哺乳動物的補體系統包括30種以上的可溶和膜結合的蛋白質，參與一系列順序反應，導致補體激活。血液補體系統具有與廣譜宿主防禦機制相關的眾多功能，包括抗微生物和抗病毒作用。衍生自C成分激活的產物包括非自身識別分子C3b、C4b和C5b，以及影響多種細胞免疫應答的過敏毒素C3a、C4a和C5a。這些過敏毒素也發揮促炎劑作用。補體系統由一系列酶和非酶蛋白質及受體組成。補體激活是通過已知的「經典」途徑、「旁路」途徑和「凝集素」途徑的三種主要模式之一而發生的(見

圖1)。這些途徑可以通過引發補體激活的過程而區分。經典途徑是通過抗體-抗原複合物或者聚集形式的免疫球蛋白而引發的；旁路途徑是通過微生物和細胞表面上的結構識別而引發的；凝集素途徑是抗體非依賴性途徑，通過甘露聚糖結合凝集素(MBL，也稱作甘露糖結合蛋白)與碳水化合物如細菌或病毒表面上展示的那些碳水化合物的結合而引發的。該級聯反應的激活導致產生參與蛋白酶解或細胞裂解的複合物以及參與調理作用、過敏反應和趨化性的肽。補體級聯反應是動物免疫應答的重要成分，是不可逆的級聯。許多蛋白質輔因子調節該過程。不適當的調節、典型是不適當的激活該過程是包含不適當的炎症應答(如在急性和慢性炎症疾病中觀測到的那些應答)的多種病變的一方面或者可以發生這樣的病變。這些疾病和病症包括自身免疫疾病，如類風溼性關節炎和狼瘡，心血管疾病及其它炎症疾病，如膿毒症和缺血-再灌注損傷。由於補體途徑參與許多疾病和病症，因此補體途徑的成分是治療幹預的靶位，特別是抑制該途徑的靶位。這種治療的例子包括合成的和天然的小分子治療劑，抗體抑制劑， 及重組可溶形式的膜補體調節蛋白。製備這種治療劑的策略受到許多限制。小分子在體內具有短的半壽期，需要持續注入以保持補體抑制作用，從而限制了其作用、尤其在慢性疾病中的作用。治療性抗體在對象中產生免疫應答，並因此可以在治療特別是在調節免疫應答的治療中引起併發症。因此，還需要用於治療補體介導的疾病及其中補體激活起作用的疾病的治療劑。這些疾病包括急性和慢性炎症疾病。因此，本發明的一個目的是提供靶向補體級聯激活的這種治療劑及提供治療疾病的治療劑和方法。概述本發明提供了靶向補體級聯激活的治療劑和方法及治療疾病包括急性和慢性炎症疾病的方法。所述治療劑是靶向補體途徑底物的非補體蛋白酶。所述非補體蛋白酶包括未修飾的蛋白酶，其裂解其天然底物以及補體底物，及修飾的蛋白酶，其對於靶底物具有增加的選擇性或底物特異性。所述修飾的蛋白酶對於其天然底物可呈現降低或改變的活性。本發明提供的方法是調節補體激活的方法，所述方法是將非補體蛋白酶與補體途徑的任一或多種如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30或更多種靶底物接觸，從而靶底物蛋白質被裂解，由此改變包含所述靶底物的途徑中的補體激活。本發明還提供了蛋白酶在治療和/或配製藥物中的應用。這些方法及本文提供的任何方法和應用中的靶底物是補體蛋白質，包括Clq、C2、C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL、因子B、因子 D、因子 P、MASP-1、MASP-2、Clr、Cls、C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba、Bb 和纖維膠凝蛋白(ficolin)。所述接觸可以是離體(ex vivo)、在體外和/或在體內進行。示例的靶位包括具有 SEQ ID NO』98、四9、300、302、304、305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、 319、320、321、322、326、328、330、332、334、335、338、340、344、660-662 任一所示胺基酸序列的那些靶位，及呈現補體途徑活性的任何靶位片段，或者其等位基因或物種變體，或者具有 60、70、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高序列相同性的多肽。對於本文提供的所有方法和應用而言，所述靶底物可以存在於體液或者組織樣品中，或者可以是靶底物的集合或者含有這種底物的任何其他組合物。根據靶底物，補體激活可以被抑制或激活。所述方法靶向一或多個補體途徑。因此，調節的補體途徑可以選自補體的經典途徑、旁路途徑和凝集素途徑的一或多個。非補體蛋白酶與未修飾的蛋白酶或支架蛋白酶相比在任一或多個胺基酸殘基如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或更多個殘基含有修飾。修飾的胺基酸殘基增加了對於靶底物的特異性或者對於靶底物的活性之一或者二者。未修飾的蛋白酶或支架蛋白酶的例子包括任一種絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，例如粒酶B、粒酶A、粒酶M、組織蛋白酶G、MT_SP1、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶、糜酶(chymase)、α-類胰蛋白酶、β-類胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、膠原酶、因子XII、因子XI、因子CII、因子X、凝血酶、蛋白質C、u_纖溶酶原激活物(u-PA)、t-纖解酶原激活物(t-PA)、纖溶酶、血漿激肽釋放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶、克魯蛋白酶(cruzain)、金屬蛋白酶及其等位基因變體、 同工型和催化活性部分。例如，所述支架蛋白酶包含如下任一胺基酸序列或其催化活性部分、其等位基因和物種變體及具有60、70、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高序列相同性的多肽SEQ ID NO :2、4、8、77、79、83、85、87、89、93、99、117、119、121、123、132、134、138、 142、144、146、148、162、166、168、170、172、174、176、178、180、182、190、192、194、196、198、 200、202、204、206、208、218、220、222、224、226、238、248、250、260、262、280、282、373、375、 377、379、381、383、385、387、547、549 及 551。MT-SP1 或其片段，如 SEQ ID NO :2 和 10 分別所示的多肽序列，是一種支架蛋白酶實例。補體途徑的C2或C3蛋白質是MT-SPl蛋白酶、 修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的示例靶底物。MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的修飾包括在第146、224、41和/或151位的修飾(基於糜蛋白酶編號)。這種修飾的MT-SPl蛋白酶包括具有基於糜蛋白酶編號如下任一修飾的那些蛋白酶I41T/Y146D/G151L/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、及 I41T/Y146D/G151L/ Q175D/K224N、141T/Y146D/G151L/K224N, Y146D/G151L/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/ K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、 I41T/Y146D/ G151L/Q175Y/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N 及 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K2MN。特別地，修飾的 MT-SPl 含有胺基酸修飾 I41T/Y146D/G151L/K2MF。所述修飾可以是在有助於擴展的底物特異性或者相互作用的二級位點的任一或多個胺基酸中，例如，基於糜蛋白酶編號在相應於MT-SPl蛋白酶的97、146、192和2M任一或多個胺基酸位置的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分中的修飾。這種修飾的例子是基於糜蛋白酶編號的MT-SPl蛋白酶的一或多個F97、Y146、Q192和K2M的修飾，如F97D、F97E、 F97A、F97W、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、Q192R、Q192V、K224A 和 K224F。這種修飾的MT-SPl蛋白酶的例子包括具有SEQ ID NO 16、18、20、22、對、26、沘、30、32、34、36、 14,38和40及405-418所示任一胺基酸序列的那些多肽。修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的其它例子包括胺基酸修飾Y146D/K224F或Y146E，如相應於具有SEQID NO :12、 404,28或412所示胺基酸序列的修飾的MT-SPl多肽的那些蛋白酶。MT-SPl蛋白酶及其催化活性部分包括含有基於糜蛋白酶編號如下一或多種修飾的多肽:F97N、F97D、F97E、F99Y、F99V、F99W、D217A、D217V、F97A、F97W、F99A、Y146N、Y146D、 Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、W215F、W215Y、Q192V、Q192R、Q192F、K224A、K224F、M180E、 Y146D/K224F、 D96A、 Y146E/K224N、 I41T/Y146E/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/K224F、 I41T/ Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/ G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/ Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/ L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/ Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/K224A、Y146D/Q175H/K224L、 Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/ Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/Y146D/ K224F、 I41L/Y146D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/K224F、 I41A/Y146D/K224F、 I41E/Y146D/ K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、 Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/Y146D/ Q175D/K224R、 I41T/Y146D/Q175D/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、 I41T/Y146D/ G151L/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、 I41T/Y146E/Q175D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/ Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、Y146D/ Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/ Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、 I41T/ Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/ K224N和I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K2MN。這種修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的例子包括具有 SEQ ID NO :12、14、16、18、20、22、對、26、沘、30、32、34、36、38、40-69、 404-418、419-447、524-533、552-659或663-710所示任一胺基酸序列的那些多肽。特別地， 修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分是具有SEQ ID NO :596或650所示胺基酸序列的一種。對於本文提供的所有方法和應用而言，可以選擇修飾以便所述修飾的蛋白酶如 MT-SPl裂解靶底物的底物識別位點。靶底物是任一的上述補體途徑多肽並且為本領域技術人員所已知，包括例如C2和/或C3。例如，在靶底物是C2的情況中，所述底物識別位點包括胺基酸序列SLGR (SEQ ID NO :392)。本文提供的方法和應用中靶向的其它識別位點包括因子I底物識別位點，如 LPSR (SEQ ID NO :388)、SLLR (SEQ ID NO :389)或 HRGR (SEQ ID NO :390)。MT-SPl 蛋白酶或其催化活性部分中的修飾可以相應於基於糜蛋白酶編號的MT-SPl蛋白酶第174、217、96、 192、146或99位的任一或多個胺基酸位置，如基於糜蛋白酶編號MT-SPl蛋白酶的Q174、 D217、D96、Q192、Y146*F99的任一或多個胺基酸。這種修飾的例子是選自如下的一或多種修飾Q174H、D217Q、D217N、D217H、D96A、D96V、D96F、D96S、D96T、Q192L、Q192I、Q192F、 Y146F、F99A、F99V、F99S 及 F99G (見例如具有 SEQ ID NO :41-57 或 419-435 所示任一胺基酸序列的多肽)。另一識別位點包括胺基酸序列LPSR。針對其識別而加以修飾的修飾的蛋白酶的例子是在相應於基於糜蛋白酶編號的MT-SPl蛋白酶的第174、180、215、192或99位的任一或多個胺基酸例如基於糜蛋白酶編號在MT-SPl蛋白酶的Q174、M180、W215、Q192或F99 的任一或多個胺基酸位置的位點具有修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分。這種修飾的例子是任一或多個 Q174F、Q174V、Q174L、Q174Y、M180E、W215F、W215Y、Q192K、Q192R、 Q192Y 及 F99Y (見例如具有 SEQ ID NO :36、58、59、61、62、69、416、436、437、439、440、447 或 524-533所示任一胺基酸序列的修飾的MT-SPl多肽)。用於本發明方法中的另一底物識別位點包括胺基酸序列HRGR。具有識別這種位點的修飾的蛋白酶的例子是具有以下修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分，所述修飾是在相應於基於糜蛋白酶編號的MT-SPl蛋白酶的第215、174,217,192和99位例如基於糜蛋白酶編號在MT-SPl蛋白酶的W215、Q174、D217、Q192和F99的任一或多個胺基酸位置的修飾。所述修飾的例子是選自任一或多個W215F、W215Y、Q174A、Q174V、Q174F、Q174R、Q174K、 D217A、D217V、Q192E、F99W 和 F99Y (例如相應於含有 SEQ ID NO 58-69 和 436-447 所示任一胺基酸序列的修飾的MT-SPl多肽的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分)。本發明提供了治療補體介導的疾病和其症狀通過調節補體途徑而改善的疾病的方法，所述補體途徑包括經典、旁路和凝集素途徑的一或多個途徑。在實施本發明的方法中，將一或多種非補體蛋白酶與一或多種靶底物接觸，如通過在體外、體內或離體給予，從而所述非補體蛋白酶裂解補體途徑的任一或多種靶底物，由此包含所述靶底物的途徑中的補體激活被改變。本發明還提供了非補體蛋白酶在治療這類疾病和病變和/或配製進行這種治療的藥物中的應用。調節包括抑制或增強(增加)補體激活。補體激活的抑制可以導致與補體介導的病變相關的炎症症狀的減少。炎症疾病的例子是神經變性疾病和心血管疾病，例如但非限於膿毒症、類風溼性關節炎(RA)、膜性增生性腎小球腎炎(MPGN)、多發性硬化(MS)、重症肌無力(MG)、哮喘、炎症性腸病、免疫複合物(IC)-介導的急性炎症性組織損傷、阿爾茨海默病(AD)、缺血-再灌注損傷和Guillan-Barre症候群。補體介導的疾病可以是對對象進行的治療所導致。缺血-再灌注損傷可以是選自如下的事件或治療所引起的 心肌梗塞(Ml)、中風、血管成形術、冠狀動脈旁路搭橋術、心肺轉流術(CPB)及血液透析。本發明提供的治療方法可以通過在治療對象明顯病變之前給予對象非補體蛋白酶而實現。正如所指出的，可以通過將體液或者組織樣品在體外、離體或在體內與非補體蛋白酶接觸而實現給予。補體介導的缺血-再灌注損傷是這種病變的一個例子。導致這種病變的治療是血管成形術或冠狀動脈旁路搭橋術。正如上文所述，在本文提供的任何方法和應用中，靶底物包括一或多種Clq、C2、 C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL、因子 B、因子 D、因子 P、MASP-1、MASP-2、Clr、Cls、 C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba、m3 和纖維膠凝蛋白，如含有 SEQ ID NO :298、299、300、302、 304、305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、326、328、330、332、 334、335、338、340或344所示任一胺基酸序列或其呈現補體活性的片段的底物。在這些方法和應用及本文提供的所有方法和應用中，所述非補體蛋白酶與未修飾的蛋白酶或支架蛋白酶相比較可包括在任一或多個胺基酸殘基的修飾，其中修飾的胺基酸殘基增加對於靶底物的特異性或者對於靶底物的活性或者這二者。未修飾的蛋白酶或支架蛋白酶包括任一種絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，如粒酶B、粒酶A、粒酶M、組織蛋白酶G、MT-SP1、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶、糜酶、 α-類胰蛋白酶、β-類胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、膠原酶、因子XII、因子XI、因子CII、 因子X、凝血酶、蛋白質C、U-纖溶酶原激活物(u-PA)、t-纖溶酶原激活物(t-PA)、纖溶酶、 血漿激肽釋放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶、克魯蛋白酶、金屬蛋白酶及其等位基因變體、同工型和催化活性部分。例子是含有或具有如下任一胺基酸序列的那些蛋白酶:SEQ ID NO :2、4、8、77、79、83、85、87、89、93、99、117、119、121、123、132、134、138、 142、144、146、148、162、166、168、170、172、174、176、178、180、182、190、192、194、196、198、 200、202、204、206、208、218、220、222、224、226、238、248、250、260、262、280、282、373、375、 377、379、381、383、385、387、547、549和551及其催化活性部分。MT-SPl是本發明提供的一種支架蛋白酶實例並如上文描述。裂解可靶向於上述識別序列。本文描述的任何修飾的MT-SPl包括如上述任何MT-SPl可用於治療方法中。用於本文提供的治療中的修飾的 MT-SPl多肽或其催化活性部分的例子包括具有SEQ IDNO 12、14、16、18、20、22、24、26、28、 30、32、34、36、38、40-69、404-418、419-447、524-533、552-659 或 663-710 所示任一胺基酸序列的任何多肽或其催化活性部分。特別地，用於本文提供的治療中的MT-SPl多肽或其催化活性部分具有SEQ ID NO 596或650所示胺基酸序列。在本文提供的任何或所有方法和應用中，非補體蛋白酶或其催化活性部分可以與治療補體介導的疾病或任何其它疾病的另一種藥物或治療組合給予。所述另一種藥物或治療可以與所述非補體蛋白酶同時、相繼、或交替給予。所述另一種藥物可以作為單獨的組合物或者與所述非補體蛋白酶於同一組合物中給予。另一種藥物的例子是抗炎劑和抗凝血劑，例如但非限於任一或多種NSAID、抗代謝物、皮質類固醇、鎮痛藥、胞毒劑、促炎細胞因子抑制劑、抗炎細胞因子、B細胞靶向劑、靶向T抗原的化合物、粘附分子阻斷劑、 趨化因子受體拮抗劑、激酶抑制劑、PPAR-Y配體、補體抑制劑、肝素、華法林、醋硝香豆素 (acenocoumarol)、苯茚二酮、EDTA、檸檬酸鹽、草酸鹽、阿加曲班(argatroban)、來匹盧定 (Iepirudin)、比伐盧定(bivalirudin)禾口希美力口群(ximelagatran)。本發明還提供了非補體蛋白酶及其它成分的組合物，如試劑、另一些藥物，及給予所述蛋白酶和/或藥劑及任何其它成分的裝置和容器。所述組合物可以實施或實現本文提供的方法和應用。因此本發明提供的組合物成分例如包括(a)裂解補體途徑的任一或多種補體靶底物的非補體蛋白酶，由此包含所述靶底物的途徑中的補體激活被改變； 及(b)治療補體介導的疾病的另一種藥物，例如但非限於抗炎劑或抗凝劑，例如任一或多種NSAID、抗代謝物、皮質類固醇、鎮痛藥、胞毒劑、促炎細胞因子抑制劑、抗炎細胞因子、B 細胞靶向劑、靶向T抗原的化合物、粘附分子阻斷劑、趨化因子受體拮抗劑、激酶抑制劑、 PPAR-Y配體、補體抑制劑、肝素、華法林、醋硝香豆素、苯茚二酮、EDTA、檸檬酸鹽、草酸鹽、 阿加曲班、來匹盧定、比伐盧定和希美加群。正如所指出的，所述組合物用於實施或實現本文所述調節補體途徑的任何方法， 所述補體途徑如補體的經典途徑、旁路途徑或凝集素途徑的一或多個。靶底物和支架蛋白酶包括上述那些任何靶底物和支架蛋白酶。例如，支架蛋白酶包括表14所示任何蛋白酶及表14所示蛋白酶的等位基因變體、同工型和催化活性部分。這種蛋白酶的例子包括具有或含有如下所示任一胺基酸序列或其催化活性部分或其等位基因或物種變體的任何蛋白酶 SEQ ID NO :2、4、8、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、 109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、128、130、132、134、136、138、140、142、144、 146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、 222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、 260、262、264、266、268、269、270、272、274、276、278、280、282、284、286、287、289、291、293、 295、297、373、375、377、379、381、383、385、387、544、545、547、549 和 551。在一些實例中，所述組合物中使用的蛋白酶是MT-SPl或其催化活性部分，如SEQ ID NO :2或10所示MT-SPl， 及上述變體。正如上文所述，MT-SPl蛋白酶及其催化活性部分包括含有基於糜蛋白酶編號的如下一或多種修飾的多肽F97N、F97D、F97E、F99Y、F99V、F99W、D217A、D217V、F97A、 F97W、F99A、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、W215F、W215Y、Q192V、Q192R、Q192F、K224A、K224F、M180E、Y146D/K224F、D96A、Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224R、I41T/ Y146D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/Q221aE/ K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/ K224R,Y146E/Q175D/K224N,Y146D/K224R,I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F,Y146E/Q175D/ K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/ K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/K224A、Y146D/ Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K24L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、 Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、 H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/ Y146D/K224F、 I41L/Y146D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/K224F、 I41A/Y146D/K224F、 I41E/ Y146D/K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/ K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/ Y146D/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/Q175D/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、 I41T/ Y146D/G151L/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/ K224N、 I41T/Y146E/Q175D/K224F、 I41T/Y146E/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/G151L/K224N、 Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、 Y146D/Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/ G151L/Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、 I41T/Y146D/G151L/ Q175H/K2MN和I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K2MN。這種修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的例子包括具有 SEQ ID NO :12、14、16、18、20、22、對、26、沘、30、32、34、36、38、40-69、 404-418、419-447、524-533、552-659或663-710所示任一胺基酸序列的那些多肽。特別地， 修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分具有SEQ ID NO :596或650所示胺基酸序列。在一些情況中，MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分中的修飾包括有助於擴展的底物特異性或相互作用二級位點的任一或多個胺基酸的修飾。這種修飾的例子包括但非限於在相應於基於糜蛋白酶編號的MT-SPl蛋白酶第97、146、192和2 位的任一或多個胺基酸位置的修飾。這種修飾的例子是基於糜蛋白酶編號在MT-SPl蛋白酶F97、Y146、Q192和K2M的任一或多個胺基酸中的修飾，如MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分中的修飾選自任一或多個 F97D、F97E、F97A、F97W、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、Q192R、Q192V、K224A、 和K2MF(例如MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分相應於具有SEQ ID NO 16、18、20、22、24、 洸、28、30、32、；34、36、14、38和40及405-418所示任一胺基酸序列的修飾的MT-SPl多肽和 /或在Y146D和K224F或Y146E位置具有修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分，如具有 SEQ ID NO :12、404、28或412所示胺基酸序列的那些修飾的MT-SPl多肽)。在本發明提供的組合物和方法及應用中，所述非補體蛋白酶可裂解靶底物的底物識別位點。識別位點的例子如上文所述。本發明還提供了特殊修飾的非補體蛋白酶。例如本發明提供了在支架蛋白酶的任一或多個胺基酸中含有修飾的非補體蛋白酶，其中所述修飾的胺基酸殘基增加對於靶底物的特異性或對於靶底物的活性或者這二者，其中所述靶底物是補體蛋白質，如上述任何靶底物或其混合物及其原料。所述修飾的非補體蛋白酶包括上述任何合適的支架，如支架蛋白酶選自粒酶B、粒酶A、粒酶M、組織蛋白酶G、MT-SP1、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶、糜酶、 α-類胰蛋白酶、β-類胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、膠原酶、因子XII、因子XI、因子CII、因子X、凝血酶、蛋白質C、U-纖溶酶原激活物(u-PA)、t-纖溶酶原激活物(t-PA)、纖溶酶、血漿激肽釋放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶、克魯蛋白酶、金屬蛋白酶及其等位基因變體、同工型和催化活性部分。靶底物包括上述任何靶底物，例如但非限於C2 和/或C3。修飾的非補體蛋白酶的例子包括基於MT-SPl支架(全長或其催化活性部分)的那些蛋白酶。所述MT-SPl支架包括一個或者至少兩或多個修飾，其中基於糜蛋白酶編號， 一個修飾是在第146位，另一個修飾在第2M位，條件是(i)在蛋白酶僅包括兩個修飾的情況中，所述蛋白酶不包括Y146D和K2MF作為這兩個修飾；及(ii)在蛋白酶含有三個修飾的情況中，所述蛋白酶不包括F99V或I或L或T 與Y146D和K2MF。例如，這種修飾的非補體蛋白酶可含有至少兩或多個修飾，基於糜蛋白酶編號，其中一個修飾在第146位，另一個修飾在第2M位，條件是(i)在蛋白酶僅包括兩個修飾的情況中，所述蛋白酶不包括Y146D和K224F作為這兩個修飾；及(ii)在蛋白酶含有三個修飾的情況中，所述蛋白酶不包括F99V或I或L或T與Y146D和K2MF。MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分也包括在第141位和/或第41位含有一個或者至少兩或多個修飾的修飾的蛋白質。上述任何修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的例子包括含有基於糜蛋白酶編號的如下任何修飾的修飾的MT-SPl 141T/Y146D/G151L/K224F, I41T/Y146D/ G151L/Q175D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、 和 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K2MN、141T/Y146D/G151L/K224N,Y146D/G151L/K224N, I41T/ Y146D/G151L/Q175K/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/ K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/ G151L/Q175R/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N 和 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/ K224N。這種修飾的蛋白酶的例子包括具有選自如下基於糜蛋白酶編號的任一或多個修飾的 MT-SPl 蛋白酶或其催化活性部分D96A、D96V、D96F、D96F、D96S、D96T、F99S、F99G、 Q174H、Q174A、Q174V、Q174F、Q174R、Q174K、Q174L、Q174Y、Q192L、Q192I、Q192E、Q192K、 Q192Y、D217Q、D217N、D217H、K224A。例子是含有或具有 SEQ ID NO :41-51、56、57、60_64、 67,419-429,431,434,435,438-442 或 445 所示任一胺基酸序列的 MT-SPl 蛋白酶。修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的例子還包括具有基於糜蛋白酶編號的如下任一修飾的任何MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分Y146E/K2MN、I41T/Y146E/ Q175D/K224R、 I41T/Y146D/K224F、 I41T/Y146E/Q175D/K224N、 I41T/Y146E/G151L/Q175D/ K224L、Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/ K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/ Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/ Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/D224L、Y146E/Q221aE/ K224R、Y146E/K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/ Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/ D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、 I41T/Y146E/K224L、 I41F/Y146D/K224F、 I41L/Y146D/K224F、 I41T/Y146D/ G151L/K224F、 I41A/Y146D/K224F、 I41E/Y146D/K224F、 I41D/Y146D/K224L、 I41D/Y146D/ K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/ K224F、 I41T/Y146D/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/Q175D/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/G151L/ Q175D/K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F、及 I41T/Y146E/ Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/ G151L/K224N,Y146D/Q175R/K224N,Y146D/Q175K/K224N,Y146D/Q175H/K224N,I41T/Y146D/ G151L/Q175K/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/G151L/ Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N 及 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N。這種蛋白酶的例子是具有如下所示任一胺基酸序列的任何蛋白酶SEQ ID NO :41-51,56,57, 60-64、67、69、419-429、431、434、435、438-442、445、524、525、527-530、532、533、552-659 或 663-710。特別地，修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分具有SEQ ID NO :596或650所示胺基酸序列。本發明提供的修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分是裂解靶底物、典型在靶底物的底物識別位點裂解靶底物的那些MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分。靶底物的例子包括C2或C3。C2的裂解可以在C2中的底物識別位點SLGR(SEQ ID NO 392)處。在支架蛋白酶的任一或多個胺基酸中含有修飾的經修飾的非補體蛋白酶中，所述修飾的胺基酸殘基增加對於靶底物的特異性或者低於靶底物的活性或者這二者，其中所述靶底物是一種補體蛋白質，與不具有修飾的相對比，這種具有修飾的修飾的非補體蛋白酶不裂解VEGF或VEGFR或者呈現VEGF或VEGFR的裂解活性降低或者呈現對於靶底物如補體蛋白質較對VEGF或VEGFR更高的底物特異性或活性。例如，所述非補體蛋白酶裂解補體蛋白質較其裂解VEGF或VEGFR具有至少或大約1倍、1. 5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、 100倍、200倍、500倍、1000倍或更高的特異性或活性。所述靶底物包括補體蛋白質，例如但非限於任一或多種 Clq、C2、C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL、因子 B、因子 D、因子 P、MASP-1、MASP-2、Clr、Cls、C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba、Bb 和纖維膠凝蛋白。靴底物的例子包括但非限於含有如下所示任一個胺基酸序列或其呈現補體活性的片段的靶底物=SEQ ID NO :298、299、300、302、304、305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、319、 320、321、322、326、328、330、332、334、335、338、340 和 344。支架蛋白酶包括任何蛋白酶，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶或者金屬蛋白酶，如表14列出的任何蛋白酶，及其等位基因和物種變體、同工型和催化活性部分，及其與本文表中或別處提供的任何蛋白酶具有60、65、70、75、 80、85、90、95、96、97、98、99%或更高序列相同性的修飾的形式，如含有如下所示任一胺基酸序列的支架蛋白酶或其催化活性部分=SEQ ID NO :2、4、8、71、73、75、77、79、81、83、85、 87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、 128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、 166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、 204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、 242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、269、270、272、274、276、278、280、282、284、286、287、289、291、293、295、297、373、375、377、379、381、383、385、387、 544,545,547,549和551。所述支架可用於製備修飾的蛋白酶及用於本文所述任何方法或應用中。如上文所述，MT-SPl或其催化活性片段是這種蛋白酶的一個實例。MT-SPl蛋白酶或其一部分的一個例子具有SEQ ID NO :2或10所示胺基酸序列。修飾包括改變底物特異性或選擇性的任何修飾，特別是增加底物對於補體蛋白質的特異性或選擇性的那些修飾。這種修飾的例子是具有基於糜蛋白酶編號的如下任何修飾的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分D96A、D96V、D96F、D96F、D96S、D96T、F97D、F97E、F97A、F97ff、F99A、F99S、F99G、 F99W、F99Y、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、Q174H、Q174A、Q174V、Q174F、Q174R、 Q174K、Q174L、Q174Y、M180E、Q192R、Q192V、Q192L、Q192I、Q192F、Q192E、Q192K、Q192Y、 W215F、W215Y、D217Q、D217N、D217H、D217A、D217V、K224A、Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/ K224R、 I41T/Y146D/K224F、 I41T/Y146E/Q175D/K224N、 I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、 Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、 Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/ K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/ K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、 Y146E/K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/ K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/ K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/ K224T、 I41T/Y146E/K224L、 I41F/Y146D/K224F、 I41L/Y146D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/ K224F、 I41A/Y146D/K224F、 I41E/Y146D/K224F、 I41D/Y146D/K224L、 I41D/Y146D/K224F、 Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、 I41T/Y146D/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/Q175D/K224N、 I41T/ Y146D/G151L/Q175D/K224F, I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L, I41T/Y146D/G151L/Q175D/ K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F 和 I41T/Y146E/Q175D/ K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/ K224N,Y146D/Q175R/K224N,Y146D/Q175K/K224N,Y146D/Q175H/K224N,I41T/Y146D/G151L/ Q175K/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、 I41T/ Y146D/G151L/Q175Y/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/ K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N 和 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N，及其等位基因和物種變體和同工型及與其具有60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高序列相同性及包括相應修飾的變體。例如，修飾的MT-SPl多肽含有SEQ ID NOS :41_51、56、57、 60-64、67、69、419-429、431、434、435、438-442、445、524、525、527-530、532、533、552-659、 或663-710所示任一胺基酸序列。本發明還提供了含有本發明提供的任何修飾的非補體蛋白酶或組合成分的藥物組合物。如果需要，則所述藥物組合物包括藥物可接受的賦形劑及其它成分。根據任何希望的或合適的給予途徑配製所述組合物，所述給予途徑包括但非限於全身給予、口服、經鼻、 肺、局部(local)或表面(topical)給予。本發明提供了試劑盒。所述試劑盒可用於實施本發明方法。本發明提供了含有組合物的試劑盒。本發明還提供了含有藥物組合物的試劑盒。所述試劑盒也可以含有給予所述組合物和/或蛋白酶的裝置，及任選給藥說明書及用於所述方法中的其它試劑和產品。本發明還提供了編碼任何修飾的非補體蛋白酶的核酸分子。這些核酸分子是編碼或者在中等或高度嚴格條件下與編碼SEQ ID NO :12、14、16、18、20、22、24、洸、28、30、32、 34、36、38、40-69、404-418、419-447、524-533、552-659 或 663-710 所示任何多肽的任何核酸雜交的核酸分子。這些核酸分子還包括選自如下的那些核酸分子a)包含 SEQ ID NOS :11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、451_455、 457-462、464-479和534-538所示任一核苷酸序列的核酸分子；b)包含與 SEQ ID NO :11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、451_455、 457-462、464-479、534-538 所示核苷酸序列具有至少 60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99%序列相同性的核酸分子；c)在中等或高度嚴格條件下其全長的至少70%與包含SEQ ID NOS :11、13、15、 17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、451-455、457-462、464-479、534-538 所示任何核苷酸序列的核酸分子雜交的核酸；d)包含a)、b)或C)的簡併密碼子的核酸分子；或者e)包含 SEQ ID NO :11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、451_455、 457-462、464-479、534-538或者a)_d)任一的剪接變體或等位基因變體的核酸分子，或者核酸分子選自如下之中a)包含 SEQ ID NO :480-493、495-499、501-506、508-523、539_543 所示任何核苷酸序列的核酸分子；b)包含與 SEQ ID NO :480-493、495-499、501-506、508-523、539_543 所示核苷酸序列具有至少 60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%序列相同性的核酸
分子；c)在中等或高度嚴格條件下其全長的至少70%與包含SEQ ID NO =480-493, 495-499、501-506、508-523、539-543所示任何核苷酸序列的核酸分子雜交的核酸；d)包含a)、b)或c)的簡併密碼子的核酸分子；或者e)包含 SEQ ID NO :480-493、495-499、501-506、508-523、539_543 或者 a) _d)任
一的剪接變體或等位基因變體的核酸分子。含有所述核酸分子的載體。載體包括真核表達載體和原核表達載體，包括哺乳動物和酵母載體。本發明還提供了含有所述核酸分子和/或載體的細胞。表達載體的例子包括但非限於腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、EBV、SV40、巨細胞病毒載體、痘苗病毒載體、皰疹病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體和人工染色體。本文還提供了產生或製備編碼的非補體蛋白酶的方法。所述載體或核酸分子被導入細胞中並在一定條件下培養，從而表達所述蛋白酶。所述核酸分子可包括編碼指導表達的蛋白酶交通(trafficking)的信號序列例如分泌信號序列的序列。可以通過本領域技術人員已知的常規方法純化表達的蛋白酶。本發明提供了通過給予對象核酸分子、載體或細胞的治療方法。所治療的疾病包括由補體蛋白質或者補體途徑介導或參與的任何疾病，如具有潛在炎症成分或病理學的疾病。載體包括整合進宿主細胞染色體的表達載體或者保留附加體的載體。給予可以是體內給予或離體給予。離體治療包括將所述核酸在體外給予細胞，隨後將所述細胞給予對象。所述細胞可以來自合適的(相容的)供體或者來自治療對象如人。
本發明還提供了融合蛋白，其含有與非蛋白酶多肽融合的任何非補體蛋白酶的催化活性部分。融合可以通過在任一末端插入非蛋白酶多肽或鍵而實現。附圖簡述圖1描述了經典、凝集素和旁路補體途徑及終末補體複合物膜攻擊複合物(MAC) 的激活。圖中特別示出參與補體級聯的30種以上的蛋白質、它們在該級聯中的作用及在合適情況中它們在補體途徑中的會聚點(points of convergence)。例如，這三個途徑集中於C3轉變酶的產生，其裂解C3形成C5轉變酶，導致MAC複合物形成。圖中還描述了許多補體裂解產物的產生。所述途徑中描述的所有蛋白質均可作為靶底物。詳細描述
概述
A.定義
B.靶補體
1.命名法
2.補體開始途徑
a.經典途徑
b.旁路途徑
C.凝集素途徑
3.補體介導的效應功能
a.補體介導的裂解膜攻擊複合物
b.炎症
C.趨化性
d.調理作用
e.體液免疫應答的激活
4.補體受體
5.補體調節
a.因子I
6.補體介導的疾病
a.由補體激活介導的疾病
i.類風溼性關節炎
ii.膿毒症
iii.多發性硬化
iv.阿爾茨海默病
v.缺血-再灌注損傷
b.由補體缺陷介導的疾病
C.蛋白酶
1.蛋白酶的分類
a.絲氨酸蛋白酶
i. MT-SPl
ii.粒酶B
b.半胱氨酸蛋白酶
C.天冬氨酸蛋白酶
d.金屬蛋白酶
e.蘇氨酸蛋白酶
D.支架蛋白酶
1.修飾的支架蛋白酶
a.合理修飾
i.位置掃描庫的合成及使用螢光篩選
b.經驗修飾
2.評估特異性的方法
3.蛋白酶多肽
a. MT-SPl 多肽
E.評估或監測修飾的蛋白酶對補體介導的功能的活性的分析方法
a.蛋白質檢測
i. SDS-PAGE
.酶免疫測定
iii.放射免疫擴散法(RID)
b.溶血反應
F.產生編碼修飾的蛋白酶的核酸的方法及產生修飾的蛋白酶多肽的方法
1.載體和細胞
2.表達
a.原核生物
b.酵母
C.昆蟲細胞
d.哺乳動物細胞
e.植物
3.純化技術
4.融合蛋白
5.核苷酸序列
G.使用方法配製/包裝/給予
1.修飾的蛋白酶多肽的給予
2.編碼修飾的蛋白酶多肽的核酸的給予(基因治療)
H.治療應用
1.免疫介導的炎症疾病
2.神經變性疾病
3.心血管疾病
I.組合治療
J.實施例
A.定義
除非特別指出，則本文的所有技術和科學術語均具有本發明所屬技術領域技術人員通常理解的相同含義。除非特別指出，則本文提及的所有專利、專利申請、公布的申請和出版物、Genbank序列、資料庫、網站及其它公開的材料均以其全部內容併入作參考。在文中的術語有多種含義的情況中，在本文中使用其常用含義。當引用URL或其他標識符或地址時，應理解這種標識符可能改變並且網際網路上特定信息可能變來變去，但是相同信息可以通過搜索網際網路發現。這種引用證實了這種信息的可獲得性和公開傳播。如本文所用，MBL (甘露糖結合凝集素)也稱作甘露糖結合蛋白(MBP)。如本文所用，補體激活是指由多種激活物包括例如抗原-抗體複合物、脂多糖或者微生物多糖引發的血清成分Cl至C9的相繼激活，通過任何途徑而產生炎症應答。 如本文所用，「補體蛋白，，或者「補體成分」是補體系統蛋白質，其在對抗感染和炎症過程的宿主防禦中發揮作用。補體蛋白構成本文提供的蛋白酶及修飾的蛋白酶的靶底物。補體蛋白是在所有脊椎動物中發現的一組相互作用血液蛋白質和糖蛋白。除了結合補體反應產物及在炎症細胞和免疫系統細胞上出現的細胞表面受體之外，有至少30種可溶的血漿蛋白質。另外，還具有保護宿主細胞免於意外補體攻擊的調節性膜蛋白。補體蛋白包括在經典途徑中發揮作用的那些蛋白質，例如C2 ；在旁路途徑中發揮作用的那些蛋白質，例如因子B ；及在凝集素途徑中發揮作用的那些蛋白質，例如MASP-1。在這些補體蛋白質中是蛋白酶參與補體途徑。另外，如本文所用，補體蛋白包括任何「裂解產物」(也稱作「片段」)，其是基於補體級聯的激活而形成。補體蛋白還包括無活性或改變形式的補體蛋白，如 iC3 和 C3a-desArg。因此，補體蛋白包括但非限於Clq、Clr、Cls、C2、C3、C3a、C3b、C3c、C3dg、C3g、C3d、 C3f > iC3、C3a_desArg、C4、C4a、C4b、iC4、C4a_desArg、C5、C5a、C5a-des_Arg、C6、C7、C8、 C9、MASP-1、MASP-2、MBL、因子 B、因子 D、因子 H、因子 I、CRl、CR2、CR3、CR4、備解素、C1 Inh、 C4bp、MCP、DAF,⑶59 (MIRL)、簇蛋白和HRF及任何補體蛋白的等位基因變體和物種變體。如本文所用，「天然」形式的補體蛋白是在不存在補體激活的條件下可分離自生物體如脊椎動物的補體蛋白，其未在實驗室中人為有意修飾。天然補體蛋白的例子包括Clq、 (11~、(18、02、03、04、因子8、因子0、備解素、05、06、07、〇6 和 C9。通常地，天然補體蛋白是無活性的，在激活的基礎上獲得活性。激活可需要活化裂解、成熟裂解和/或與其它蛋白質的複合物形成。一個例外是因子I和因子D，在其天然形式就具有酶活性。在一些實例中，天然補體蛋白的激活在蛋白質裂解後發生。例如，補體酶原如C2和因子B是通過蛋白酶裂解自身激活的蛋白酶，如此C2由蛋白酶Cl s裂解產生 C2b，C2b與C4b結合形成具有蛋白酶解活性的C4l32b(C3轉變酶)，蛋白酶因子D裂解因子 B產生恥，其與Ob結合形成蛋白酶解活性的另一種C3轉變酶，(北恥。在另一個實例中， 無活性的天然補體蛋白的裂解導致蛋白質的結構穩定性改變，導致該蛋白質激活。例如，C3 和C4含有內部硫酯鍵，其在天然蛋白質中是穩定的，但是在蛋白質裂解所致構象變化之後可以變為高度反應性和活性的。因此，C3和C4的裂解產物是生物學活性的。C3和C4的激活也可在無裂解的情況中自發發生。這是天然C3中硫酯鍵的自發轉化，這是補體旁路途徑的引發事件。在其它實例中，天然補體蛋白的激活在釋放出抑制其它活性天然補體蛋白的活性的複合調節分子之後發生。例如，Clinh結合併失活Cls和Clr，除非它們與Clq複合。
如本文所用，成熟裂解是指酶原激活所需的任何裂解的統稱。其包括導致構象變化而產生活性的裂解(即活化裂解)。其還包括其中關鍵的結合位點被暴露或者位阻被暴露或者抑制性節段被除去或移動的裂解。如本文所用，改變形式的補體蛋白是指以對其分子結構進行修飾獲得的非天然形式存在的補體蛋白。例如，硫酯與水的C3反應可以在無轉變酶裂解的條件下發生，產生稱作iC3和iC4的水解無活性形式的C3和C4。在另一個實例中，過敏毒素(包括C3a、Cfe和 C4a)可以通過羧肽酶N脫精氨酸化(desarginated)為更穩定、更低活性形式。如本文所用，補體蛋白的「片段」或「裂解產物」是含有天然補體蛋白多肽序列一部分的補體蛋白亞組(subset)。補體蛋白的片段通常在任一或多個如1、2或3個補體級聯激活之後獲得。通常，片段得自天然補體蛋白的蛋白酶解裂解。例如，因子B由因子D酶解，產生兩個片段組成B的N末端部分的Ba，組成C末端部分並含有絲氨酸蛋白酶位點的恥。補體蛋白的片段也得自補體蛋白另一片段的蛋白酶解。例如，Ob是由C3裂解產生的片段，其由因子I裂解產生片段iC!3b和C3f。通常補體蛋白的裂解產物是生物學活性產物， 發揮裂解補體系統效應分子的作用。因此，補體蛋白的片段或一部分包括補體蛋白的裂解產物，也包括保留或呈現至少一種活性的蛋白質的部分。如本文所用，「裂解效應分子」或者「裂解效應蛋白」是指由於補體系統的觸發的酶級聯的結果而產生的活性裂解產物。裂解效應分子、得自補體激活的片段或裂解產物可助於任一或多種補體介導的功能或活性，包括調理作用、過敏反應、細胞裂解和炎症。裂解或效應分子的例子包括但非限於C3a、C3b、C4a、C4b、C5a、C5b-9和恥。補體系統的裂解效應分子依靠參與級聯而呈現活性，包括刺激炎症、促進抗原吞噬和直接裂解一些細胞。補體裂解產物促進或參與補體途徑的激活。如本文所用，過敏毒素(例如C3a、Wa或C5a)是觸發參與炎症應答特別是作為防禦寄生蟲的一部分的肥大細胞或嗜鹼性粒細胞脫粒(從中釋放物質)的裂解效應蛋白。 如果脫粒太強，則其可導致過敏反應。過敏毒素也間接介導平滑肌細胞痙攣(如支氣管痙攣)，增加毛細血管的通透性和趨化性。如本文所用，趨化性是指受體介導的白細胞向化學引誘物方向運動，典型是其濃度增加的方向，如過敏毒素濃度增加的方向。如本文所用，調理作用是指病原體或其它顆粒的表面的改變，由此其被吞噬細胞吞噬。結合或改變病原體表面的蛋白質被稱作調理素。抗體和補體蛋白使胞外細菌易受調理素的作用，以被吞噬細胞如嗜中性粒細胞和巨噬細胞攝取和破壞。如本文所用，細胞裂解是指通過破壞細胞壁或細胞膜而分裂細胞。紅細胞溶血是細胞裂解的一個測量標準。如本文所用，「蛋白酶」和「肽酶」可互換用於描述催化共價肽鍵水解的酶。這些名稱包括其酶原形式及激活的單鏈、雙鏈和多鏈形式。為清晰而見，提及蛋白酶是指所有形式。蛋白酶包括例如絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，根據其活性位點的催化活性和裂解靶底物的肽鍵的機制而定。如本文所用，酶原是指通過蛋白酶解激活的蛋白酶，所述蛋白酶解包括成熟裂解如活化裂解和/或與其它蛋白質和/或輔因子的複合物形成。酶原是蛋白酶解酶的無活性前體。這種前體通常比活性形式更大，儘管非必需更大。對於絲氨酸蛋白酶，通過特異性裂解包括催化和自身催化裂解或者通過結合激活輔因子而產生活性酶，酶原被轉變為活性酶。因此，酶原是一種酶無活性的蛋白質，通過激活物的作用而被轉變為蛋白酶解酶。裂解可以是自身催化實現的。許多補體蛋白是酶原，它們是無活性的，但是基於感染後補體系統引發而變為裂解和激活的。酶原通常是無活性的，通過對酶原的前區(proregion)進行催化或者自身催化裂解而可被轉變為成熟活性多肽。如本文所用，「前區」、「前肽(prop印tide) 」或「前序列(pro sequence) 」是指被裂解產生成熟蛋白質的區域或節段。這可以包括通過掩蔽催化機制並因此阻止催化中間物形成(即通過空間位阻底物結合位點)而發揮抑制酶活性功能的節段。前區是位於成熟的生物學活性多肽的氨基末端的胺基酸序列，可以小如幾個胺基酸或者可以是多結構域結構。如本文所用，活化序列是指酶原中為形成活性蛋白酶所需活化裂解或成熟裂解的部位的胺基酸序列。活化序列的裂解可以是自身催化裂解或者通過激活配偶體而裂解。活化裂解是一種成熟裂解，其中發生為活性所需的構象改變。這是一種經典的活化途徑，例如，對於絲氨酸蛋白酶，其中裂解產生新的N末端，其與催化機構的保守區如催化殘基相互作用，誘導為活性所需的構象改變。活化可以導致多鏈形式的蛋白酶產生。在一些情況中，單鏈形式的蛋白酶可呈現與單鏈相同的蛋白酶解活性。如本文所用，結構域是指分子如蛋白質或編碼核酸的一部分，其與所述分子的其它部分在結構上和/或功能上不同，是可鑑別的。如本文所用，蛋白酶結構域是蛋白酶的催化活性部分。提及的蛋白酶的蛋白酶結構域包括任何這些蛋白質的單鏈、雙鏈和多鏈形式。蛋白質的蛋白酶結構域含有所有該蛋白質蛋白酶解活性所需的所有必需性質，例如其催化中心。 如本文所用，蛋白酶的催化活性部分是指保留蛋白酶活性的蛋白酶結構域或其任何片段或一部分。顯然，至少在體外，所述單鏈形式的蛋白酶及其催化結構域或蛋白酶解活性部分(典型C末端截短)呈現蛋白酶活性。如本文所用，「編碼蛋白酶結構域或其催化活性部分的核酸」是指僅編碼所述單鏈蛋白酶結構域或其活性部分而不編碼該蛋白酶其它鄰近部分作為連續序列的核酸。如本文所用，基本上由蛋白酶結構域組成的多肽是指所述多肽的僅一部分是蛋白酶結構域或其催化活性部分。所述多肽可任選及通常包括例外的非蛋白酶衍生的胺基酸序列。如本文所用，「S1-S4」是指形成底物的P1-P4殘基的結合位點的胺基酸殘基(見例如 Schecter and Berger (1967) Biochem Biophys Res Commun27 :157-162)。S1—S4 的每一個均含有1、2或多個殘基，其可以是不連續的。這些位點從是識別位點N末端至蛋白酶解位點相繼編號，稱作易斷裂鍵。如本文所用，術語「P1-P4」和「ΡΓ -P4，」是指底物肽中分別與S1-S4和Si，-S4， 殘基特異性相互作用及被所述蛋白酶裂解的殘基。P1-P4是指位於裂解位點N末端側的殘基位置；ΡΓ -P4』是指位於裂解位點C末端側的殘基位置。胺基酸殘基從多肽底物的N末端至C末端標記(Pi，...，P3，P2，P1，P1'，P2'，P3'，. . .，Pj)。標示出各自的結合亞位點(Si，. . .，S3，S2，Si，Sl'，S2'，S3'，. . .，Sj)。所述裂解是在 Pl 與 P1，之間催化。如本文所用，「結合口袋」是指與底物上一或多個特定胺基酸相互作用的一或多個殘基。「特異性口袋」是較其它口袋提供更多能量的結合口袋(最重要的或者佔優勢的結合口袋)。典型地，所述結合步驟在為發生催化過程必需的過渡狀態形成之前。S1-S4 和Si，-S4』胺基酸組成底物序列結合口袋並通過分別與肽、多肽或蛋白質底物的P1-P4和 ΡΓ-Ρ4』胺基酸相互作用而促進底物識別。蛋白酶是否與底物相互作用是S1-S4和Sl』-S4』 位置中的胺基酸的函數。如果任一或多個31、52、53、54、51，、52，、53，和S4』亞位點中的胺基酸與底物中P1、P2、P3、P4、P1』、P2』、P3』和Ρ4』位點中的任一或多個胺基酸相互作用或識別其，則所述蛋白酶可裂解該底物。結合口袋將靶胺基酸與蛋白酶定位在一起，以便實現肽鍵的催化和底物的裂解。例如，絲氨酸蛋白酶典型識別底物中Ρ4-Ρ2』位點；其它蛋白酶可具有超過Ρ4-Ρ2』的擴展識別。如本文所用，「有助於擴展底物特異性」的胺基酸是指除了特異性口袋之外在活性位點裂縫中的那些殘基。這些胺基酸包括蛋白酶中的S1-S4、S1』 -S4』殘基。如本文所用，相互作用的二級位點在活性位點裂縫之外。這些可有助於底物識別和催化作用。這些胺基酸包括可有助於與底物的第二和第三層相互作用的胺基酸。例如， S1-S4周圍的蛋白酶結構中的環。Si，-S4，胺基酸在底物中定位Ρ1_Ρ4、ΡΓ -Ρ4』胺基酸中起作用，從而指示蛋白酶活性位點中的易斷裂的鍵。如本文所用，蛋白酶的活性位點是指其中發生底物催化作用的底物結合位點。活性位點的結構和化學性質允許識別和結合底物及隨後水解和裂解底物中的易斷裂鍵。蛋白酶的活性位點含有有助於肽裂解的催化機制的胺基酸以及有助於底物序列識別的胺基酸， 如有助於擴展底物結合特異性的胺基酸。如本文所用，絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶的催化三元體(triad)是指絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶的活性位點中的並有助於肽裂解的催化機制的三個胺基酸組合。通常地，催化三元體在絲氨酸蛋白酶中發現，提供了活性親核試劑和酸/鹼催化作用。所述絲氨酸蛋白酶的催化三元體含有三個胺基酸，在糜蛋白酶中是ASp1(l2、HiS57和Ser195。這些殘基對於絲氨酸蛋白酶的催化效力是關鍵的。如本文所用，「底物識別位點」或「裂解序列」是指由蛋白酶裂解的蛋白酶的活性位點識別的序列。典型地，例如對於絲氨酸蛋白酶而言，裂解序列由底物中的P1-P4和 ΡΓ-Ρ4』胺基酸組成，其中在Pl位置後發生裂解。典型地，絲氨酸蛋白酶的裂解序列的長度為6個殘基以匹配許多蛋白酶的擴展的底物特異性，但是根據蛋白酶而可以更長或較短。 例如，為自身催化所需的MT-SPl的底物識別位點或裂解序列是RQARVV，其中R在P4位置，Q 在P3位置，A在P2位置，R在Pl位置。MT-SPl中的裂解發生在位置R後，後面是序列VVGG。如本文所用，靶底物是指由蛋白酶裂解的底物。典型地，靶底物是由蛋白酶在其底物識別位點裂解。靶底物最低限度地包括組成裂解序列的胺基酸。任選地，靶底物包括含有所述裂解序列及任何其它胺基酸的肽。含有蛋白酶識別的裂解序列的全長蛋白質、其等位基因變體、同工型或其任何部分是該蛋白酶的靶底物。例如，對於本發明補體失活之目的而言，靶底物是含有由蛋白酶識別的裂解序列的任一或多種如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、 30,40或更多種補體蛋白，或者其任何部分或片段。這種靶底物可以是純化的蛋白質，或者可以存在於混合物中，如在體外的混合物或在體內的混合物。混合物可包括例如血液或血清或者其它組織液。另外，靶底物包括含有不影響蛋白酶對底物的裂解的其它部分的肽或蛋白質。例如，靶底物可包括與螢光部分連接的四個胺基酸的肽或者全長蛋白質。所述蛋白酶可以被修飾為呈現對於靶底物的更高的底物特異性。
如本文所用，裂解是指蛋白酶對肽鍵的破壞。蛋白酶的裂解位點基序包括易斷裂鍵的N和C末端殘基(分別為imprimed和primed側，蛋白酶的裂解位點稱作...P3-P2-P1-P1' -P2' -P3'...，裂解在Pl與P1，殘基之間發生)。典型地，底物的裂解是活化裂解或抑制性裂解。活化裂解是指多肽從無活性形式至活性形式的裂解。這種裂解包括例如酶原至活性酶的裂解，和/或前生長因子至活性生長因子的裂解。例如，MT-SPl 可以通過在RQAR的P1-P4序列裂解靶底物而自身激活。活化裂解也是其中蛋白質被裂解為一或多個自身具有活性的蛋白質的裂解。例如，補體系統是不可逆的蛋白酶解事件級聯，其最終導致刺激炎症、促進抗原吞噬作用及直接裂解一些細胞的多種效應物分子的形成。因此，C3由轉變酶裂解為C3a和Ob是活化裂解。如本文所用，抑制性裂解是蛋白質裂解為一或多個無功能的降解產物的裂解。抑制性裂解導致蛋白質活性的降低或減少。典型地，蛋白質活性的降低減少了該蛋白質參與的途徑或過程。在一個實例中，是抑制性裂解的任一或多種補體蛋白的裂解導致補體的經典途徑、凝集素途徑或旁路功能性途徑的任一或多種途徑的伴隨減少或抑制。抑制性是指與天然形式的蛋白質相比，所述裂解使得活性降低至少大約10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、 60%,70%,80%,90%,95%,99. 9%或更高。為抑制性裂解所需的蛋白質裂解百分比根據蛋白質而不同，但是可以通過分析蛋白質的活性而確定。如本文所用，裂解VEGF或VEGFR的蛋白酶是指經修飾為裂解VEGF或VEGFR或者以其天然形式裂解VEGF或VEGFR的蛋白酶，從而降低或者失活VEGF或VEGFR複合物的信號化，特別是可以表明如血管發生、特別是不希望的血管發生的生物學作用的細胞增殖信號化。VEGF或VEGFR由蛋白酶的裂解可以通過使用本領域技術人員已知的評價VEGF或VEGFR 功能的方法和檢驗分析VEGF或VEGFR的活性而確定。如本文所用，不裂解VEGF或VEGFR的蛋白酶(修飾或未修飾的)是指不降低或失活VEGF或VEGFR複合物的信號化的蛋白酶。特別地，在本文中所述蛋白酶與含有相應裂解序列(即RRVR)的VEGF或VEGFR蛋白或者肽底物相比具有對於靶底物(即補體蛋白)更高的底物特異性或活性，例如大約1倍、1. 5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、 300倍、400倍或更高倍數。對於本發明，補體蛋白與VEGF或VEGFR蛋白或肽底物的裂解對比是在與蛋白酶裂解補體蛋白的相同反應條件下進行。如本文所用，「支架」或「蛋白酶支架」是指可以加以修飾以改變其靶特異性的原型蛋白酶。支架包括野生型蛋白酶，其等位基因變體和同工型。它們可以作為修飾的起始物， 以產生具有靶向特異性的蛋白酶。如本文所用，「修飾的蛋白質」或者「突變蛋白酶」是指與支架蛋白酶相比在一級序列中具有一或多個修飾的蛋白酶多肽(蛋白質)。所述一或多個突變可以是一或多個胺基酸置換(取代)、插入、缺失及其任何組合。修飾的蛋白酶多肽包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個修飾位置的那些蛋白酶。修飾的蛋白酶可以是全長支架蛋白酶，或者可以是修飾的全長支架蛋白酶的催化活性部分以及在改變蛋白酶活性或底物特異性區域含有修飾的蛋白酶及所述蛋白酶是蛋白酶解活性的。通常地，這些突變改變了支架蛋白酶裂解任一或多個補體蛋白的特異性和活性。除了含有改變蛋白酶的底物特異性的區域中的修飾之外，修飾的蛋白酶也可容許為蛋白酶的底物特異性非必需的區域中的其它修飾。因此，修飾的蛋白酶與相應的野生型或支架蛋白酶的胺基酸序列典型具有 60%,70%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 更高的序列相同性。修飾的蛋白酶的修飾的全長蛋白酶或其催化活性部分可包括作為融合蛋白的蛋白酶，只要所述融合自身不改變蛋白酶的底物特異性即可。如本文所用，糜蛋白酶編號是指SEQ ID NO :8所示成熟糜蛋白酶多肽的胺基酸編號。可以用糜蛋白酶產生另一種蛋白酶的蛋白酶結構域排列，例如MT-SPl蛋白酶結構域。 在這種情況中，相應於糜蛋白酶的胺基酸的MT-SPl胺基酸並給予糜蛋白酶胺基酸的編號。 本領域技術人員使用人工排列或者使用眾多可利用的排列程序(例如BLASTP)通過這種排列可以確定相應位置。相應位置也可以基於結構排列，例如使用蛋白質結構的計算機模擬排列。相應於揭示的序列中的胺基酸的多肽的胺基酸是指基於使用標準排列算法如GAP算法，排列具有所述揭示的序列的多肽以最大化相同性或同源性(其中排列對比保守的胺基酸)時鑑別的胺基酸。例如，基於MT-SPl (SEQ ID NO=IO)絲氨酸蛋白酶結構域與成熟糜蛋白酶的排列對比，在MT-SPl中第1位的V在糜蛋白酶中編號為V16。由此對隨後的胺基酸進行編號。在一個實例中，在全長MT-SPl (SEQ ID NO : 第708胺基酸位置或者在MT-SPl (SEQ ID NO 10)的蛋白酶結構域的第94位置的的F基於糜蛋白酶編號相應於F99。在一個殘基在蛋白酶中存在而在糜蛋白酶中不存在的情況中，所述胺基酸殘基以字母符號表示。例如， 糜蛋白酶中是具有第60位(基於糜蛋白酶編號)胺基酸的環的一部分但插入MT-SPl序列中的殘基例如稱作Asp60b或Arg60c。如本文所用，「抑制補體激活」或者「補體失活」是指通過蛋白酶減少或降低任一或多個補體途徑補體介導的功能或活性，或者補體途徑中任何蛋白質的活性減少和降低。補體的功能或活性可以在體外或體內發生。在本文可以檢驗和描述的補體的功能的例子包括溶血反應及測量任一或多種補體效應物分子的檢驗，如通過SDS PAGE及隨後的Wfestern印跡或者考馬斯亮藍染色或者通過ELISA進行。蛋白酶可以抑制補體激活S^UO^JO^、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在其它實施方案中，與不存在蛋白酶的條件下補體的活性相比，補體激活被蛋白酶抑制40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、85 %、90 %、 95%或 99. 9%o如本文所用，對於靶底物的特異性是指蛋白酶對於靶底物較另一底物(非靶底物)優先裂解。特異性以特異性常數表示(k。at/Km)，，是蛋白酶對於其底物的親和性和該酶的效力的一種測量標準。如本文所用，裂解的特異性常數為(k。at/Km)，其中Km是Michaelis-Menton常數 (一半Vfflax時的[S])，kcat是Vfflax/ [Ετ]，，其中Et是最終酶濃度。參數kcat、Kffl和kcat/Km可以根據底物濃度倒數相對於底物裂解速度倒數的曲線圖計算，擬合為Lineweaver-Burk等式 (1/速率=(Km/Vmax)(l/[S])+1/Vmax ；其中Vmax= [ET]k。at)。可以使用確定在存在不同濃度底物的條件下隨著時間出現的裂解增加的速度的任何方法計算特異性常數。例如，將底物與基於蛋白酶裂解而被釋放的螢光部分連接。通過確定在不同酶濃度下裂解的速度，可以對於特定的蛋白酶確定k。at。特異性常數可用於確定蛋白酶的任一或多個S1-S4 口袋中的胺基酸較底物中伴隨的P1-P4胺基酸的位點特異性優選性，這使用本領域標準方法進行， 如位置掃描組合庫(positional scanning combinatorial library，PS-SCL)。另外，特異性常數也可以用於確定蛋白酶對於一種底物相對於另一底物的優選性。如本文所用，底物特異性是指蛋白酶對於一種底物相對於另一底物的優選性。底物特異性可以作為特異性常數的比率(ration)進行測量。如本文所用，底物特異性比率是特異性常數的比率，可用於比較兩或多種蛋白酶或者蛋白酶對於兩或多種底物的特異性。例如，蛋白酶對於競爭底物的底物特異性或者競爭蛋白酶對於底物的底物特異性可以通過比較k。at/Km而進行對比。例如，對於靶底物具有 2X106M-1sec-1特異性常數及對於非靶底物具有ZXlO^sec—1特異性常數的蛋白酶對於所述靶底物更具特異性。使用上述特異性常數，所述蛋白酶對於靶蛋白酶具有100的底物特異性比率。如本文所用，對於靶底物的優選性或底物特異性可以底物特異性比率表示。反映優選性的特定比值是底物與有爭議的蛋白酶的函數。大於1的底物特異性比率表示對於靶底物的優選性，底物特異性小於1表示對於非靶底物的優選性。通常地，至少或大約為1的比率反映被考慮作為候選治療劑的蛋白酶的顯著差異。如本文所用，改變的特異性是指與起始的支架蛋白酶相比，修飾的蛋白酶的底物特異性的改變。通常地，特異性的改變反映與支架蛋白酶的野生型底物(在本文稱作非靶底物)相比，修飾的蛋白酶對於靶底物的優選性的改變。典型地，本發明提供的修飾的蛋白酶與支架蛋白酶的底物特異性相比呈現對於任一或多種補體蛋白的底物特異性增加。例如，對於靶底物和非靶底物的底物特異性比率為100的修飾的蛋白酶與底物特異性比率為 10的支架蛋白酶相比呈現特異性增加10倍。在另一個實例中，底物特異性比率為1的修飾的蛋白酶與比率為0.1的相比呈現底物特異性增加10倍。為與支架蛋白酶相比呈現增加的特異性，修飾的蛋白酶對於任一或多種補體蛋白具有1. 5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100 倍、200倍、300倍、400倍、500倍或更高的底物特異性。如本文所用，當描述蛋白酶從競爭底物的混合物中選擇及裂解一種靶底物時，「選擇性」可以與特異性互換應用。可以確定蛋白酶對於一種靶底物較任何其它一或多種靶底物的選擇性增加，例如通過比較蛋白酶對靶底物裂解的特異性常數而確定。例如，如果蛋白酶對於一種靶底物的裂解特異性常數為ZXlO6M-1Sec-1及對於任何其它一種底物的特異性常數為ZXlOfbec—1，則所述蛋白酶對於前者靶底物更具選擇性。如本文所用，活性是指與全長(競爭)蛋白質相關的多肽或其一部分的功能活性或活性。功能活性包括但非限於生物學活性、催化或酶活性、抗原性(結合或與多肽競爭抗多肽抗體結合的能力)、免疫原性、形成多聚體的能力，及特異性結合多肽的受體或配體的能力。如本文所用，補體蛋白的功能活性是指補體介導的功能，包括但非限於過敏反應、 調理作用、趨化性或者細胞裂解。檢測補體活性的非限制性的檢驗方法包括紅細胞溶血反應，及通過ELISA或SDS-PAGE檢測補體效應物分子。如本文所用，催化活性或裂解活性是指檢測選擇的底物的蛋白酶解的體外蛋白酶解分析中評價的蛋白酶活性。裂解活性可以通過評價蛋白酶的催化效力而測定。如本文所用，對於靶底物的活性是指蛋白酶對於靶底物的裂解活性和/或功能活性，或者反應蛋白酶活性的其它測量法。蛋白酶對於補體蛋白靶底物的功能活性可以通過在補體分析中評價IC50而測量，所述補體分析例如是紅細胞裂解反應或者本領域技術人員已知的或者本發明提供的評價補體活性的其它這種分析。裂解活性可以通過評價蛋白酶的催化效力而測量。對於本發明而言，如果與不存在所述蛋白酶的條件下相比，蛋白酶呈現較高的蛋白酶解或裂解靶底物活性和/或調節(即激活或抑制)補體蛋白的功能活性，則表示活性增加。如本文所用，絲氨酸蛋白酶或絲氨酸內肽酶是指一類肽酶，其特徵在於在所述酶的活性中心存在絲氨酸殘基。絲氨酸蛋白酶參與機體多種功能，包括凝血和炎症，以及在原核生物和真核生物中作為消化酶。絲氨酸蛋白酶的裂解機制基於絲氨酸對靶向的肽鍵的親核攻擊。半胱氨酸、蘇氨酸或與天冬氨酸或金屬結合的水分子也可發揮這種作用。絲氨酸、 組氨酸和天冬氨酸的側鏈排列在一起形成大多數絲氨酸蛋白酶共有的催化三元體。絲氨酸蛋白酶的活性位點形成所述多肽底物結合的裂縫。如本文所用，補體蛋白酶是指參與任何途徑途徑中補體級聯反應的產生和擴大的蛋白酶。這些蛋白酶包括絲氨酸蛋白酶因子I、因子D、MBL-相關絲氨酸蛋白酶(MASP)-2、 MASP-U Cls, Clr、因子B、C2及轉變酶，及在補體途徑中出現的影響補體激活的任何其它蛋白酶。特別地，補體蛋白酶是任何未修飾的補體蛋白酶，包括因子I、因子D、MASP-2、 MASP-l、Cls、Clr、因子 B 和 C2。如本文所用，非補體蛋白酶是任一或多個補體途徑中非正常一部分的任何蛋白酶。如本文所用，MT-SPl是指絲氨酸蛋白酶，基於kr、His和Lys活性位點殘基的位置是絲氨酸蛋白酶的Sl肽酶家族的一部分(也含有胰蛋白酶和糜蛋白酶)。MT-SPl特徵在於一個跨膜結構域、兩個CUB結構域、四個LDLR重複及一個絲氨酸蛋白酶結構域(或肽酶Sl結構域)，所述絲氨酸蛋白酶結構域在絲氨酸蛋白酶的肽酶Sl家族的所有成員中是高度保守的，例如糜蛋白酶。示例的MT-SPl的序列示於SEQ ID NO :2。所述蛋白酶結構域在第615-邪4位胺基酸之間發生。MT-SPl蛋白酶包括全長MT-SPl或其任何催化活性部分，包括等位基因變體和物種變體及由剪接變體編碼的變體。MT-SPl蛋白酶作為單鏈酶原及作為激活的雙鏈多肽發生。所述MT-SPl包括其活性的單鏈和雙鏈形式。特別感興趣的是哺乳動物包括人源的 MT-SPl蛋白酶。MT-SPl蛋白酶也可包括大鼠或小鼠來源的那些。本領域技術人員通常意識到多肽的非必需區域中的單一胺基酸取代基本上不改變生物學活性(見例如Watson et al. Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987, The Benjamin/Cummings Pub. CO.，p. 224)。人源MT-SPl蛋白酶和/或其催化活性結構域的編碼核酸分子的序列及編碼的胺基酸序列示於SEQ ID N0:l、2、9和10。非人源的MT-SPl多肽是具有如小鼠(Mus musculus，SEQ ID NO :449)禾口大鼠(Rattus norvegicus, SEQ ID NO :450)中氛基酸序列的那些多肽。在本發明中，MT-SPl蛋白酶可以是支架MT-SP1。如本文所用，MT-SPl蛋白酶的「催化活性部分」是指保留蛋白酶活性的蛋白酶結構域或者其任何片段或一部分。例如MT-SPl的催化活性部分可以是MT-SPl蛋白酶結構域， 包括分離的單鏈形式蛋白酶結構域或活化的雙鏈形式。如本文所用，修飾的MT-SPl蛋白酶是指與支架或未修飾的形式相比呈現改變的活性如改變的底物特異性的蛋白酶。這種蛋白酶與支架MT-SPl相比包括1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個修飾(即胺基酸變化)，由此MT-SP1蛋白酶裂解補體蛋白的活性如底物特異性或選擇性被改變。修飾的MT-SPl可以是全長支架 MT-SP1，或者可以是全長支架蛋白酶的一部分，只要所述修飾的蛋白酶在一些區域中含有改變所述蛋白酶的活性或底物特異性的修飾及所述蛋白酶是蛋白酶解活性的即可。修飾的MT-SPl蛋白酶也可以在一些區域中包括不影響所述蛋白酶的底物特異性的其它修飾。 因此，修飾的MT-SPl蛋白酶典型地與野生型或支架MT-SPl的相應胺基酸序列具有60%、 70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列相同性。修飾的全長MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分可包括是融合蛋白的蛋白酶，只要所述融合蛋白具有所述靶特異性即可。如本文所用，人蛋白質是由人基因組中存在的核酸分子如DNA編碼的一種蛋白質，包括其所有等位基因變體和保守變體。如果所述修飾基於人蛋白質的野生型或主流 (prominent)序列，則蛋白質的變體或修飾物是一種人蛋白質。如本文所用，天然發生的α-胺基酸的殘基是自然發現的那些20種α-胺基酸的殘基，通過具有其人體中同源mRNA密碼子的荷電的tRNA分子的特異性識別而被摻入蛋白質中。如本文所用，非天然發生的胺基酸是指不是遺傳編碼的胺基酸。如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其類似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是單鏈或雙鏈的。當是指探針或引物時，其任選被標記，如用可檢測的標記物如螢光或放射性標記物標記，預期是單鏈分子。這種分子典型是其靶位在統計學上是唯一的這樣的長度或者拷貝數較低(典型為少於5個，通常少於3個)以探查或引發(priming)文庫。 探針和引物通常含有與感興趣的基因互補或相同的至少14、16或30個連續核苷酸的序列。 探針和引物的長度可以是10、20、30、50、100或更多個核酸。如本文所用，肽是指長度為2至40個胺基酸的多肽。如本文所用，在本發明提供的各個胺基酸序列中出現的胺基酸根據其已知的三個字母或一個字母的縮寫標示(表1)。在各個核酸片段中出現的核苷酸根據本領域通用的標準單字母命名法命名。如本文所用，「胺基酸」是含有氨基基團和羧酸基團的一種有機化合物。多肽含有兩或多個胺基酸。對於本發明而言，胺基酸包括20種天然發生的胺基酸、非天然胺基酸及胺基酸類似物(即其中α-碳具有側鏈的胺基酸)。如本文所用，在本文出現的各個胺基酸序列中出現的「胺基酸」是根據其熟知的三字母或單字母縮寫標示的(見表1)。在各個DNA片段中出現的核苷酸以本領域通用的標準單字母命名法命名。如本文所用，「胺基酸殘基」是指基於多肽在其肽鍵處的化學消化(水解)而形成的胺基酸。本文描述的胺基酸殘基假定是「L」異構體形式。也如此命名的「D」異構體形式的殘基可以取代任何L-胺基酸殘基，只要保留所述多肽希望的功能性質即可。NH2是指在多肽的氨基末端存在的游離氨基基團。COOH是指在多肽的羧基末端存在的游離羧基基團。 與 J. Biol. Chem.，243 :3552-3559(1969)及採用的 37 C. F. R. § § 1. 821-1. 822 中描述的標準多肽命名法一致，胺基酸殘基的縮寫示於表1。表1-對應表
權利要求
1.修飾的非補體蛋白酶或其催化活性部分在製備調節補體激活的藥物中的應用，其中所述非補體蛋白酶或其催化活性部分與未修飾的或者支架蛋白酶相比包含胺基酸修飾；所述修飾的一或多個胺基酸殘基使得對於靶底物的特異性增加或對於靶底物的活性增加或者這二者增加，其中所述靶底物是補體蛋白，以及所述非補體蛋白酶或其催化活性部分當與補體途徑的任一或多個靶底物接觸時，導致所述靶底物蛋白的裂解，由此包含所述靶底物的途徑的補體激活被改變。
2.一種藥物組合物，其包含用於調節補體激活的修飾的非補體蛋白酶或其催化活性部分，其中所述非補體蛋白酶或其催化活性部分與未修飾的或者支架蛋白酶相比包含胺基酸修飾；所述修飾的一或多個胺基酸殘基使得對於靶底物的特異性增加或對於靶底物的活性增加或者這二者增加，其中所述靶底物是補體蛋白，以及所述非補體蛋白酶或其催化活性部分當與補體途徑的任一或多個靶底物接觸時，導致所述靶底物蛋白的裂解，由此包含所述靶底物的途徑的補體激活被改變。
3.權利要求1或2的藥物組合物或應用，其中補體激活被抑制。
4.權利要求1-3任一項的藥物組合物或應用，其中所述非補體蛋白酶與補體途徑的任一或多個靶底物的接觸在體外、體內或離體發生。
5.權利要求1-4任一項的藥物組合物或應用，其中所述補體途徑選自補體的經典途徑、旁路途徑和凝集素途徑的一個或多個。
6.權利要求1-5任一項的藥物組合物或應用，其中所述靶底物是如下任一或多種 Clq、C2、C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL,因子 B、因子 D、因子 P、MASP-1、MASP-2、 Clr、Cls、C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba、Bb 和纖維膠凝蛋白。
7.權利要求1-6任一項的藥物組合物或應用，其中所述靶底物包含如下任一個胺基酸序列或者包含所述胺基酸序列的呈現補體活性的片段SEQ ID NO :298,299,300,302,304, 305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、326、328、330、332、334、 335、338、340、344 和 660-662。
8.權利要求1-7任一項的藥物組合物或應用，其中所述未修飾的或支架蛋白酶是絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶中的任一種。
9.權利要求1-8任一項的藥物組合物或應用，其中所述未修飾的或支架蛋白酶選自粒酶B、粒酶A、粒酶M、組織蛋白酶G、MT-SP1、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶、糜酶、α-類胰蛋白酶、β-類胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、膠原酶、因子XII、因子XI、因子CII、因子X、凝血酶、 蛋白質C、U-纖溶酶原激活物(u-PA)、t-纖解酶原激活物(t-PA)、纖溶酶、血漿激肽釋放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶、克魯蛋白酶、金屬蛋白酶及其等位基因變體、同工型和催化活性部分。
10.權利要求1-9任一項的藥物組合物或應用，其中所述支架蛋白酶包含如下任一個胺基酸序列或其催化活性部分:SEQ ID NO :2、4、8、77、79、83、85、87、89、93、99、117、119、 121、123、132、134、138、142、144、146、148、162、166、168、170、172、174、176、178、180、182、·190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、218、220、222、224、226、238、248、250、260、 262、280、282、373、375、377、379、381、383、385、387、547、549 和 551。
11.權利要求9的藥物組合物或應用，其中所述支架蛋白酶是MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分。
12.權利要求11的藥物組合物或應用，其中MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分包含SEQ ID NO 2或10所示的胺基酸序列或是其等位基因或物種變體。
13.權利要求11或12的藥物組合物或應用，其中所述靶底物是C2或C3。
14.權利要求11-13任一項的藥物組合物或應用，其中所述MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分中的一或多個修飾選自在選自基於糜蛋白酶編號的41、97、146、151、192和2M位置的位置上具有修飾的蛋白酶。
15.權利要求11-14任一項的藥物組合物或應用，其中所述MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分中的多個修飾在有助於擴展的底物特異性或者相互作用的二級位點的任一或多個胺基酸中。
16.權利要求11-15任一項的藥物組合物或應用，其中所述MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分包含選自如下的修飾I41T、Ι41Α、I41F、I41D、Ι41Ε、R60cD、R60cW、D96A、D96V、 D96F、D96F、D96S、D96T、F97D、F97E、F97A、F97W、F99A、F99S、F99G、F99Y、F99V、F99W、H143V、 Y146N、Y146D、Y146F、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、G147E、G151L、L172N, Q174H、Q174A、 Q174V、Q174F、Q174R、Q174K、Q174L、Q174Y、Q175D、Q175E、Q175H、Q175L、Q175F、Q175W、 Q175Y、Q175R、Q175K、M180E、Q192A、Q192F、Q192L、Q192I、Q192E、Q192K、Q192Y、Q192R、 Q192V、W215F、W215Y、D217A、D217F、D217V、D217Q、D217N、D217H、Q221aD、Q221aL、Q221aE、 K224A、K224L、K224R、K224N、K224T、K224Y、K224S 和 K224F。
17.權利要求11-16任一項的藥物組合物或應用，其中所述MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分包含選自如下的基於糜蛋白酶編號的多個修飾Y146D/K2MF、Y146E/K224N, I41T/ Y146E/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/K224F、 I41T/Y146E/Q175D/K224N、 I41T/Y146E/G151L/ Q175D/K224L、Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/ Q175D/K224N、Y146E/K224R、Y146E/Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/ K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/K224L、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、 Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/K224A、Y146D/Q175H/ K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q221aL/K224S、 I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、 Y146E/K224T、 I41T/Y146E/K224L、 I41F/Y146D/K224F、 I41L/Y146D/K224F、 I41T/Y146D/ G151L/K224F、 I41A/Y146D/K224F、 I41E/Y146D/K224F、 I41D/Y146D/K224L、 I41D/Y146D/ K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/ K224F、 I41T/Y146D/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/Q175D/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/G151L/ Q175D/K224R、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、 I41T/Y146E/Q175D/K224F、 I41T/Y146E/ Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/ Q175R/K224N, Y146D/Q175K/K224N, Y146D/Q175H/K224N, I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F, I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、 I41T/ Y146D/G151L/Q175H/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N、 I41T/Y146D/K224N、 Y146D/ K224N 和 I41T/Y146D/K224L。
18.權利要求11-17任一項的藥物組合物或應用，其中所述修飾的MT-SPl蛋白酶具有 SEQ ID NO :12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40-69、404-418、419-447、 524-533、552-659或663-710任一所示的胺基酸序列。
19.權利要求11-18任一項的藥物組合物或應用，其中MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分中的一或多個修飾是Y146D/K2MF或Y146E。
20.權利要求19的藥物組合物或應用，其中所述修飾的MT-SPl多肽具有SEQID NO 596或650所示的胺基酸序列。
21.權利要求11-20任一項的藥物組合物或應用，其中所述MT-SPl蛋白酶在底物識別位點裂解靶底物。
22.權利要求21的藥物組合物或應用，其中所述靶底物是C2或C3。
23.權利要求22的藥物組合物或應用，其中靶底物是C2，所述底物識別位點包括胺基酸序列 SLGR (SEQ ID NO :392)。
24.權利要求1-15任一項的藥物組合物或應用，其中調節補體激活實現對患有補體介導病變的對象的治療。
25.權利要求對的藥物組合物或應用，其中補體激活的抑制導致與補體介導病變相關的炎症症狀減少，所述補體介導病變選自炎症性疾病、神經變性疾病及心血管疾病。
26.權利要求25的藥物組合物或應用，其中所述補體介導病變選自膿毒症、類風溼性關節炎(RA)、膜性增生性腎小球腎炎(MPGN)、多發性硬化(MS)、重症肌無力(MG)、哮喘、炎症性腸病、免疫複合物(IC)-介導的急性炎症性組織損傷、阿爾茨海默病(AD)、缺血-再灌注損傷及Guillan-Barre症候群。
27.權利要求沈的藥物組合物或應用，其中所述缺血-再灌注損傷是由於選自如下的事件或治療所致心肌梗塞(Ml)、中風、血管成形術、冠狀動脈旁路搭橋術、心肺轉流術 (CPB)及血液透析。
28.權利要求M-27任一項的藥物組合物或應用，其中所述非補體蛋白酶或其催化活性部分與治療補體介導病變的另一種藥物組合配製用於施用。
29.權利要求觀的藥物組合物或應用，其中所述另一種藥物是抗炎劑或抗凝劑。
30.權利要求四的藥物組合物或應用，其中所述另一種藥物選自如下任一或多種 NSAID、抗代謝藥、皮質類固醇、鎮痛藥、胞毒劑、促炎細胞因子抑制劑、抗炎細胞因子、B細胞靶向劑、靶向T抗原的化合物、粘附分子阻斷劑、趨化因子受體拮抗劑、激酶抑制劑、 PPAR-Y配體、補體抑制劑、肝素、華法林、醋硝香豆素、苯茚二酮、EDTA、檸檬酸鹽、草酸鹽、 阿加曲班、來匹盧定、比伐盧定和希美加群。
全文摘要
本發明提供了調節補體系統的方法和化合物。特別地，本發明提供了抑制補體激活的化合物及促進補體激活的化合物。所述化合物通過其對補體系統的作用而是治療劑。因此，抑制補體激活的化合物可用於治療缺血-再灌注疾病，包括心肌梗塞和中風、膿毒症、自身免疫疾病、炎症疾病及具有炎症成分的疾病，包括阿爾茨海默病及其它神經變性疾病。
文檔編號A61P11/06GK102430117SQ20111032728
公開日2012年5月2日 申請日期2006年10月20日 優先權日2005年10月21日
發明者C·D·塔諾斯, E·L·麥迪遜, J·阮, S·W·拉格爾斯 申請人:催化劑生物科學公司