製備發酵產物和逆境抗性微生物的方法

2023-05-23 21:10:31

專利名稱：製備發酵產物和逆境抗性微生物的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備發酵產物的方法。具體地說，本發明涉及一種使用微生物來發酵製備一種有用物質如一種胺基酸的方法以及一種對抑制其生長和/或發酵產物生產的逆境具有抗性的微生物。
當細胞處於逆境如高溫、高滲透壓、代謝抑制、重金屬存在和病毒感染時，就會在短時間內誘導合成一組被稱為「熱休克蛋白」(以下簡稱「HSP」)的蛋白，來產生對逆境的防禦反應。這些HSP在廣泛的原核細胞和真核細胞中具有同源性，它們大致被分為幾個族，如HSP60、HSP70、HSP90、TRiC和其他族(Hendrick，J.P.和Hartl，F.-V.《生物化學年鑑》62卷，349-384頁(1993))。
HSP提供逆境抗性的機制是基於HSP形成蛋白高級結構(蛋白摺疊)的功能。也就是說，HSP能夠與因逆境而變性變得無法形成正確的高級結構的蛋白結合，通過將其摺疊成正確的高級結構而恢復該蛋白的正常功能。
由於已經清楚，HSP在蛋白高級結構形成中的這種功能，不僅在變性蛋白中而且也在正常細胞中的蛋白裝配、跨膜運輸等中作為分子伴侶。因此其重要性已被人們認識，並且吸引了人們的注意(E1lis，R.J.等《科學》250卷，954-959頁(1990))。「伴侶」一詞意指一種支持者，被給予這個名稱是因為HSP通過與不同的蛋白結合來發揮其功能。
當細胞處於上面提到的逆境中時，HSP的表達被誘導。這種誘導通常是暫時的。它很快減弱並達到一種新的穩定狀態。已經發現HSP的這種誘導發生在轉錄水平(Cowing，D.C.等，《美國科學院院報》80卷，2679-2683頁，(1995)；Zhou，Y.N.等《細菌學雜誌》170卷，3640-3649頁，(1988))。已經知道，一組HSP基因共同具有一種被稱為熱休克啟動子的啟動子結構，並且存在一種特異性地作用於這種熱休克啟動子的因子---σ-32(σ32)。還已經知道，σ32由rpoH基因編碼，σ32是一種半衰期非常短(約1分鐘)的蛋白質，並與HSP的短暫誘導密切相關(Straus，D.B.等，《自然》329卷，348-351頁，(1987))。σ32自身的表達控制已經顯示在轉錄水平和翻譯水平完成，但其主要的控制在翻譯水平完成。
熱休克對HSP的誘導是基於兩種機制，即增加σ32的合成數量和穩定性。在這些機制中，就σ32合成數量的增加而言，已經搞清楚熱修飾的σ32mRNA結構增強其翻譯(Yura，T等，《微生物學年鑑》47卷，321-350頁，(1993))。就σ32的穩定性而言，已經表明有一種HSP(DnaK等)參與σ32的解離，並且據認為是受到HSP作用的反饋控制(Tilly，K.等，《細胞》34卷，641-646頁，(1983)；Liberk和K.，《美國科學院院報》89卷，3516-3520頁，(1984))。
就大腸桿菌(E.coli)而言，已經知道在逆境存在時HSP與細胞生長的關係(Meury，J.等，《FEMS微生物學通訊》113卷，93-100頁(1993))。並且已經知道dnaK和groE分別影響人生長激素的產生和原膠原酶的分泌。(Hockney，R.C.《生物技術動向》12卷，456頁(1994))。
國際公開NO.WO96/26289介紹了通過將至少一個編碼一種HSP的基因和一個編碼一種特異性作用於一種HSP的σ因子的基因導入一種微生物以增加一種HSP的表達數量，來使該微生物獲得對抑制微生物生長和/或發酵產物生產的逆境的抗性。
本發明的目的是，在發酵生產一種有用的物質如一種胺基酸時，通過降低抑制微生物生長和/或發酵產物生產的逆境影響來進一步提高發酵產物的生產率和產量。
本發明的發明者進行研究來完成上述目標。結果為，他們發現，通過將一個來自極端嗜熱古細菌菌株KOD-1的編碼HSP的基因導入一種微生物來表達HSP，能在一種高逆境環境下使生產率和生長進一步提高，至此完成本發明。
這樣，本發明提供了一種利用一種微生物來生產一種發酵產物的方法，該方法包括，在一種培養基中培養該微生物，來在培養物中生產和積累該發酵物，並收集發酵產物，其中該微生物通過導入一種編碼熱休克蛋白的基因來在該微生物的細胞中表達一種來自極端嗜熱古細菌菌株KOD-1的熱休克蛋白。
本發明還提供一種能產生一種發酵產物的微生物，該微生物通過導入一種編碼熱休克蛋白的基因來在該微生物的細胞中表達一種來自極端嗜熱古細菌菌株KOD-1的熱休克蛋白。
在上面提到的本發明的方法和微生物中，發酵產物可以是，例如，一種胺基酸如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-穀氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-苯丙氨酸；一種核酸或一種核苷如鳥苷酸、肌苷和肌苷酸；一種維生素；一種抗生素等，優選是一種胺基酸。
至於本發明可以應用的微生物，可以是屬於埃希氏菌屬的細菌和棒狀桿菌。
根據本發明，在發酵生產有用的物質如胺基酸時，逆境的影響可進一步減少，生產率和產量可進一步提高。


圖1是表示質粒pMWcpkB的構建示意圖。
以下對本發明作詳細解釋。
本發明能應用的發酵產物沒有特別的限制，只要其能用一種微生物發酵生產。其例子包括那些由微生物生產的發酵產物。例如各種胺基酸如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-穀氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-苯丙氨酸；核酸或核苷如鳥苷酸、肌苷和肌苷酸；維生素；抗生素等。而且本發明甚至可用於目前不是由微生物生產的物質，一旦這種物質按照遺傳重組或類似技術能夠用微生物進行生產時，就可應用本發明。在上面提到的物質中，本發明的方法可適用於在一種培養基中分泌和積累、並因而增加培養基的滲透壓的物質，尤其是如胺基酸。
用來通過導入一個編碼HSP的基因來在其細胞中表達衍生自極端嗜熱古細菌菌株KOD-1的HSP的微生物並沒有特別的限制，只要它能通過發酵生產一種發酵產物。其例子包括那些常規用於發酵生產的微生物，例如屬於埃希氏菌屬的細菌、棒狀桿菌、屬於芽孢桿菌屬的細菌、屬於沙雷氏菌屬的細菌等。該微生物優選是這樣一種微生物，獲得了含有質粒所需的複製區域的DNA片段、在該微生物中上面提到的HSP基因具有功能、並且該基因的拷貝數能夠增加。前面提到的棒狀桿菌是指《伯傑氏細菌學鑑定手冊》第8版，599頁(1974)中定義的細菌種類，它們包括屬於棒狀桿菌屬的細菌、屬於以前歸於短桿菌屬但現在歸於棒狀桿菌屬的短桿菌屬的細菌、以及屬於與屬於棒狀桿菌屬的細菌相近的短桿菌屬的細菌。
具體地說，上面所提到的這種微生物可以是大腸桿菌VKPM B-3996(RIA1867，見美國專利NO.5,175,107)、嗜乙醯乙酸棒桿菌AJ12318(FERM BP-1172，見美國專利NO.5,188,949)或其他生產L-蘇氨酸的細菌；大腸桿菌A.J1442(NRRL B-12185和FERM BP-1543，見美國專利NO.4,346,170)、大腸桿菌W3110(tyrA)(該菌株可通過從大腸桿菌W3110(tyrA)/pHATerm(FERM BP-3653)中去除質粒pHATerm來獲得，見國際公開NO.WO95/16042)、乳發酵短桿菌AJ12435(FERM BP-2294，見美國專利NO.5,304,476)、乳發酵短桿菌AJ3990(ATCC 31269，見美國專利NO.4,066,501)、或其他生產L-賴氨酸的菌株；大腸桿菌AJ12624(FERM BP-3853，見法國專利公開NO.2,680,178)、乳發酵短桿菌AJ12821(FERM BP-4172，見日本專利申請公開NO.5-26811(1993)、法國專利公開NO.2,701,489)、乳發酵短桿菌AJ12475(FERM BP-2922，見美國專利NO.5,272,067)、乳發酵短桿菌AJ13029(FERM BP-5189，見國際公開NO.WO96/06180)或其他生產L-穀氨酸的菌株；大腸桿菌AJ11478(FERM P-5274，見日本專利公開NO.62-34397(1987))、乳發酵短桿菌AJ3718(FERM P-2516，見美國專利NO.3,970,519)或其他生產L-亮氨酸的菌株；大腸桿菌KX141(VKPM B-4781，見歐洲專利公開NO.519,113)、黃色短桿菌AJ12149(FERM BP-759，見美國專利NO.4,656,135)或其他生產L-異亮氨酸的菌株；大腸桿菌VL1970(VKPMB-4411，見歐洲專利公開519,113)、乳發酵短桿菌AJ12341(FERMBP-1763，見美國專利NO.5,188,948)或其他生產L-纈氨酸的菌株；大腸桿菌AJ12604(FERM BP-3579，日本專利申請公開NO.5-236947(1993)、歐洲專利申請NO.488,424)、乳發酵短桿菌AJ12637(FERMBP-4160，見法國專利公開NO.2,686,898)或其他生產苯丙氨酸的菌株。
本發明的微生物是如上所述的這樣一種微生物，該微生物通過導入一個編碼HSP的基因而在其細胞中表達來自極端嗜熱古細菌菌株KOD-1的HSP。通過這種HSP的表達，賦予該微生物對抑制該微生物生長和/或發酵產物生產的逆境的抗性。
編碼極端嗜熱古細菌菌株KOD-1的HSP的基因優選以提高HSP表達量的方式進行導入。具體地說，一個細胞中的HSP基因的拷貝數可通過使用能在微生物細胞中自主複製的載體、特別是一種多拷貝質粒作為將該HSP基因導入微生物細胞的載體進行提高。而且，HSP的表達還可通過使用具有高表達效率的啟動子以增加每個HSP基因的表達量來有效提高。
編碼來自極端嗜熱古細菌KOD-1的HSP的基因可用日本專利申請公開NO.9-173078(1997)中介紹的方法來獲得。具體地說，這可以用諸如PCR的方法來獲得，PCR用從極端嗜熱古細菌菌株KOD-1菌株(《應用與環境微生物》60(12)卷，4559-4566(1994)製備的染色體DNA作為模板，以日本專利申請公開NO.9-173078(1997)中公開的、編碼來自極端嗜熱古細菌菌株KOD-1的HSP的基因的核苷酸序列為基礎製備的寡核苷酸以及其他作為引物來進行。用作引物的寡核苷酸的例子是具有顯示於日本專利申請公開NO.9-173078(1997)中SEQ ID NO8和9的核苷酸序列的寡核苷酸。
編碼極端嗜熱古細菌菌株KOD-1的HSP的基因也可以用整合了含有該基因的DNA片段的質粒的方式來獲得。作為這樣一種質粒，可以推薦質粒pTrc99AcpkB。攜帶了這種質粒pTrc99AcpkB的大腸桿菌JM109被命名為AJ13478，它於1998年7月8日在通產省工業技術院生命工學工業技術研究所(郵編305-0046，1-3，Higashi，1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)進行了保藏，並獲得保藏號FERM P-16887。該保藏隨後在1999年6月14日根據布達佩斯條約轉為國際保藏，並獲得了保藏號FERM BP-6758。
為將按前面介紹獲得的基因導入一個屬於埃希氏菌屬的細菌，例如，可以將一個含有上述基因的DNA片段連接到一個能在該細菌的細胞中自主複製的載體DNA中，並用所獲得的重組載體轉化該細菌。為將上述基因導入一個不屬於埃希氏菌屬細菌的微生物中，例如，可以將一個含有上述基因的DNA片段連接到一個能在該微生物中自主複製的載體DNA中，並用所獲得的重組載體轉化該微生物。
作為能用於本發明的載體DNA，優選是一種質粒載體DNA，當導入基因的微生物是一種屬於埃希氏菌屬的細菌時，可以使用諸如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等。噬菌體DNA載體也可以使用。為獲得該HSP的有效表達，可以用一種在該微生物中有功能的啟動子如lac、trp或PL來取代HSP自身的啟動子。為將該HSP基因導入一種微生物，可以採用使用轉座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，《生物/技術》1卷，417(1983))、Mu噬菌體(日本專利申請公開NO.2-109985(1990)、或同源重組(《分子遺傳學實驗》冷泉港實驗室(1972))的方法，來將一個含有該基因的DNA片段整合到上面提到的微生物的染色體中。而且，當導入基因的微生物是一種棒狀桿菌時，可以使用一種能在棒狀桿菌中自主複製的質粒載體，如pMA330(見日本專利公開NO.1-11280(1989))、pHM1519(見日本專利申請公開NO.58-77895(1983))等。
轉化可按照傳統的微生物轉化子製備方法來完成。例如，屬於埃希氏菌屬的細菌可用D.A.Morrison的方法(《酶學方法》68卷，326頁(1979))或一種受體細胞用氯化鈣處理以增加DNA的通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，《分子生物學雜誌》53卷，159頁(1970))來進行轉化。棒狀桿菌的轉化可用上面介紹的Mandel等人的方法或一種將DNA導入處於生長期的細胞(所謂的感受態細胞)以使細胞像在枯草芽孢桿菌中報導的那樣(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Yong，F.E.《基因》1卷，153頁(1971))整合DNA的方法來完成。也可以製備一種DNA受體菌株的原生質體和球質體，而原生質體和球質體容易整合DNA，然後像已知的枯草芽孢桿菌、放線菌和酵母那樣(Changs，S.和Choen，S.N.，《分子和普通遺傳學》168卷，111頁(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，《自然》274卷，398頁(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，《美國科學院院報》75卷，1929頁(1978))將DNA導入其中。而且，還可以用電脈衝技術(Sugimoto等，日本專利申請公開No.2-207791(1990))將重組DNA導入屬於短桿菌屬和棒狀桿菌屬的細菌。
當一種普通微生物處於逆境如培養基溫度升高、發酵產物引起的高滲透壓、一種高濃度的培養基成分等或伴隨一種靶發酵產物生成的不正常代謝時，其生長會受到抑制或發酵產物的生產率可能會降低。但通過表達來自極端嗜熱古細菌菌株KOD-1的HSP，該微生物能獲得對逆境非常好的抗性。結果，在該微生物處於上面提到的逆境中時，發酵產物的生產率會進一步提高。因此，除了直接檢測HSP外，在導入了來自極端嗜熱古細菌菌株KOD-1的HSP編碼基因以在其細胞中表達HSP的微生物中，上述HSP的表達也可用對上述逆境的抗性進行評價來證明。
對逆境的抗性可能不是完全的抗性，它還指降低逆境影響的能力。而且，根據導入基因的種類和宿主微生物的種類，生長抑制和發酵產量降低也不一定都需要獲得改善，可能只有發酵產物的產量得到提高而生長受到抑制。本發明的方法能對之提供抗性的逆境包括溫度(例如溫度升高)、培養基滲透壓(例如高滲透壓)、一種培養基中的一種胺基酸高濃度等，這些逆境對微生物的生長有害。
本發明所用的進行發酵生產的培養基可以是一種常規使用的、眾所周知的培養基。也就是說，它可以是一種含有一種碳源、一種氮源、無機鹽離子和其他所需的有機成分的普通培養基。使用本發明並不需要任何特殊的培養基。
就碳源而言，可以使用一種糖類如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和澱粉水解物、一種醇類如甘油和山梨醇、一種有機酸如延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸等。
就氮源而言，可以使用一種無機銨鹽如硫酸銨、氯化銨和磷酸銨、一種有機氮源如大豆水解物、氨氣、氨水等。
就微量有機營養而言，需要加入適量的所需物質如維生素B1、L-高絲氨酸和L-酪氨酸或酵母抽提物等。除了這些，根據需要可加入微量的磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。
培養可在根據所用微生物的種類而從常規使用的、眾所周知的條件中選擇的條件下進行。例如，培養可在一種厭氧環境中進行16~120小時，並將發酵溫度控制在25至45℃，pH控制在5至8。為調節pH，可以使用有機或無機的酸性或鹼性的物質以及氨氣等。
在本發明中，完成培養後從培養基中收集發酵產物不需要特別的方法。也就是說，根據本發明生產的代謝產物可以用一種眾所周知的傳統方法如離子交換層析、沉澱、以及這些或其他技術的任意組合等進行收集。
本發明將參照下面的實施例作更具體的解釋。
實施例1
使用導入了來自極端嗜熱古細菌菌株KOD-1的HSP編碼基因(cpkB基因)的L-賴氨酸生產大腸桿菌來生產L-賴氨酸。
大腸桿菌W3110(tyrA)被用作一種生產L-賴氨酸的宿主。菌株W3110(tyrA)在歐洲專利申請No.488424中有詳細的介紹，其製備方法將在下面概述。大腸桿菌W3110獲自國立遺傳研究所(Mishima-shiShizuoka，日本)。將該菌株接種於含有鏈黴素的LB平板，並通過挑選形成菌落的菌株來獲得一個鏈黴素抗性菌株。將所選擇的鏈黴素抗性菌株和大腸桿菌K-12 ME8424的細胞混合，並在一種完全培養基(L-肉湯1％細菌用胰蛋白腖、0.5％酵母抽提物、0.5％NaCl)中在37℃靜止培養15分鐘來誘導細胞接合。大腸桿菌K-12 ME8424的遺傳特徵為(HfrPO45、thi、relA1、tyrATn10、ung-1、nadB)，並可從國立遺傳所獲得。然後，將培養物接種於一種含有鏈黴素、四環素和L-酪氨酸的完全培養基(L-肉湯1％細菌用胰蛋白腖、0.5％酵母抽提物、0.5％NaCl、1.5％瓊脂)，選擇一個能形成菌落的菌株。該菌株被命名為大腸桿菌W3110(tyrA)。
在歐洲專利申請No.488424中公開了通過向這種菌株導入一種質粒而製備的多種菌株。例如，通過向該菌株導入質粒pHATerm而製備的一個菌株被命名為大腸桿菌W3110(tyrA)/pHATerm，它於1991年在通產省工業技術院生命工學工業技術研究所(郵編305-0046，1-3，Higashi，1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)根據布達佩斯條約作為國際保藏進行了保藏，並獲得了保藏號FERM BP-3653。大腸桿菌W3110(tyrA)可用一種常規方法從上述菌株中去除質粒pHATerm來獲得。
質粒pCABD2含有賴氨酸生物合成基因，並在國際公開No.WO95/16042中公開。將該質粒導入上述大腸桿菌W3110(tyrA)中，在一種含有50ug/ml鏈黴素的L平板培養基(在1升純水中含有10克聚腖、5克酵母抽提物、5克NaCl和15克瓊脂，pH7.2)中選擇導入了該質粒的轉化子。
另一方面，一種用於導入cpkB的質粒按下述方法構建。一個含有cpk基因的PCR片段按日本專利申請公開No.9-173078(1997)的實施例5中介紹的方法獲得，並用NcoI和BamHI消化。將酶切片段克隆到一種載體質粒pTrc99A(Pharmacia製造)的NcoI和BamHI位點之間來獲得一種質粒pTrc99AcpkB。攜帶質粒pTrc99AcpkB的大腸桿菌JM109被命名為大腸桿菌AJ13478，它已於1998年7月8日在通產省工業技術院生命工學工業技術研究所(郵編305-0046，1-3，Higashi，1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)進行了保藏，並獲得保藏號FERMP-16887。該保藏隨後在1999年6月14日根據布達佩斯條約轉為國際保藏，並獲得了保藏號FERM BP-6758。而且，一個含有加入的trc啟動子(用EcoRI和BamHI從pTrc99AcpkB中消化切出)的cpkB基因被克隆到pMW218(Wako Pure Chemical Industries製造)的SmaI和BamHI位點之間來獲得一個質粒pMWcpkB，構建該質粒的概述示於圖1。用前面提到的方法將此pMWcpkB導入一個大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2的細胞。在含有50ug/ml鏈黴素和50ug/ml卡那黴素的L平板培養基上選擇導入了該質粒的轉化細胞。
而且，按下面的方法構建一個用於導入rpoH基因的質粒。rpoH基因用國際公開No.WO96/26289的實施例11中介紹的PCR技術進行擴增，並使用一個用於平末端化DNA末端的商業試劑盒(Blunting試劑盒，Takara Shuzo製造)將所獲得的擴增產物在兩端平末端化，並克隆到載體質粒pMW119(Wako Pure Chemical Industries製造)的HincII位點來獲得質粒pMWrpoH。用上面提到的方法將該質粒導入大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2。在含有50ug/ml鏈黴素和50ug/ml青黴素的L平板培養基上選擇導入了該質粒的轉化細胞。
評價按上述介紹獲得的大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2、大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2+pMWrpoH、和大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2+pMWcpkB的L-賴氨酸生產率。
對所獲轉化子的L-賴氨酸生產率的評價按下述進行。將細胞在L平板培養基上培養進行復甦，並將每種復甦的轉化子在1升純水中含有40克葡萄糖、1克KH2PO4、0.01克MnSO47H2O、0.01克FeSO47H2O、2克酵母抽提物、0.1克L-酪氨酸、1克MgSO47H2O和25克CaCO3(pH用KOH調至7.0)的培養基中在37℃培養30小時。還將細胞在相同條件下但在開始培養時加入40克/升的L-賴氨酸鹽酸鹽進行培養。L-賴氨酸的定量試驗使用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd製造的Biotech Analyzer AS210來進行。L-賴氨酸的產量(數量用從培養後培養基中的L-賴氨酸數量中減去開始時加入的L-賴氨酸數量來獲得)用培養基中基於糖的L-賴氨酸鹽酸鹽的產量(重量％)來表示。結果示於表1。
表1基於糖的L-賴氨酸鹽酸鹽產量(％)菌株開始時加入的L-賴氨酸鹽酸鹽(g/L)0 40W3110(tyrA)/pCABD2 30.027.4W3110(tyrA)/pCABD2+pMWrpoH30.228.8W3110(tyrA)/pCABD2+pMWcpkB30.429.3從這些結果可明顯看出，與沒有cpkB基因導入的菌株和導入了rpoH基因的菌株相比，導入了cpkB基因的大腸桿菌即使在存在高濃度的L-賴氨酸的情況下，也能顯示提高的L-賴氨酸生產率。
並且，在培養開始時加入22g/L的NaCl的條件下，對L-賴氨酸的生產率進行了相似的評價。結果示於表2。
表2基於糖的L-賴氨酸鹽酸鹽產量(％)菌株開始時加入的NaCl(g/L)0 22W3110(tyrA)/pCABD2 30.024.3W3110(tyrA)/pCABD2+pMWrpoH30.225.0W3110(tyrA)/pCABD2+pMWcpkB30.425.5從這些結果可明顯看出，與沒有cpkB基因導入的菌株和導入了rpoH基因的菌株相比，導入了cpkB基因的大腸桿菌即使在存在高濃度的NaCl的情況下，也能顯示提高的L-賴氨酸生產率。因此，已經發現其對高滲透壓有很好的抗性。
然後，研究了培養溫度對L-賴氨酸生產的影響。L-賴氨酸生產率用上面介紹的相同方式進行評價，但培養在作為標準條件的37℃下和在42℃下進行。結果示於表3。
表3基於糖的L-賴氨酸鹽酸鹽產量(％)菌株培養溫度(℃)37 42W3110(tyrA)/pCABD2 30.026.3W3110(tyrA)/pCABD2+pMWrpoH30.227.7W3110(tyrA)/pCABD2+pMWcpkB30.427.9從這些結果可明顯看出，與沒有cpkB基因導入的菌株和導入了rpoH基因的菌株相比，導入了cpkB基因的大腸桿菌即使在高溫的培養中，也能顯示提高的L-賴氨酸生產率。
權利要求
1.一種利用微生物來生產發酵產物的方法，該方法包括在一種培養基中培養該微生物來在培養基中生產和積累發酵產物，並收集發酵產物，其中該微生物通過導入一種編碼熱休克蛋白的基因來在該微生物的細胞中表達一種來自極端嗜熱古細菌菌株KOD-1的熱休克蛋白。
2.權利要求1的方法，其中發酵產物是一種胺基酸。
3.權利要求1的方法，其中微生物是一種屬於埃希氏菌屬的細菌或一種棒狀桿菌。
4.權利要求2的方法，其中微生物是一種屬於埃希氏菌屬的細菌或一種棒狀桿菌。
5.一種生產發酵產物的微生物，該微生物通過導入一種編碼熱休克蛋白的基因來在該微生物的細胞中表達一種來自極端嗜熱古細菌菌株KOD-1的熱休克蛋白。
6.權利要求5的微生物，其中發酵產物是一種胺基酸。
7.權利要求5的微生物，其中微生物是一種屬於埃希氏菌屬的細菌或一種棒狀桿菌。
8.權利要求6的微生物，其中微生物是一種屬於埃希氏菌屬的細菌或一種棒狀桿菌。
全文摘要
一種利用微生物來生產一種發酵產物的方法,該方法包括,在一種培養基中培養該微生物,來在培養基中生產和積累該發酵產物,並收集發酵產物,其中該微生物通過導入一種編碼熱休克蛋白的基因來在該微生物的細胞中表達一種來自極端嗜熱古細菌菌株KOD－1的熱休克蛋白。
文檔編號C12R1/19GK1250102SQ9911770
公開日2000年4月12日 申請日期1999年8月11日 優先權日1998年8月11日
發明者菊池慶實, 倉橋修, 橫關健三, 田中崇 申請人:味之素株式會社