免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗及製備方法

2023-05-23 20:58:51

專利名稱：免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗及製備方法
技術領域：
在醫學領域的腫瘤領域，通常可以用腫瘤疫苗，本發明的技術是一種抗人絨毛膜促性腺激素的多肽疫苗，能用於治療人絨毛膜促性腺激素依賴性腫瘤。
背景技術：
人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin，HCG)是由人胚滋養層細胞分泌的一種糖蛋白激素，其作用是維持並刺激妊娠黃體產生孕酮和雌二醇，促進子宮內膜細胞發育成熟，為胚胎著床準備條件，在早期妊娠中具有重要的作用。HCG由α、β兩亞基組成，α亞基與人促黃體激素、促卵泡激素及促甲狀腺素的α亞基基本相同，激素的特異性、活性在於β亞基。此外，多種組織的腫瘤選擇性分泌單鏈βHCG或βHCG的核心片段，如生殖系統中的絨毛膜癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮內膜癌、宮頸癌，其他系統中如胃癌、膀胱癌、肺癌、肝癌，甚至口腔中的鱗狀細胞癌也能檢測到。HCG通過與靶細胞上受體結合傳遞激素信息，HCG受體分布廣泛，不僅存在於性腺靶組織，且在一些非性腺組織中如前列腺、乳腺、腎上腺、甲狀腺、大腦皮層等也有表達。近幾年發現LH/HCG受體也存在於某些惡性腫瘤細胞表面，如子宮內膜癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌等。因此，βHCG作為腫瘤細胞分泌的特徵性分子之一，也是防治癌症的有效靶分子之一。許多實驗已證明利用βHCG純化蛋白、重組蛋白及合成多肽製作的疫苗能夠激發體內產生保護性抗體，中和腫瘤細胞分泌的βHCG抗原，並通過阻斷HCG與腫瘤細胞表面HCG特異性結合位點的結合，實現對腫瘤的治療。另外，通過阻斷HCG能夠抑制胚胎發育導致流產從而發揮避孕作用。
國外學者用βHCG的C端37肽與白喉毒素或破傷風毒素偶連，用這種偶連物誘導機體產生抗HCG抗體，顯示能用於治療結腸癌、胰腺癌和乳腺癌等。在中國，白喉毒素或破傷風毒素都已經被列為計劃免疫疫苗，許多人都曾經被用白喉毒素和破傷風毒素免疫過。在這些人群中使用白喉毒素或破傷風毒素偶連物時，免疫效果會減弱。用多肽疫苗沒有白喉毒素或破傷風毒素偶連物類似的表位抑制問題，但如何加強多肽疫苗的免疫原性是許多疫苗研究人員追求的目標。
通常，多肽疫苗需要加入佐劑，才能激發機體產生足夠強的免疫應答。許多常用的佐劑，如福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑等僅能用於動物，不能用於人體；人體可用的佐劑目前僅有鋁佐劑，而這種佐劑常常對多肽疫苗不能起到強化免疫原性的作用。

發明內容
本發明的目的是提供一種強化多肽免疫原性的方法。
本發明的另一目的是提供一種免佐劑的抗HCG多肽疫苗。
本發明的再一目的是提供生產該免佐劑抗HCG多肽疫苗的方法。
本發明的還有一個目的是免佐劑抗HCG多肽疫苗的用途。
在本發明的第一方面，提供了一種強化多肽免疫原性的方法，這種方法是將兩段重複的抗原表位多肽串聯基因反覆插入HSP65基因的下遊，使多重複串聯抗原表位多肽與HSP65融合表達。這種強化多肽免疫原性方法的原理是(1).將抗原表位多肽重複多次，可以增加抗原表位的劑量，增加整個抗原的分子量，從而增加抗原表位多肽的免疫原性；(2).通過重複抗原表位基因的反覆循環克隆實現抗原表位的多次重複；(3).分枝桿菌(卡介苗)HSP65具有在位佐劑的功能，將抗原表位多肽重複片斷與分枝桿菌(卡介苗)HSP65融合表達的蛋白作為疫苗，可以不需添加佐劑，誘發機體產生強烈的免疫應答。而且，將HSP65與抗原表位融合表達可省去抗原表位多肽與在位佐劑HSP65化學偶聯的步驟。
在本發明中，術語「X2n」指抗原表位串聯排列，X2指兩段βHCG109-118串聯多肽，n指用於串聯排列的重複抗原表位(X2)的個數，可以等於1或大於1，抗原表位之間可以直接相聯，也可以有間隔的胺基酸殘基。在疫苗研究中，表位之間可以在空間上相鄰也可以不相鄰。
在本發明的第二方面，提供了一種抗人絨毛膜促性腺激素免佐劑多肽疫苗。該疫苗採用本發明的第一方面所述的方法進行設計。在疫苗分子中，(重複抗原表位)n等於ThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerAlaArgThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerAlaArgThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerAlaSer，即含有六段(但不限於)作為抗原表位的βHCG109-118肽段；為了敘述方便，在實施例中，本發明含六段βHCG109-118的抗原表位用「X6」表示。βHCGCTP37是指HCGβ亞基109-145多肽，即HCGβ鏈C端37肽，其胺基酸序列是ThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerSerSerSerLysAlaProProProSerLeuProSerProSerArgLeuProGlyProSerAspThrProIleLeuProGln。HSP65是指源於用作卡介苗的分枝桿菌來源的熱激蛋白，國際基因庫登錄號是M17705。將抗原表位多肽與HSP65融合表達，能強化多肽疫苗的免疫原性，不需添加佐劑就能激發機體產生強烈免疫應答。將βHCGCTP37和六段抗原表位與HSP65融合表達所獲得的免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗表示為「HSP65-X6-βHCGCTP37」。
在本發明的第三方面，是提供生產抗人絨毛膜促性腺激素的重複表位多肽疫苗的方法，其技術路線詳述如下1.βHCGCTP37基因的設計與獲得在不改變βHCGCTP37多肽胺基酸序列的前提下，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，藉助於計算機設計四條寡核苷酸，通過PCR法獲得βHCGCTP37多肽基因的核苷酸序列，5』端添加了BamHI的識別位點，3』端添加了終止密碼子和HindIII的識別位點。
2.HSP65基因的設計與獲得在不改變HSP65胺基酸序列的前提下，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，藉助於計算機設計兩條寡核苷酸，從市售的卡介苗提取的DNA中通過PCR法獲得HSP65基因的核苷酸序列，5』端添加了NcoI的識別位點，3』端添加了NheI和BglII的識別位點。
3.重複抗原表位(X2)基因的設計和獲得在不改變兩段βHCG109-118串聯多肽胺基酸序列的前提下，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，藉助於計算機設計兩條寡核苷酸，通過PCR法獲得重複抗原表位多肽基因的核苷酸序列，5』端添加了XbaI的識別位點，3』端添加了NheI的識別位點。重要的一點是其中一個絲氨酸Ser的密碼子選用TCA，以便於陽性克隆的篩選。因為載體質粒採用單酶切，插入X2基因時會有正向和反向兩種情況，如果是正向插入則TCA表達為Ser，HSP65-X2n-βHCGCTP37蛋白的分子量比HSP65-X2(n-1)-βHCGCTP37蛋白要大2400左右；如果是反向插入則TCA反向序列TGA為終止密碼子，HSP65-X2n-βHCGCTP37蛋白的分子量比HSP65-X2(n-1)-βHCGCTP37蛋白的分子量小。所以用SDS-PAGE考馬斯亮藍染色可判斷正向正確插入X2基因的重組克隆。
4.pED-βHCGCTP37重組基因工程菌的構建βHCGCTP37基因經BamHI、HindIII切割插入經BamHI、HindIII切割的pED中，組成融合表達的重組質粒pED-βHCGCTP37，重組質粒轉化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
5.Hh重組基因工程菌的構建HSP65基因經NcoI、BglII切割插入經NcoI、BamHI切割的pED-βHCGCTP37中，組成融合表達的重組質粒HSP65-βHCGCTP37簡稱Hh，重組質粒轉化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
6.HX2nh重組基因工程菌的構建X2基因經XbaI、NheI切割插入經NheI切割的Hh中，組成融合表達的重組質粒HX2h，仍然留有單一位點NheI，在此基礎上重複操作可再插入一段X2基因，即插入X2基因n次則得到融合表達的重組質粒HX2nh，重組質粒轉化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
7.工程菌發酵及重組HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白的獲得以LB為基礎培養基，玉米漿培養基為發酵培養基，發酵參數如下溫度36-38℃，pH6.8-7.2。發酵後離心收集工程菌，反覆凍融裂解菌體，離心獲得上清可溶性蛋白，硫酸銨分級沉澱，20％-40％硫酸銨沉澱中含有目的融合蛋白，沉澱重新溶解後經離子交換柱層析純化，用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，可以判斷純化的HSP65的純度。
在本發明的第四方面是免佐劑抗HCG多肽疫苗的用途，如上所述，免佐劑抗HCG多肽疫苗能用於治療乳腺癌、結腸癌、胰腺癌和前列腺癌，也能用於避孕和動物去勢。


圖1，載體質粒pET28a-HSP65，以及重組質粒Hh和HX6h。
圖2.基因重組抗原HSP65-X6-βHCGCTP37的鹼基序列(1953bp)。
圖3.HX6h質粒的βHCGCTP37和X6及HSP C端部分基因測序結果。
圖4.SDS-PAGE電泳顯示HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37的融合表達。1.標準分子量蛋白；2.大腸桿菌BL21細胞全蛋白；3.載荷pED質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白；4.載荷pED-βHCGCTP37質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白；5.載荷pET28a質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白；6.載荷pET28a-HSP65質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白；7.載荷Hh質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白；8.載荷HX2h質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白；9.載荷HX4h質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白；10.載荷HX6h質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白。
圖5.SDS-PAGE電泳顯示HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白的純化.1.標準分子量蛋白；2.載荷pET28a質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白；3.載荷HX6h質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白；4.載荷Hh質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白；5.分離的HSP65-X6-βHCGCTP37；6.分離的HSP65-βHCGCTP37。A箭頭顯示HSP65-X6-βHCGCTP37的位置；B箭頭顯示HSP65-βHCGCTP37的位置。
圖6.ELISA測定結果顯示只有HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白能誘發小鼠產生抗HCG抗體。圖例○生理鹽水◆HSP▲Hh■HX6h圖7.EMT6腫瘤生長曲線顯示經HSP65-X6-βHCGCTP37免疫的小鼠較經HSP65-βHCGCTP37免疫的小鼠和注射生理鹽水的正常小鼠荷瘤小。圖例○生理鹽水▲Hh■HX6h圖8.EMT6腫瘤平均大小(圖A)及腫瘤平均重量(圖B，圖例□生理鹽水 Hh■HX6h)顯示經HSP65-X6-βHCGCTP37免疫的小鼠較經HSP65-βHCGCTP37免疫的小鼠和注射生理鹽水的正常小鼠荷瘤EMT6小(P＜0.005)。
圖9.RM-1接種小鼠生存時間曲線，顯示經HSP65-X6-βHCGCTP37免疫的小鼠較經HSP65-βHCGCTP37免疫的小鼠和注射生理鹽水的正常小鼠荷瘤RM-1後存活時間長(P＜0.001)。
實施例材料(1)菌株與質粒大腸桿菌(Escherichia coli AS1.357)該菌種從中國菌種保藏中心獲得。宿主菌E.coli BL21是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究有關的實驗室一般都有保存。
質粒pET28a購自Novagen公司。
卡介苗由上海生物製品公司生產，該製品中含有牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)。
質粒pED由本實驗室構建並保存。
質粒pET28a-HSP65由本實驗室構建並保存，HSP65蛋白也由本實驗室分離純化。
(2)酶和試劑分子克隆工具酶和試劑、細菌基因組、質粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產品。
(3)培養基LB培養基，配方見參考文獻Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。該書是基因工程技術的經典著作，在許多高校圖書館都有收藏。
玉米漿培養基含有玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
方法分子生物學操作方法質粒提取、聚合酶鏈反應、內切酶酶切、DNA片斷的回收、連接和轉化大腸桿菌在基因工程研究領域，這些都是常規操作方法，參見Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
重組蛋白表達量的測定參見Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法進行。
實施例1 HSP65-X6-βHCGCTP37多肽基因的設計、合成和克隆根據HSP65基因和βHCGCTP37多肽基因的胺基酸序列，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，在計算機的輔助下設計出8條寡核苷酸片段。首先通過PCR法合成βHCGCTP37多肽基因，將該基因克隆到pED的L-ansB-C基因的C端，轉化大腸桿菌得到重組質粒命名為pED-βHCGCTP37。再以pET28a-HSP65質粒為模板，通過PCR的方法獲得HSP65基因，將該基因替換pED-βHCGCTP37中的L-ansB-C基因，轉化大腸桿菌得到重組質粒命名為Hsp65-βHCGCTP37(簡稱Hh)。然後通過PCR法獲得βHCG109-118多肽兩次重複串聯排列的基因(簡稱X2)，將該基因克隆到Hh的Hsp65基因和βHCGCTP37基因之間，轉化大腸桿菌得到重組質粒命名為H X2h；重複克隆X2基因得到重組質粒H X4h；再重複克隆X2基因得到重組質粒H X6h。具體方法如下8條寡核苷酸如下P15』GAC GAC CCG CGT TTC CAG GAC TCT TCT TCT TCT AAA GCT CCG CCG CCA TCT CTG 3』P25』AGT GTC AGA CGG ACC CGG CAG ACG AGA CGG AGA CGG CAG AGA TGG CGG CGG AGC3』P35』GGGG GAT CCG ACT GGT GGC ACT TGC GAC GAC CCG CGT TTC CAG GAC3』P45』AAAA AGC TTA CTG CGG CAG GAT CGG AGT GTC AGA CGG ACC CGG CAG3』P55』TTG ACC ATG GCC AAG ACA ATT GCG TAC3』P65』TAA AAG ATC TGC GCT AGC GAA ATC CAT GCC ACC CAT 3』P75』ATA TCT AGA ACT TGC GAC GAC CCG CGT TTC CAG GAC TCT ACT TGC GAC GAC CCG3』P85』AAA GCT AGC AGA GTC CTG GAA ACG CGG GTC GTC GCA AGT TGA GTC CTG GAA ACG3』通過PCR獲得βHCG CTP37多肽基因第一步寡核苷酸片段P1和P2按一定比例混合，二者互為引物和模板，94℃，1min，58℃，45sec，72℃，45sec，共15輪；72℃，10min。再以該PCR產物為模板，用P3和P4引物進行PCR擴增，94℃，1min，58℃，1min，72℃，1min，共20輪；72℃，10min。將擴增獲得的PCR產物用限制性內切酶BamH1和HindIII消化，與用相同限制性內切酶消化的pED質粒連接，連接產物轉化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)，所獲得的轉化子中含連有βHCG CTP37多肽融合蛋白基因的重組質粒pED-βHCGCTP37。
通過PCR獲得HSP65-βHCGCTP37多肽基因以P5為上遊引物，P6為下遊引物，pET28a-HSP65質粒為模板，經94℃變性5min，然後以94℃變性1min、62℃復性2min、72℃延伸4min共進行35個循環後，再72℃延伸10min。將擴增獲得的PCR產物用限制性內切酶NcoI和BglII消化，與用相同限制性內切酶消化的pED-βHCGCTP37質粒連接，連接產物轉化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)，所獲得的轉化子中含HSP65-βHCGCTP37多肽融合蛋白基因的重組質粒Hh，其結構框架見圖1。
通過PCR獲得HSP65-X6-βHCGCTP37多肽基因以寡核苷酸片段P7和P8按一定比例混合，二者互為引物和模板，經94℃變性5min，然後以94℃變性1min、58℃復性50sec、72℃延伸30sec共進行30個循環後，再72℃延伸10min。將擴增獲得的PCR產物X2用限制性內切酶XbaI和NheI消化，與用限制性內切酶NheI消化的Hh質粒連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21，所獲得的轉化子中含HSP65-X2-βHCGCTP37多肽融合蛋白基因的重組質粒HX2h。限制性內切酶XbaI和NheI是同尾酶，酶連後形成的粘合位點不再被XbaI或NheI識別，因此重組質粒H X2h中仍然只留有一個NheI酶切位點。再將PCR擴增產物X2用限制性內切酶XbaI和NheI消化，與用限制性內切酶NheI消化的H X2h質粒連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21，所獲得的轉化子中含HSP65-X4-βHCGCTP37多肽融合蛋白基因的重組質粒H X4h；再次進行這一過程得到含HSP65-X6-βHCGCTP37多肽融合蛋白基因的重組質粒H X6h，其結構框架見圖1。進行核酸的序列分析，進一步驗證GRF基因及其讀碼框的正確性.測序圖見圖3。從測序結果可以看出，HSP65序列、六段βHCG109-118重複序列和βHCGCTP37序列已經串聯，實現了基因融合。
實施例2 HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37多肽基因在大腸桿菌中的表達將重組質粒Hh和H X6h分別轉化大腸桿菌BL21。從生長有不同轉化子平板上挑取單菌落種入LB液體培養基中，在37℃振蕩培養過夜，按2％比例轉種入新鮮的玉米漿液體培養基中，37℃培養4小時，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG誘導大腸桿菌表達T7RNA聚合酶，繼續培養從而表達融合蛋白。誘導後每隔1小時取少量菌液，離心回收菌體，SDS-PAGE電泳再經薄層掃描顯示已經實現了HSP65-βHCGCTP37多肽基因和HSP65-X6-βHCGCTP37多肽基因的融合表達，並且HSP65-X2n-βHCGCTP37蛋白的分子量比HSP65-X2(n-1)-βHCGCTP37蛋白要大2400左右。融合蛋白在誘導後6小時達到穩定的最大表達量，融合蛋白佔細菌總蛋白的40％左右，結果見圖4。
實施例3融合蛋白分離純化誘導表達後的工程菌經離心回收菌體，將菌體懸浮在破壁液(pH8.0磷酸緩衝鹽，0.02％溶菌酶)中，凍融後在30℃攪拌90分鐘，加入DNase將DNA消化至溶液不粘稠為止，離心回收上清，用硫酸銨分級沉澱，目的蛋白主要在20％-40％硫酸銨沉澱中。將沉澱的融合蛋白重新溶解在pH8.0磷酸緩衝鹽中，離心後上清上DEAE纖維素DE52柱(2×60cm)，用PBS/NaCl梯度洗脫，分部收集進行SDS-PAGE電泳檢測，HSP65在120mmol處的洗脫峰中，用SDS-PAGE電泳檢查製備樣品的純度，見圖5。
實施例4 HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白疫苗的免疫原性研究選用7-8周齡BALB/C小鼠，HSP65-βHCGCTP37實驗組、HSP65-X6-βHCGCTP37實驗組、HSP65空白對照組和生理鹽水陰性對照組各8隻。除生理鹽水組外所有小鼠都進行卡介苗(BCG)(上海生物製品公司)的預免疫，凍幹的卡介苗用生理鹽水配製成5×106CFU/ml，每隻鼠皮下注射100μl。預免疫兩周後，進行第一次免疫，分別皮下注射100μl(0.5μg/μl於生理鹽水)的HSP65-βHCGCTP37、HSP65-X6-βHCGCTP37和HSP65蛋白，無須福氏佐劑乳化。以後每隔2周加強免疫一次，共進行2次加強免疫。生理鹽水組注射相同量的生理鹽水。每次免疫後2周內眥取血一次，血量為0.5-0.8ml，離心，取血清冷凍保存；預免疫80天後處死大鼠，眼球取血，離心取血清冷凍保存。
用純化的pED-βHCGCTP37融合蛋白4℃過夜包被96孔ELISA酶標板，每孔100μl含100ng融合蛋白。包被後，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃滿孔封閉一小時。免疫後取血所得抗血清，用5％BSA(於pH7.5的PBS中)稀釋100倍，然後每孔加入100μl稀釋後的抗血清於37℃作用1小時。用PBST(含0.1％Tween-20)洗滌6次後加入100μl以1∶20000稀釋的羊抗小鼠IgG二抗(辣根過氧化物酶標記)，每孔100μl，37℃作用1小時。PBST洗滌6次，每孔加入100μl過氧化氫尿素和3、3`、5、5`-四甲基聯苯胺(TMB)溶液於37℃顯色20分鐘後，加入50μl 2MH2SO4終止反應，並於450nm波長下，測定各孔吸光度值。結果見圖6。從結果可以看出，只有含重複抗原表位的HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白能誘發特異的抗HCG抗體。
實施例5 HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白疫苗的藥效研究選用7-8周齡雌性BALB/C小鼠，HSP65-βHCGCTP37實驗組、HSP65-X6-βHCGCTP37實驗組和生理鹽水陰性對照組各6隻。除生理鹽水組外所有小鼠都進行卡介苗(BCG)(上海生物製品公司)的預免疫，凍幹的卡介苗用生理鹽水配製成5×106CFU/ml，每隻鼠皮下注射100μl。預免疫兩周後，進行第一次免疫，分別皮下注射100μl(0.5μg/μl於生理鹽水)的HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白，無須福氏佐劑乳化。以後每隔2周加強免疫一次，共進行2次加強免疫。生理鹽水組注射相同量的生理鹽水。最後一次免疫後第3周，實驗組和對照組小鼠右側胸前皮下接種0.1mL(107個/mL)EMT6小鼠乳腺癌細胞。觀察記錄腫瘤生長情況，用遊標卡尺測量腫瘤的長、短徑。腫瘤體積按公式V(mm3)＝0.4ab2計算，a＝長(mm)，b＝寬(mm)，比較腫瘤大小並繪製生長曲線，見圖7。於腫瘤細胞接種後第28天，全部動物眼球取血後處死，取肝、脾、腎和卵巢子宮以及瘤組織，稱重，拍照，見圖8。表明經HSP65-X6-βHCGCTP37免疫的小鼠比經HSP65-βHCGCTP37免疫的小鼠和注射生理鹽水的正常小鼠荷瘤EMT6更小(P＜0.005)。
選用7-8周齡雄性C57/BL6小鼠，HSP65-βHCGCTP37實驗組、HSP65-X6-βHCGCTP37實驗組和生理鹽水陰性對照組各7隻。除生理鹽水組外所有小鼠都進行卡介苗(BCG)(上海生物製品公司)的預免疫，凍幹的卡介苗用生理鹽水配製成5×106CFU/ml，每隻鼠皮下注射100μl。預免疫兩周後，進行第一次免疫，分別皮下注射100μl(0.5μg/μl於生理鹽水)的HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白，無須福氏佐劑乳化。以後每隔2周加強免疫一次，共進行2次加強免疫。生理鹽水組注射相同量的生理鹽水。最後一次免疫後第4周，實驗組和對照組小鼠前列腺接種0.02mL(2*107個/mL)RM-1小鼠前列腺癌細胞。觀察記錄小鼠存活情況，並繪製生存時間曲線，見圖9。表明經HSP65-X6-βHCGCTP37免疫的小鼠較經HSP65-βHCGCTP37免疫的小鼠和注射生理鹽水的正常小鼠荷瘤RM-1後存活時間更長(P＜0.001)。
權利要求
1.一種製作免佐劑強免疫原性多肽疫苗的方法，其特徵在於將兩段重複的抗原表位多肽串聯基因反覆插入HSP65基因的下遊，使抗原表位多肽多重複串聯。並且抗原表位多肽基因與源於分枝桿菌(Mycobacterium bovis)的熱激蛋白HSP65基因連接，使抗原表位多肽與HSP65融合表達。
2.一種免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗，該疫苗按照權利要求1所述的方法製作，其特徵在於不需添加佐劑，也不需要將抗原多肽與載體化學偶聯，能激發機體產生強烈免疫應答，產生高滴度的抗人絨毛膜促性腺激素抗體，並通過阻斷人絨毛膜促性腺激素，使機體腫瘤細胞的生長受到顯著抑制。
3.按照權利要求2所述的疫苗，其特徵在於疫苗多肽中含有六段人絨毛膜促性腺激素β鏈109-118重複串聯肽段，其胺基酸序列是ThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerAlaArgThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerAlaArgThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerAlaSer，末尾兩個胺基酸AlaSer對應的DNA序列是DNA限制性內切酶Nhe I的識別位點，可用於反覆插入抗原表位多肽基因，使串聯更多抗原表位肽段。疫苗多肽的結構可表示為HSP65-X2n-βHCGCTP37肽，插入基因X2n次，則疫苗多肽中含有2n個串聯的人絨毛膜促性腺激素β鏈109-118表位肽段，n≥1。
4.按照權利要求2所述的疫苗，其特徵在於多肽與牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)的熱激蛋白HSP65融合表達，融合蛋白作為疫苗在不額外添加佐劑的情況下激發機體產生強烈的免疫應答。
5.一種免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗製備方法，包括用化學合成法和PCR法合成人絨毛膜促性腺激素β鏈C端37肽、兩段人絨毛膜促性腺激素β鏈109-118重複串聯肽段和HSP65的編碼序列DNA，將這些DNA分步插入表達載體，在大腸桿菌中表達出可溶性融合蛋白；經硫酸銨分級沉澱純化；再經離子交換樹脂DEAE纖維素純化，得到抗人絨毛膜促性腺激素疫苗多肽。
6.根據權利要求4所述免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗，其特徵在於免疫動物能誘發機體產生抗人絨毛膜促性腺激素抗體，通過機體內抗人絨毛膜促性腺激素抗體與人絨毛膜促性腺激素結合，可以治療人絨毛膜促性腺激素依賴的乳腺癌、結腸癌、胰腺癌和前列腺癌，也能用於避孕和動物去勢。
7.根據權利要求4所述免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗，其特徵在於可與藥物載體組合製成藥物組合物。
8.根據權利要求4所述免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗，其特徵在於可與其他藥物活性成分組合製成藥物組合物。
全文摘要
將多重複串聯抗原表位多肽基因與源於分枝桿菌(Mycobacterium bovis)的熱激蛋白HSP65基因連接，產生融合表達蛋白可直接用於免疫。針對弱免疫原性的抗原多肽，將兩段重複的抗原表位多肽串聯基因反覆插入HSP65基因的下遊，實現了多重複串聯抗原表位多肽與HSP65的融合表達。應用這項技術，研製了一種免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗。該疫苗不需添加佐劑，也不需要將抗原多肽與載體化學偶聯，能激發機體產生高滴度的抗人絨毛膜促性腺激素抗體，並通過阻斷人絨毛膜促性腺激素，使機體腫瘤細胞的生長受到顯著抑制。從而治療人絨毛膜促性腺激素依賴的乳腺癌、結腸癌、胰腺癌和前列腺癌等，也能用於避孕和動物去勢。
文檔編號A61K38/24GK1562363SQ20041001438
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月22日 優先權日2004年3月22日
發明者劉景晶, 嚴榮, 吳潔, 曹榮月 申請人:中國藥科大學