外表面蛋白質及其基因和用途的製作方法

2023-05-23 21:08:06

專利名稱：外表面蛋白質及其基因和用途的製作方法
技術領域：
該項發明是關於外表面蛋白質的鑑定及其基因和用途，尤其是涉及 在免疫治療和藥物篩選上的應用。
背景技術：
B組鏈球菌(GBS)也被稱為無乳鏈球菌，是各種病的病原體。特別是， GBS可引起
早期發作新生期感染
該感染通常開始於子宮，導致新生兒嚴重的敗血病和肺炎，如果不 能及時治療將其致死，即使得到治療也會有10 - 20%的死亡率。 晚期發作新生期感染
該感染多發於嬰兒剛出生至大約3個月期間，可致敗血病，90°/。的病 例伴發腦膜炎。其它病灶性感染包括腦膜炎、膿毒性關節炎、膿腫和眼 內炎。
成人感染
該感染似乎越來越常見且最頻繁地發生於剛生育過嬰兒的、年長的、 無免疫應答的女性身上。其特徵為敗血病和病灶性感染，包括腦膜炎、 膿毒性關節炎、膿腫和眼內炎。
尿道感染
GBSl泉道感染的成因，在妊娠期的所有感染中約佔10%。 家畜感染
GBS引起奶牛的慢性乳腺炎。導致產奶量下降，因此具有值得注意的 經濟重要性。
雖然GBS感染可用抗生素治療，但免疫學的方法是優選的。因此人 們希望找到一種能被用於有治療效果的疫苗中的免疫原。
3發明概要
本發明基於在GBS中的一系列基因的筌定，以及相關的生物體，該 生物體的產物可能與其外表面相關聯且因此可被用作免疫治療的乾.
根據本發明的一個方面，肽由包括任意的已被筌定為MS4、 MSIO、 MSll、 MS14和MS16的可得自GBS的基因，或其同源物或功能性片段的操 縱子所編碼。此種肽適合用於治療，例如當被分離後。
此處所用的術語"功能性片段"是指一部分保留整個基因或肽活性 的基因或肽。例如肽的功能性片段可用做抗原決定因子，在疫苗或抗體 生產方面頗有用處.
基因片段可用於編碼活性肽，另外，該基因片段在基因療法、體內 野生型基因定位來發揮治療作用方面有實用.
本發明的肽可包含確定的任一胺基酸序列，如SEQ IDN0S.2、 4、 6、 8、 10和12，或包含上述序列的功能性片段。
因為位於細胞外或細胞表面的位置，本發明的肽可為生產抗GBS治 療上有效的疫苗的候選物."治療上有效的"是指包括疫苗的預防作用。 例如，疫苗可包含本發明所述的肽或用於其表達的工具以治療感染。
這種疫苗可在婦女懷孕前或懷孕期間給藥來保護母親和新生兒免受 GBS感染.
根據本發明的另一方面，此肽或基因可用於篩選潛在的抗微生物藥 物或毒性檢測.
本發明的另一個方面是在此處鑑定的任意產物的用途，用於與GBS 菌抹感染相關病症的治療或預防。
雖然已經描述了此蛋白質用於病人的治療，但該產物的獸醫用途也 被視為在本發明的範圍之內。尤其是，該肽或疫苗可被用於慢性乳腺炎 的治療，特別是對奶牛的治療。
發明描述
本發明與B組鏈球菌菌抹M732有關，然而所有的GBS菌抹和許多其 它的細菌菌抹都可能包含相關的肽或蛋白質，它們都有與M732的肽同源的胺基酸序列。可能含有此肽的生物體，包括但不僅限於此肺炎鏈球 菌，釀膿鏈球菌，豬鏈球菌，米氏鏈球菌，C組和G組鏈球菌，還有腸球 菌。按照描述GBS的相同方法，可以開發出這些菌抹中的相應疫苗.
優逸地，用於生產疫苗的欣與在此筌定的肽有超過40%的序列相似 性，優選可以超過60%,最優選可多於80%的序列相似性，例如95%相似 性，
在筌定出本發明的一個基因後，可以用此基因序列在別的微生物中 確定同源性。以此方式還可以確定別的微生物是否有相似的外表面產物. 通it^現存的資料庫例如EMBL或Genbank中搜索，可以確t亭列的同 源性。
本發明的肽或蛋白質可通過本領域已知的方法被純化和分離。特別 是，確定基因序列後，可以用重組技術在合適的宿主中表達基因.活性 片段和同源物可以被鑑定出來，並在治療領域中應用。例如，肽或其活 性片段可在疫苗中作為抗原決定簇，來引起免疫答應。其也可以被用於 抗體的製備，用於被動免疫或診斷應用.合適的抗體包括單克隆抗體或 其片段，包括單鏈fv片段。製備抗體的方法對本領域的技術人員來說是 顯而易見的。
基於減毒微生物的疫苗的製備是本領域技術人員已知的。如需要或 希望的話，疫苗組合物可與合適的載體或佐劑如明礬一起配製，並用於 治療，來提供抗B組鏈球菌或其它相關微生物的有效免疫作用.疫苗配 劑的製備對本領域的技術人員來說是顯而易見的，
通常，本發明用於治療的活性成分的合適的量以及合適載體或賦形 劑以及給藥途徑的選擇對本領域的技術人員來說是公知的.這些因素可 根據已知標準選擇或確定，諸如所治療病症的性質/嚴重性、受治療者的 類型或健康狀況等.
本發明的產品可按如下方法鑑定
將GBS接種於Todd - H—ewitt氏鏈球菌肉湯培養基中，允許在37"C下 培養過夜.細胞被離心收集和用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌.將細胞重新懸浮在滲透性緩衝液(2096(W/V)蔗糖，20MmTris - HC1 pH 7.0, 10mMMgCl2) 中，該滲透性緩衝液含有蛋白酶抑制劑(lmM PMSF， IOMM碘乙酸，10mM 1,10-二氮雜菲，1mM胃酶抑素A)和終濃度為4單位/微升變溶菌素， 在37^培養(振蕩)2小時。
先用高速離心機除去細胞和碎屑，再用超高速離心1小時。所得到 的含有細胞壁蛋白質的上清液用超濾設備加壓濃縮(分子量截斷值為 10,000).
樣品對超高水透析後凍幹，經過在填充緩衝液中再懸浮，用製備性 兩向凝膠電泳分離出蛋白質，電泳後，選一個單獨的點用於研究.對該 點進行MR內胰蛋白酶消化.皿狀中提取產生的肽，用微內徑RP-HPLC 純化。每隔45秒收集一次級分，與紫外吸收區相應的部分用延時提取-基體輔助雷射解吸-飛行時間質譜、(DE-MALDI-TOF-MS)分析.然後 用Nanospray - MS/MS對在空白製劑中未觀察到的Jtt行測序。
使用此狀序列的信息，設計了簡併低聚核苷酸，將其用於聚合酶鏈 反應(PCR)來擴增位於所筌定的Ji^列之間的DNA片段.
PCR擴增反應的結果是產生幾個多聚核苷酸片段，其中每一片段按照 製造商的說明書被克隆到pCR 2. 1-TOPO載體(Invitrogen BV,荷蘭) 中。
每一質粒中的DNA片段通過測序被鑑定，然後如下所述被用於獲得 全長基因序列.
用已筌定的DNA片段，低聚核苷酸引物被設計用於基因組DNA測序. 這些引物被設計以便從得到的序列"向外的"方向排序。 一旦閱讀，即 可檢查獲得的序列是否已經到達基因的5'端和3，端。通過檢查同源序列 筌定了這些特徵的存在，對於5'末端來說，在Shine - Dalgarno共有序 列之前存在AUG起始密碼子(或公認的替換物)而對於3'末端來說，存在 翻譯終止密碼子。
根據全長基因的鑑定，引物被設計用於從GBS基因組DNA擴增全長 產物。所用的引物包括限制酶識別位點(在5'末端的Ncol和在3'末端的Eco0109D，允許產物隨後克隆到所用的乳球菌表達體系中.
用引物進行PCR反應，並把產物克隆到pCR 2.1克隆載體 (Invitrogen)中.在確認克隆片賴:存在後，用限制酶Ncol和Eco01091 切除該亂
插入此片段的栽體是pNZ8048的修飾變體(Kuipers， 0. P.等人(1998) J.Biotech 64:15-21)。這種含有乳球菌複製起點、氯黴素抗性標記、 可誘導的乳鏈菌肽啟動子和多克隆位點的載體通過用2個10X組氨酸標 記取代位點得以改變多克隆，側接於帶有Ncol位點的5，末端，在含有多 克隆位點(包括Eco01091位點)和His標記的3'末端的終止密碼子的中間 分開.
插入目的基因，這樣一個10X組氨酸標記處在相對於密碼區的3'位 置.把重組質粒轉化到乳酸乳球菌(L. lactis)(菌抹NZ9000 - Kuipers， 0.p.等人(1998)見上文)中，形成一種400ml的液體培養物，通過將乳鏈 菌肽加到培養物中來誘導蛋白質的翻譯.培養2小時後，收穫細胞並用 玻珠攪打溶胞，將生成的溶胞產物離心分離，然後通過金屬親合性(Talon, clonetech)柱.在用咪唑洗脫結合的蛋白質前反覆洗柱.
為了鑑定含有組氨酸標記的重組蛋白質的級分，每個級分的等分試 樣都用SDS-PAGE、蛋白質印跡法分析，並用抗-His抗M測.
然後用得到的重組蛋白質免疫紐西蘭白兔，在免疫前收集免疫前血 清.在加強免疫之後，處死白兔，收集血清，用於蛋白質印跡法、ELISA 和動物保護模型.
使用獲自動物研究的血清，進行免疫吸附研究。
B組鏈球菌在20ml Todd - Hewitt氏鏈球菌肉湯(THB)中培養8小時， 收集後再懸浮於5ml PBS中。在96孔平板(Nunc免疫-吸附)中，用50 Pl等分試樣覆蓋加樣孔，在4t:放置過夜以吸收細菌到平板上。用GBS 洗平板兩次，然後在37"C下用加入3%BAS的PBS封閉1小時。再次洗滌 平板。在PBS中製得連續10倍的血清稀釋液且50 M 1稀釋液被加到平板 的孔中， 一式兩份.蓋上平板並在37C培養1小時.洗滌平板，然後在
7每個孔中加入濃度為1:5000的50n 1抗M性磷酸酶綴合的第二抗體. 在37t:培養l小時後，再次洗滌平板.把50m1底物(PNPP)加入毎個孔， 在405咖處讀取吸收度前反應30min.
進行動物保護研究，檢驗保護作用對免疫接種兔的有效性，
GBS M732在T朋中培養，直至對數中期，約需5小時，在計數室中 進行細胞計數，在免疫前或試驗血清中稀釋細菌濃度至2x107ml.取50 P 1通過 內途徑注射入出生0- 1天的小鼠，在48小時內觀察小鼠的 存活狀況，
下面的實施例闡述了本發明.
實施例1
第一個質粒陂稱為MS4。克隆的DNA片殺:被測序，核苷酸和推斷的氨 基酸序列(SEQ ID NO. 1和2)被用於檢索蛋白質資料庫.
可在產氣莢膜梭菌、流感嗜血菌、淡黃奈瑟氏球菌和Thermatoga maritima中鑑定GBS MS4基因產物的同源物。在所有的情況下同源物都 是鳥氨酸轉氨甲醯酶(OCT)的基因.在真核體系中這種酶催化尿素循環的 第二步反應-鳥氨酸轉化為瓜氨酸，該反應需氨甲醯磷酸.在原核生物 中，ODC是與精氨酸脫氨酶活性有關的三種酶之一-保護細菌不受酸侵 蝕。尤其，ODC有助於瓜氨酸轉為鳥氨酸和氨甲晚磷酸(與真核生物中的 相反的作用)(Casiano—colon, A and Marquis, R. E. 1998. Ap pi. Environ. Microbiol. 54:1318- 1324, Cunin， R.等人1986. Microbiol. Rev. 50:314-352)。
如上所述進行了動物保護研究。結果如下
處理 幼犬數 在時間點(hrs)存活的幼犬數
24 48
PBS15 6 0
免疫前41 18 1
試驗 41 33 14 實施例2
8第二個質M稱為MSll.核苷酸和推斷的tt酸序列(SEQ ID NOS. 3 和4)被用於檢索蛋白質資料庫.
GBS MS11基因產物的同源物可在德氏乳桿菌，海棲熱袍菌，丙酮丁 醇梭菌，巨大芽孢桿菌，Tritic咖aestivi咖和集胞藍細菌PCC6803中 被鑑定。
在所有的情況下同源物都是磷酸甘油激活酶(PGK)蛋白質的基因.PGK 是糖酵解途徑中的主要酶，與甘油醛3-磷酸-轉變為磷酸烯醇丙酮酸的 反應有關.尤其，與甘油酸-1,3-二磷酸與3-磷酸-甘油酸之間反應 的催化作用有關，在向前的反應中釋放一個磷酸。
實施例3
第三個質敉陂稱為pMS16。 5，和3'末端克隆DNA片段被測序且5，端 片段的核苷酸和推斷的^^列被顯示於SEQ ID NOS. 5和6, 3'端片 段的核苷酸和推斷的g酸序列被顯示於SEQ ID NOS. 7和8.
GBS MS16基因戶物的同源物可以在嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢杆 菌和生殖道枝原體中被筌定。
在所有的情況下同源物都是編碼葡萄糖_ 6 -褲酸異構酶(GPI)蛋白 質的基因。
葡萄糖-6 -磷酸異構酶催化糖酵解(G6P到F6P)和糖異生(F6P到G6P) 過程中的葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸之間的反應，已證明gpi基 因中的突變賦予生物體嘌呤類似物敏感性.
實施例4
第四個質M稱為pMS14。克隆的DNA片段被測序，核苷酸和推斷的 氨基紗列(SEQ ID N0.9和IO)被用於檢索蛋白質資料庫。
GBS MS14基因產物的同源物可在嗜熱脂肪芽孢桿菌，Mus musculus， Bos taurus和玉米中被筌定。在所有的情況下同源物均為嘌呤核苷磷酸 酶(PNP)蛋白質的基因。此酶的作用是在正磷酸存在時切割鳥嘌呤核苷或 肌苷成為其各自的鹼基和糖-1 -磷酸分子.
實施例5第五個質M稱為pMS10.克隆的DNA片^:被測序，核苷酸和推斷的 胺基酸序列(SEQ ID NO. 11和12)被用於檢索蛋白質資料庫。
GBS MS10基因產物的同源物可在變異鏈球菌，Nicotiana Pl咖b， Pis咖sati v咖和玉米中被筌定.在所有的情況下同源物都是非磷酸化， NADP-依賴性甘油醛-3-磷酸脫氫酶(NPGAP - 3 - DH)蛋白質的基因. NPGAP-3-DH已被報導作為在變異鏈球菌中產生NADPH用於生物合成反 應的重要工具(與符合糖酵解途徑要求的NAD-特異性GAP-3-ffl相 反)(Boyd， D.A.， Cvitkovitch, D. G.和Hamilton, I.R 1995細菌學雜 志.177:2622-2727).序列表
Microscience Limited
外表面蛋白質及其基因和用途 REP05969WO

12
Patentln Ver. 2.1
1
1014
DNA
B組鏈球菌

CDS
(1) * (1014)
1
atg aca caa gta ttt caa gga cgt agt ttc tta gca gaa saa gat ttt 48
Met Ttir Gin Val Phe Gin Gly Arg Ser Phe Leu Ala Glu Lys Asp Phe 15 10 15
tct cgt gag gaa ttt gaa tat ctt att gat ttt tea get cat tta aaa 96 Ser Arg Glu Glu Phe Glu Tyr Leu工le Asp Phe Ser Ala His Leu Lys 20 25 30
gac ctt Asp Leu
Ijys 35
Lys
cgt Arg
ggt Gly
gtt Val
cct Pro 40
cat His
est His
Tyr
ctt Leu
gaa Glu 45
ggt Gly
333
Lys
33t
Asn
144
att get lie Ala 50
etc Leu
tt3
Leu
ttt Phe
gaa Glu
333
Lys 55
Thr
tct Ser
3Ct
Thr
cgt Arg
act Thr 60
cgc Arg
gca Ala
gec Ala
ttt Phe
192
3C3 3Ct
Thr Thr 65
Al3 Al￡l
att gac lie Asp 70
eta Leu
ggc Gly
get Ala
cat His
ccg Pro 75
gaa Glu
tac Tyr
ctt lieu
ggt Gly
gca Ala 80
240
ast gat Asn Asp
att csa lie Gin
ctt ggt Leu Gly 85
333
333
Lys
gaa Glu
tC3
Ser 90
Thr
gaa Glu
gat Asp
act Thr
get Ala 35
sag Ijys
288
11gtt tta gga Val Leu Gly
aga atg gtt Arg Met Val 115
ggt tta aca Gly Leu Thr 130
act 這tc aaa Thr lie Lys
tgt ggt gac Cys Gly Asp
act ttg atg Thr Leu Met
ccw get gaa Xaa Ala Glu
ggg get cac Gly Ala His 210
gca gac gtc Ala Asp Val 225
aag ttc aaa Iiys Phe Iiys
gaa ctg att Glu Leu lie
tta cct gca Leu Pro Ala 275
cgt 3tg ttt Arg Met Phe 100
gaa g這g ctt Glu Glu Leu
gat gaa tgg Asp Glu Trp
gas sac ttc Glu Asn Phe 150
gga cgt aac Gly Arg Asn 165
ggg gtc aat Gly Val Asn 180
gag att gtt Glu lie Val
gtt etc gtt Val Leu Val
ttt tac act Phe Tyr Thr 230
gaa cgc gtt Glu Arg Val 245
aaa aaa get Iiys Ijys Ala 260
ttc cat gat Phe His Asp
gat ggt att Asp Gly 工le 105
get gas ttt Ala Glu Phe 120
cat CC3 aca
His Pro Thr 135
ggt siaa ctt
Gly Lys Leu
sat gtt gec Asn Val Ala
gta cac ate Val His lie 185
aaa ttg get Ijys Leu Ala 200
act gat aat
Thx Asp Asn 215
gat gtc tgg
Asp Val Trp
gas ctt ctt Glu 3Jeu Leu
33t aat gat Asn Asn Asp 265
aC3 33t 3CC
Thr Asn Thr 280
gaa ttc cgt Glu Phe Arg
tct gga gta Ser Gly Val
caa atg eta Gin Met Leu 140
gaa ggt att Glu Gly工le 155
33c teg ctt Asn Ser Leu 170
ttt tct cca Phe Ser Pro
gaa gga tat Glu Gly Tyr
gta gac gaa Val Asp Glu 220
gta teg atg Val Ser Met 235
C33 CC3 t3t
Gin Pro Tyr 250
aat ctt ate Asn Leu lie
gtt tat ggc val Tyr Gly
ggt ttt age Gly Phe Ser 110
cct gtc tgg Pro Val Trp 125
get gac tac Ala Asp Tyr
act ctt gtt Thr I*eu Val
tta gtg get Leu Val Ala 175
aaa gaa ctt Lys Glu Leu 190
gec aaa gaa Ala Lys Glu 205
get gta sag Ala Val Lys
gga gaa gaa Gly Glu Glu
caa gta aac Gin Val Asn 255
ttc tta cac Phe Leu His 270
aaa gac gtc Lys Asp Val 285
caa 336 Gin
aat 384 Asn
ctt 432 Leu
tac 480
Tyr
160
ggg 528 Gly
tty 576
tct 624
gg3 672 Gly
gat 720
Asp
240
stg 768 Met
tgc 816 Cys
get 864 Alagaa Glu
333
Lys 230
ttt ggg gtc aag Phe Gly Val l<ys
gaa atg gaa gtt act gat gaa gtc ttc cgt Glu Met Glu Val Thr Asp Glu Val Phe Arg 295 300
912
age aaa tat get cgt cat Ser Lys Tyr Ala Arg His 305 310
ttc gac caa get gaa aat cgt atg cac act Phe Asp Gin Ala Glu Asn Arg Met His Thr 315 320
960
att aaa get gta atg get gca acc ctt gga aat ctt ttc att cca aaa lie Lys Ala VaJL Met Ala Ala Thr Leu Gly Asn Leu Phe lie Pro Lys 325 330 335
1008
gtt taa Val
1014
2
337
PRT
B組鏈球菌
2
Met Thr Gin Val Phe Gin Gly Arg Ser Phe Leu Ala Glu Lys Asp Phe 15 10 15
Ser Arg Glu Glu Phe Glu Tyr Leu lie Asp Phe Ser Ala His Leu Lys 20 25 30
Asp Leu Lys Lys Arg Gly Val Pro His His Tyr Leu Glu Gly Lys Asn 35 40 45
lie Ala l<eu Leu Phe Glu Lys Thr Ser Thr Arg Thr Arg Ala Ala Phe 50 55 60
Thr Thr Ala Ala lie Asp Leu Gly Ala His Pro Glu Tyr Leu Gly Ala 65 70 75 80
Asn Asp lie Gin Leu Gly Lys Lys Glu Ser Thr Glu Asp Thr Ala Lys 85 90 95
Val Leu Gly Arg Met Phe Asp Gly 100
Arg Met Val Glu Glu Leu Ala Glu
115 120
Gly Leu Thr Asp Glu Trp His Pro
lie Glu Phe Arg Gly Phe Ser Gin 105 110
Phe Ser Gly Val Pro Val Trp Asn 125
Thr Gin Met Leu Ala Asp Tyr Leu130
135
140
Thr lie Lys Glu Asn Phe Gly Lys Leu Glu Gly lie Thr Leu Val Tyr 145 150 155 160
Cys Gly Asp Gly. Arg Asn Asn Val Ala Asn Ser Leu Leu Val Ala Gly 165 170 175
Thr Leu Met Gly Val Asn Val His lie Phe Ser Pro Lys Glu Leu Phe 180 185 190
Xaa Ala Glu Glu lie Val Lys Leu Ala Glu Gly Tyr Ala Lys Glu Ser 195 200 205
■Gly Ala His Val Leu Val Thr Asp Asn Val Asp Glu Ala Val Lys Gly 210 215 220
Ala Asp Val Phe Tyr Thr Asp Val Trp Val Ser Met Gly Glu Glu Asp 225 230 235 240
Lys Phe Lys Glu Arg Val Glu Leu Leu Gin Pro Tyr Gin Val Asn Met 245 250 255
Glu Leu lie l ys Lys Ala Asn Asn Asp Asn Leu lie Phe Leu His Cys 260 26$ 270
Leu Pro Ala Phe His Asp Thr Asn Thr Val Tyr Gly Lys Asp Val Ala 275 280 285
Glu Lys Phe Gly Val Lys Glu Met Glu Val Thr Asp Glu Va工Phe Arg 230 295 300
Sex: Lys Tyr Ala Arg His Phe Asp Gin Ala Glu Asn Arg Met His Thr 305 310 315 320
lie Lys Ala Val Met Ala Ala Thr Leu Gly Asn Leu Phe lie Pro Lys 325 330 335
Val
3
1197
DNA
B組鏈球菌

14 CDS
(1) (1197)
3
atg get aaa ttg act gtt aaa gac
Met Ala Lys Leu Thr Val l ys A^p 1 5
gtt gat ttg aag gta aaa aaa gtc 48 Val Asp Leu Lys Val Lys Lys Val 10 15
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144
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192
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240
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288
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336
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384
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720
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768
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Gly
gaa Glu
864
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gaa ggg Glu Gly
ttc ctt Phe lieu 295
ggt ctt Gly Leu
Asp
ate lie
ggt cct Gly Pro 300
333
Lys
tC3
Ser
3tC
lie
912
get aaa ttt gat gaa gca ctt act ggt get aaa aca gtt gta tgg aac Ala Lys Phe Asp Glu Ala Leu Thr Gly Ala Lys Thr Val Val Trp Asn 305 310 315 320
960
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1008
ggt gta atg gac get ate gtt aaa caa cca ggc gtt aaa tea ate ate Gly Val Met Asp Ala lie Val Lys Gin Pro Gly Val Lys Ser lie lie 340 345 350
1056
ggt ggt ggt gat tea gca gca get get ate aac ctt ggt cgt get gac 1104 Gly Gly Gly Asp Ser Ala Ala Ala Ala lie Asn Leu Gly Arg Ala Asp 355 360 365
16aaa ttc tea tgg ate tct act ggt ggt gga gca age atg gaa ttg etc 1152 Lys Phe Ser Trp lie Ser Thr Gly Gly Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu 370 375 380
gaa ggt aaa gta tta cca ggt ttg gca gca ttg act gaa aaa taa 1197 Glu Gly Lys Val Leu Pro Gly Leu Ala Ala. Leu Thr Glu Lys 385 390 395

4
398 PRT
B組鏈球菌
4 ' .
Met Ala Lys Leu Thr Val Lys Asp Val Asp Leu Lys Val Lys Lys Val 1.5 10 15
Leu Val Arg Val Asp Phe Asn Val Pro Leu Lys Asp Gly Val lie Thr 20 25 30
Asn Asp Asn Arg lie Thr Ala Ala Leu Pro Thr lie Lys Tyr lie lie 35 40 45
Glu Gin Gly G;y Arg Ala lie Leu Phe Ser His Leu Gly Arg Val Lys 50 55 60
Glu Glu Ala Asp Lys Glu Gly Lys Ser Leu Ala Pro Val Ala Ala Asp 65 70 75 80
Leu Ala Ala Lys Leu Gly Gin Asp Val Val Phe Pro Gly Val Thr Arg 85 90 35
Gly Ala Lys Leu Glu Glu Ala lie Asn Ala Leu Glu Asp Gly Gin Val
100
105 110
Leu Leu Val Glu Asn Thr Arg Phe Glu Asp Val Asp Gly Lys Lys Glu
115
120 125
Ser Lys Asn Asp Glu Glu Leu Gly Lys Tyr Trp Ala Ser Leu Gly Asp 130135 "0
Gly lie Phe Val Asn Asp Ala Phe Gly Thr Ala His Arg Ala His Ala 145 150 155 160
Ser Asn Val Gly lie Ser Ala Asn Val Glu Lys Ala Val Ala Gly Phe
165 170 175formula see original document page 18
CDS
(1) *(516)
5
atg aca cat att aca ttt gac tta Met Thr His lie Thr Phe Asp Leu
ttc aias Phe Lys 10
gtc ttg ggt Val Leu Gly
Gin
ttt Phe 15
gta Val
48
ggc gaa cac gag tta gac tac eta cca cca caa gta agt gca gca gat Gly Glu His Glu Leu Asp Tyr L*eu Pro Pro Gin Val Ser Ala Ala Asp 20 25 30
96
get ttc ctt cgt caa ggg act ggt cct gga tea gat ttt etc gga tgg Ala Phe Leu Arg Gin Gly Thr ply Pro Gly Ser Asp Phe Leu Gly Trp 35 40 45
144
atg gaa cct cca gaa aac tat gac aaa gaa Met Glu Pro Pro Glu Asn Tyr Asp Lys Glu 50 55
gaa ttt tct cgc att caa Glu Phe Ser Arg lie Gin 右O
192
aaa gec get gaa aag att aaa tea gat age gaa gta etc gtg gtt att Lys Ala Ala Glii Lys工le Lys Ser Asp Se^r Glu Val Leu Val Val lie 65 "70 75 80
240
ggt att ggt ggt teg tac ctt ggt gca aaa Gly lie Gly Gly Ser Tyr Leu Gly Ala liys 85 90
gca gca att gac Ala Ala lie Asp
ttt Phe 95
ttg lieu
288
aat aat cat ttt get aat ttg caa acc gca Asn Asn His Phe Ala Asn Leu Gin Thr Ala 100 105
gaa gaa cgt Glu <3lu Arg
33a 乙ys 110
Ala
cct Pro
336
cag att ctt t3t Gin lie Leu Tyr 115
get gga aat tct att tea tct act tac ctt gec gat Ala Gly Asn Ser lie Ser Ser Thr Tyr Leu Ala Asp 120 125
384
tta gtt gaa tac Leu Val Glu Tyr 130
gtc caa gat aaa gaa ttc tea gta aat gtc att tea Val Gin Asp Lys Glu Phe Ser Val Asn Val lie Ser 135 140
432
aaa tea ggt aca liys Ser Gly Thr 145
aca act gaa cca gcg att get ttc cgt gta ttt aaa Thr Thr G工u Pro Ala lie Ala Phe Arg Va工 Phe Lys 150 155 160
480
gaa ctt eta gtt aaa aag tac egg tea aga aga age Glu Leu l#eu Val Lys Lys Tyr Arg Ser Arg Arg Set
516
19165 170
6
172
PRT
B組鏈球菌
6
Met Thr His IJ^e Thr Phe Asp Leu Phe Lys Val Leu Gly Gin Phe Val
1 . . 5. 10 15 .
Gly Glu His Glu Leu Asp Tyr Leu Pro Pro Gin Val Ser Ala Ala Asp 20 25 30
Ala Phe Leu Arg Gin Gly Thr Gly Pro Gly Ser Asp Phe I>eu Gly Trp 35 40 45
Met Glu Pro Pro Glu Asn Tyr Asp Lys Glu Glu蟲he Ser Arg lie Gin 50 55 60
Lys Ala Ala Glu Lys lie Lys Ser Asp Ser Glu Val Leu Val Val lie 65 70 75 80
Gly lie Gly Gly Ser Tyr Leu Gly Ala Lys Ala Ala lie Asp Phe Leu 85 90 95
Asn Asn His Phe Ala Asn Leu Gin Thr Ala Glu Glu Arg Lys Ala Pro 100 105 110
Gin lie Leu Tyr Ala Gly Asn Ser lie Ser Ser Thr Tyr Leu Ala Asp
115
120 125
Leu Val Glu Tyr Val Gin Asp Lys Glu Phe Ser Val Asn Val lie Ser
130
135 140
Lys Ser Gly Thr Thr Thr Glu Pro Ala lie Ala Phe Arg Val Phe Lys
145 150
155 160
Glu Leu Leu Val Lys Lys Tyr Arg Ser Arg Arg Ser
165
170
7
318
DNA
B組鏈球菌
CDS
(1)(318)
7 att 3ac lie Asn
cga aga ttt aga tgg tct tgg tta tct tea aga aaa gat gta Arg Arg Phe Arg Trp Ser Trp Leu Ser Ser Arg Lys Asp Val 5 10 15
48
Asp
ttt Phe
gtt Val
sat 20
333
333
gca Ala
Thr
Asp 25
ggt gtg ctt ctt Gly Val Leu Leu
get cat Ala His 30
Thr
96
gat ggt ggg gtt cca aat atg ttt gta acg ctt cct aca caa gac get Asp Gly Gly Val Pro Asn Met Phe Val Thr Leu Pro Thr Gin Asp Ala 35 40 45
144
tac act ctt ggt tac act att tac ttc ttt gag tta gca att ggc ctt Tyr Thr Leu Gly Tyr Thr lie Tyr Phe Phe Glu Leu Ala lie Gly Leu 50 55 60
192
tea ggt tat ctt aac tea gta aat cca ttt gat caa ccg ggg gta gaa Ser Gly Tyr Leu Asn Ser Val Asn Pro Phe Asp Gin Pro Gly Val Glu 65 70 75 80
240
gca tat aaa cgt aat atg ttc gca ttt ggt aaa cct gga ttc gaa gag Ala Tyr Lys Arg Asn Met Phe Ala Phe Gly Lys Pro Gly Phe Glu Glu 85 90 95
288
ctt lieu
age get gaa Ser Ala Glu 100
ttg aat gca cgt Leu Asn Ala Arg
ctt Leu 105
318
8
105
PRT
B組鏈球菌
8
lie Asn Arg Arg Phe Arg Trp Ser Trp Leu Ser Ser Arg Lys Asp Val 15 10 15
Asp Phe Val Asn Lys Lys Ala Thr Asp Gly Val Leu Leu Ala His Thr 20 25 30
Asp Gly Gly Val Pro Asn Met Phe Val Thr Leu Pro Thr Gin Asp Ala35 40 45
Tyr Thr Leu Gly Tyr Thr lie Tyr Phe Phe Glu Leu Ala lie Gly Leu 50 55 60
Ser Gly Tyr Leu Asn Ser Val Asn Pro Phe Asp Gin Pro Gly Val Glu 65 70 75 80
Ala Tyr Lys Arg Asn Met Phe Ala Phe Gly Lys Pro Gly Phe Glu Glu
85 90 95
Leu Ser Ala Glu Leu Asn Ala Arg Leu 100 105


9
804 DNA
B組鏈球菌
CDS
(1) -(804)
atg aca Met Thr
tta tta gaa aaa att aat gag act aga gac ttt ttg Leu Leu Glu Lys lie Asn Glu Thr Arg Asp Phe Leu 5 10
333 ggc Lys Gly
ggs gaa Gly Glu
gac ate Asp lie 50
ttt agt Phe Ser 65
gtc Val
ttg l*eu 35
ccm Xaa
gta Val
aca gca cca gaa ttt ggy ctt att tta ggc tct Thxr Ala Pro Glu Phe Xaa I*eu lie Leu Gly Ser 20 25 30
get gaa gaa ate gaa aat cc(t att gtt gtg gat Ala Glu Glu lie Glu Asn Pro lie Val Val Asp 40 45
aat tgg gga cag tea aca gta gtt ggt cat get Asn Trp Gly Gin Ser Thxr Val Val Gly His Ala 55 60
tgg gat tta tea ggc cgt aag gta tta gcg ctt Trp Asp Leu Ser Gly Arg Lys Val Leu Ala Leu 70 75
C33
Gin 15
Gly
Tyr
gga Gly
C33
Gin
gca 48 Ala
tta 96 Leu
gca 144 Ala
333 192 Lys
ggt 240 Gly 80
cgt ttt cat ttt tay gaa ggw aat aca atg gaa gtc gtt act ttc cca 288 Arg Phe His Phe Tyr Glu Xaa Asn Thr Met Glu Val Val Thr Phe Pro85
90
95
gta cgt ate Val Arg lie
這tg sga gca ttg get Met Arg Ala Leu Ala 100
tgc cac agt gtg ctt gtg act aat Cys His Ser Val Leu Val Thr Asn 105 110
336
gca gcg ggt Ala Ala Gly 115
ggg att gga tac gga Gly lie Gly Tyr Gly 120
cca gga act tta atg ctg ate aaa Pro Gly Thr Leu Met Leu lie Lys 125
384
gac cac ate Asp His lie 130
aat atg att ggg act aac cct etc ata ggt gag aac ctt Asn Met工le Gly Thr Asn Pro Leu lie Gly Glu Asn Leu 135 140
432
gaa gaa ttt Glu Glu Phe 145
gga cca cgt ttc cesi Gly Pro Arg Phe Pro 150
gac atg teg get tay aca gca
Asp Met Ser Asp Ala Tyr Thr Ala 155 160
480
aca tat cga Thr Tyr Arg
C33 333
Oln Lys 165
get cac ess Ala His Gin
att get gaa aac gat ate aaa etc lie Ala Glu Asn Asp lie I*ys Leu 170 175
528
gaa gaa ggt gtg tac Glu Glu Gly Val Tyr 180
ttg ggt gt3 Leu Gly Val
tea gga ccc act tat gaa aca cct Ser Gly Pro Thr Tyr Glu Thr Pro 185 190
576
gca gaa 3tt cgt gca Ala Glu lie Arg Ala 195
ttC 3C3
Phe Gin Thr 200
stg ggc gca caa gcg gta ggt atg Met Gly Ala Gin Ala Val Gly Met 205
62 4
tec aqg gtt cca gag gtg ate gtt Ser Thr VaJL Pro Glu Val lie Val 210 215
gca get cac tea ggg ctt 3aa gtg Ala Ala His Ser Gly Leu Lys Val 220
672
tta gga att tea gca att act aac Leu Gly lie Ser Ala lie Thr Asn 225 230
ctt gec get ggc ttc caa tea gag Leu Ala Ala Gly Phe Gin Ser Glu 235 240
720
etc aat C3t gag gag gtc gtt gaa gtt act cag cgt att aaa gaa gat Leu Asn His Glu Glu Val Val Glu Val Thr Gin Arg lie Lys Glu Asp 245 250 255
768
ttc aag gga tta ggt aaa tea tta gtt get gaa etc Phe Lys Gly Leu Gly Lys Ser Leu Val Ala Glu Leu 260 265
804
10
23 268 PRT B組鏈球菌
10
Met Thr Leu Leu Glu Lys lie Asn Glu Thr Arg Asp Phe Leu Gin Ala 1.5 10 15
Lys Gly Val Thr Ala Pro Glu Phe Xaa Leu lie Leu Gly .Ser Gly Leu 20 25 30
Gly Glu Leu Ala Glu Glu lie Glu Asn Pro lie Val Val Asp Tyr Ala 35 40 ' 45
Asp lie Xaa Asn Trp Gly Gin Ser Thr Val Val Gly His Ala Gly Lys 50 55 60
Phe Ser Val Trp Asp 一eu Ser Gly Arg Lys Val Leu Ala Leu Gin Gly 65 70 75 80
Arg Phe His Phe Tyr Glu Xaa Asn Thr Met Glu Val Val Thr Phe Pro 85 90 95
Val Arg lie Met Arg Ala Leu Ala Cys His Ser Val Leu Val Thr Asn 100 105 110
Ala Ala Gly Gly lie Gly Tyr Gly Pro Gly Thr Leu Met Leu lie Lys 115 120 125
Asp His 工le Asn Met lie Gly Thr Asn Pro Leu lie Gly Glu Asn Leu-130 135 140
.Glu Glu Phe GJLy Pro Arg Phe Pro Asp Met Ser Asp Ala Tyr TJir Ala 145 150 155 160
Thr Tyr Arg Gin Lys Ala His Gin lie Ala Glu Asn Asp lie Lys Leu 165 1"70 175
Glu Glu Gly Val Tyr Leu Gly Val Ser Gly Pro Thr Tyr Glu Thr Pro 180 185 190
Ala Glu lie Arg Ala Phe Gin Thr Met Gly Ala Gin Ala Val Gly Met 135 200 205
Ser Thr Val Pro Glu Val lie Val Ala Ala His Ser Gly Leu Lys Val 210 215 220
Leu Gly lie Ser Ala lie Thr Asn Leu Ala Ala Gly Phe Gin Ser Glu
24225
230
235
240
Leu Asn His Glu Glu Val Val Glu Val Thr Gin Arg lie Lys Glu Asp 245 250 255
Phe Lys Gly Leu Gly Lys Ser Leu Val Ala Glu Leu 260 265
11
1428
DNA
B組鏈球菌
<222〉
CDS (1),
《1428)
ttg Leu
11 Thr Lys
gaa Glu
tat caa aat tat gtc Tyr Gin Asn Tyr Val
aat ggc Asn Gly 10
gaa tgg Glu Trp
333
Lys
tea Ser 15
tct Ser
48
gtt Val
33t
Gin
3tt
lie 20
gag att ttg tea Glu lie Leu Ser
CC3
Pro 25
3tt gat 工le Asp
gat tct Asp Ser
tC3
Ser 30
ttg Leu
Gly
96
tte gtg cca gcg atg act cga gaa gaa gtt gat cat get atg aaa gcg Phe Val Pro Ala Met Thr Arg Glu Glu Val Asp His Ala Met Lys Ala 35 40 45
144
ggt cgt gag get tta cca get tgg get get tta aca gta tat gaa cgt Gly Arg Glu Ala Leu Pro Ala Trp Ala Ala Leu Thr Val Tyr Glu Arg 50 55 60
192
gca caa tac ctt cat aaa gec gca gac att att gaa cgt gat aaa gaa Ala Gin Tyr Leu His Lys Ala Ala Asp lie lie Glu Arg Asp Lys Glu 65 70 75 80
240
gaa att get act gtt tta gca aaa gaa att tct aaa get tac aat get Glu lie Ala Thr Val Leu Ala Lys Glu lie Ser Lys Ala Tyr Asn Ala 85 30 95
288
tea gta set Ser Val Thr
gag gtt gta agg aca get gat ctt att cgt tat gca gca Glu Val Val Arg Thr Ala Asp Leu lie Arg Tyr Ala Ala 100 105 110
336gaa gaa gga att cgt tta tea act tea get gac gaa ggt gga aaa atg G1U Glu Gly lie Arg Leu Ser Thr Ser Ala Asp Glu Gly Gly Lys Met 115 120 125
384
gat get tea aca ggt cat aag ttg get gtt att cgt cgt caa cca gta Asp Ala Ser Thr Gly His Lys Leu Ala Val工le Arg Arg Gin Pro Val 130 135 140
432
ggt ate gtt tta gca ate gca cct tat aat tac cct gtt aac etc tea Gly lie Val Leu Ala lie Ala Pro Tyr Asn Tyr Pro Val Asn Leu Ser 145 150 155 160
480
gga tea Gly Ser
333
att gcg 工le Ala 165
cca get eta att Pro Ala Ijeu lie
ggt
Gly 170
Gly
d3C
Asn
gtt Val
gtg
Val
atg Met 175
ttt Phe
528
aaa cca cca aca caa ggt tea gtc tea gga ctt gtt tta gca aaa get Iiys Pro Pro Thr Gin Gly Ser Val Ser Gly Leu Val I*eu Ala Lys Ala 180 185 190
576
ttt gca gaa gca ggt ctt cca gca ggt gtc ttt aat act att aca gga Phe Ala Glu Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val Phe Asn Thr lie Thr Gly 195 200 205
624
cgc ggt tct gag att gga gat tac att gtt gag cat gaa gaa gtt aat Arg Gly Ser Glu lie Gly Asp Tyr lie Val Glu His Glu Glu Val Asn 210 215 220
6*72
ttt att sac ttt aca gga tea acg cca gtt gga caa cgt att ggt aag Phe lie Asn Phe Thr Gly Ser Thr Pro Val Gly Gin Arg lie Gly Lys 225 230 235 240
720
ttg gca
gga Gly
atg cgt Met Arg 245
cca att atg ctt Pro lie Met Leu
gag Glu 250
ttg Leu
ggc Gly
ggt
Gly
aag Lys
gat
Asp 255
gca Ala
768
ggt ate gtc tta get gat get gac ctt gat aac get get aaa caa ate Gly lie Val Leu Ala Asp Ala Asp Leu Asp Asn Ala Ala Lys Gin lie 260 265 270
816
gtt gca ggt get tat gat tac tct gga caa cgc tgt acg gca att aag Val Ala Gly Ala Tyr Asp Tyr Ser Gly Gin Arg Cys Thr Ala lie Lys 275 280 285
864
cgt gtg ctt gtc gtt gaa gaa gtt gew gat gaa ttg gca gaa aaa ata Arg Val Leu Val Val Glu Glu Val Xaa Asp Glu Leu Ala Glu Lys lie 230 295 300
912tct gaa aat gta gca aaa tta tea gta ggt gat cca ttt gat aat gca 960 Ser Glu Asn Val Ala Lys Leu Ser Val Gly Asp Pro Phe Asp Asn Ala 305 310 315 320
ac^ gtg aca Thr Val Thx:
ccg gtt att gat gat aat tea get gac ttt att gaa age Pro Val lie Asp Asp Asn Ser Ala Asp Phe lie Glu Ser 325 330 335
1008
tta gta gta gat gca cgt Leu Val Val Asp Ala Arg 340
aaa cgt gat ggt cgt eta Lys Arg Asp Gly Arg Leu 355
tta gat atg aaa eta get Leu Asp Met Lys lieu Ala 370
caa aaa ggt gcg aaa gaa G丄n Lys Gly Ala Iiys Glu 345
tta act cca gga ttg ttt Leu Thr Pro Gly Leu Phe 360
tgg gaa gag cet ttt gga Trp Glu Glu Pi:o Phe Gly 375 380
ttg aat gaa ttt 1056 Leu Asn Glu Phe 350
gat cat gtt act 1104 Asp His Val Thr
cca att etc cca 1152 Pro lie Leu Pro
att att cgt gtc aag gat gca gaa gaa lie lie Arg Val Lys Asp Ala Glu Glu 385 390
tct gat ttt gga tta caa tea tea gtc Ser Asp Phe Gly Leu Gin Ser Ser Val 405
gca ttt gat ata gca aat aaa ctt gaa Ala Phe Asp lie Ala Asn Lys Leu Glu 420 425
get gtt get att gec aac aaa 1200 Ala Val Ala lie Ala Asn Lys 395 400
ttt aca cgt gat ttc caa aaa 1248 Phe Thr Arg Asp Phe Gin Lys "0 415
gtt ggt aca gtt cac att.aac 1296 Val Gly Thr Val His lie Asn 430
aat aag act gga cgt ggt ccw gat aat ttc cca ttc tta Asn Lys Thr Gly Arg Gly Xaa Asp Asn Phe Pro Phe Leu 435 440 445
gga etc aaa Gly Leu Lys
1344
gga tct ggt gca ggt gtt caa ggt ate aga GJLy Ser Gly Ala Gly Val Gin Gly lie Arg 450 455
tat tea att Tyr Ser lie 460
gaa gca atg Glu Ala Met
1392
aca aat gta aaa tcg att gtt etc gat atg aaa tag 1428 Thj: Asn Val Lys Ser lie Val Leu Asp Met Lys 465 470 475
12 475 PRT B組鏈球菌
12
Leu Thr Lys Glu Tyr Gin Asn Tyr Val Asn Giy Glu Trp Lys Ser Ser 1 5 10 . 15
Val Asn Gin lie Glu lie Leu Set Pro lie Asp Asp Ser Ser Leu Gly 20 25 30
Phe Val Pro Ala Met Thr Arg Glu Glu Val Asp His Ala Met .Lys Ala 35 40 45
Gly Arg Glu Ala Leu Pro Ala Trp Ala Ala Leu Thr Val Tyr Glu Arg 50 55 60
Ala Gin Tyr Leu His Lys Ala Ala Asp lie lie Glu Arg Asp Lys Glu 65 70 75 80
Glu lie Ala Thr Val Leu Ala Lys Glu lie Ser Lys Ala Tyr Asn Ala 85 90 95
Ser Val Thr Glu Val Val Arg Thr Ala Asp Leu工le Arg Tyr Ala Ala 100 105 110
Glu Glu Gly lie Arg Leu Ser Thr Ser Ala Asp Glu Gly Gly Lys Met 115 120 125
Asp Ala Ser Thr Gly His. Lys Leu Ala Val lie Arg Arg Gin Pro Val 130 135 140
Gly lie Val Leu Ala lie Ala Pro Tyr Asn Tyr Pro Val Asn Leu Ser 145 150 155 160
Gly Ser Lys lie Ala Pro Ala Leu lie Gly Gly Asn Val Val Met Phe 165 170 175
Lys Pro Pro Thr Gin Gly Ser Val Ser Gly Leu Val Leu Ala Lys Ala 180 185 190
Phe Ala Glu Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val Phe Asn Thr lie Thr Gly 195 200 205
Arg Gly Ser Glu lie Gly Asp Tyr lie Val Glu His Glu Glu Val Asn 210 215 220
Phe lie Asn Phe Thr Gly Ser Thr Pro Val Gly Gin Arg lie Gly Lys 225 230 235 240
28formula see original document page 29
權利要求
1. 一種由任一已被鑑定為MS4、MS11、MS14和MS16的可獲自B組鏈球菌的基因所編碼的肽，或與其具有至少60％序列相似性的同源物，或其保持了引發免疫應答的能力的功能性片段。
2. 權利要求l的肽，其中所述同源物與由鑑定為MS4、 MSll、 MS14 或MS16的可獲自B組鏈球菌的基因所編碼的肽具有至少80%的序列相似 性。
3. 根據權利要求1的肽，其任一M酸序列為已確定的SEQ ID N0S, 2, 4， 6， 8和10。
4. 根據權利要求l-3任一項的肽，其用於醫療用途。
5. 編碼權利要求1-3任一項的肽的多核苷酸，其用於醫療用途。
6. —種被轉化以表達權利要求1-3任一項的肽的宿主。
7. 包含權利要求1-3任一項的肽的疫苗，或用於其表達的工具。
8. 權利要求1-6中任一權利要求的產物的用途，用於與細菌感染 相關的疾病治療或預防的藥物的製造。
9. 根據權利要求8的用途，其中的感染是B組鏈球菌感染。
10. 根據權利要求8或9的用途，其中的感染是病灶性感染。
11. 根據權利要求8或9的用途，其中的感染是尿道感染。
12. —種抗權利要求l-3任一項的肽的抗體。
全文摘要
本發明涉及外表面蛋白質及其基因和用途。根據本發明，在B組鏈球菌中鑑定了一系列基因，其產物可能位於生物體的外表面上。該基因或其功能性片段可用於治療物質，例如使患者免受微生物感染的疫苗的製備。
文檔編號C12N9/22GK101486756SQ20081017618
公開日2009年7月22日 申請日期1999年12月22日 優先權日1998年12月22日
發明者C·J·亨伍德, G·杜根, J·C·穆爾, J·D·桑坦格羅, J·D·萊恩, M·J·G·休斯, P·埃弗裡斯特, R·J·多布森, R·K·威爾遜, R·菲爾德曼 申請人:微科學有限公司