針對表皮生長因子受體的缺失突變體的抗體及其使用的製作方法

2023-05-23 22:16:01 2

專利名稱：針對表皮生長因子受體的缺失突變體的抗體及其使用的製作方法
技術領域：
本實施例涉及新穎抗體，尤其涉及針對表皮生長因子受體的缺失突變體的抗體， 而且尤其涉及III型缺失突變體EGFRvIII。本實施例也涉及針對表皮生長因子受體的缺失突變體的人類單克隆抗體，而且尤其為EGFRvIII。本實施例也涉及這些抗體的變體。本發明也提供這些抗體的診斷和治療配方，及其免疫偶聯物。
背景技術：
自上世紀以來，已尋求有助於更好診斷和治療人類和動物癌症的腫瘤特異分子。 除了那些基於病毒誘導癌症並包含由病毒基因規定的分子結構的癌症之外，在大多數類型的人類癌症中，很難提供對基於分子結構資料的腫瘤特異物質的確切證據。極少有關於基於新穎分子結構的腫瘤特異分子的實例。在惡性人類神經膠質瘤和其它與表皮生長因子受體分子的放大或變化潛在相關的腫瘤(諸如乳腺癌和其它人類癌症)的情況下，尚無關於具有獨特序列的結構變化分子的明確論證。表皮生長因子受體(EGFR)是原致癌基因c-erb B的170千道爾頓(kilodalton) 膜糖蛋白產物。已知EGFR基因的序列(Ullrich等人，1984)。"Human Epidermal Growth Factor Receptor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the Amplified Gene in A431 Epidermoid Carcinoma Cells. 」 Nature 309:418-425)。EGFR 基因是最初在鳥類紅細胞增多症病毒中識別的erb B致癌基因的細胞同系物(Downward等人(1984))。 "Close Similarity of Epidermal Growth Factor Receptor and v_erb B Oncogene Protein Sequence. "Nature 307 :521_527，Ullrich 等人(1984)。已在各種人類腫瘤中觀察到這種致癌基因通過基因放大的活化(Haley等人(1987A))。「The Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Oncogenes, Genes, and Growth Factors，，，Guroff, G編，第12版，第2章，第40-76頁，Wiley, N. Y.，且尤其為神經膠質源性的那些表皮生 "K @ S S @ (Libermann 等入，(1985)。 「Amplification， Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin」，Nature 313 :144-147 ；Wong 等人，(1987)。"Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification.，，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :6899-6903 ；Yamazaki 等入，(1988)。 「Amplification of the Structurally and Functionally Altered Epidermal Growth Factor Receptor Gene(c-erbB)in Human Brain Tumors. 」Molecular and Cellular Biology 8 :1816—1820，Maiden 等人，(1988)。 「Selective Amplification of the Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme. 」Cancer Research 4:2711—2714)。
已證實EGF-r在多種類型的人類固體腫瘤中過量表達。Mendelsohn Cancer Cells7 359 (1989), Mendelsohn Cancer Biology 1 :339-344(1990), Modjtahedi and Dean Int' 1J. Oncology 4:277-296(1994)。例如，已在某些肺癌、乳腺癌、結腸癌、胃癌、 腦癌、膀胱癌、頭頸癌、卵巢癌、腎癌和前列腺癌中觀察到EGFR過量表達。Modjtahedi and Dean Int' 1 J. Oncology 4:277-296(1994)。已證實表皮生長因子(EGF)和轉化生長因子-α (TGF- α )都結合至EGF_r，而且導致細胞增殖和腫瘤生長。v-erb B致癌基因和正常EGFR基因之間的一個主要區別在於病毒致癌基因是正常受體截斷氨基的變型；它們缺少大部分細胞質外結構域，但保留了跨膜和酪氨酸激酶 g豐勾_ (Fung ^A, (1984))。 Activation of the Cellular Oncogene c-erb B by LTR Insertion :Molecular Basis for Induction of Erythroblastosis by Avian Leukosis Virus. Cell 33 :357-368 ；Yamamoto 等人』 (1983)。"A New Avain Erythroblastosis Virus, AEV-H Carries erbB Gene Responsible for the Induction of Both Erythroblastosis and Sarcoma. "Cell 34 -.225-232, Nilsen φ 人，(1985) 。 「c_erbB Activation in ALV-Induced Erythroblastosis :Novel RNA Processing and Promoter Insertion Results in Expression of an Amino-Truncated EGF Receptor. ，，Cell 41 :719-726 ；Gammett 等人』 (1986)。"Differences in Sequences Encoding the Carboxy-Terminal Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potential of Viral erbB Genes. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6053-6057)。這導致了不可以結合表皮生長因子(EGF)，但仍可以磷酸化其它物質的蛋白質(Gilmore 的，(1985))。"Protein Phosphorlytion at Tyrosine is Induced by the v-erb B Gene Product in Vivo and In Vitro. Cell 40 :609-618 ；Kris等人，(1985)。 Antibodies Against a Synthetic Peptide as a Probe for the Kinase Activity of the Avian EGF Receptor and v-erB Protein. "Ce 1140 :619-625)，且導致以下推測v_erb B蛋白質為致癌基因性的是因為激酶結構域未經調節且結構上為活性的(Downward等人， 1984)。各種基因變化都可以發生於病毒性erb B致癌基因中，例如，基因的羧基末端中發生胺基酸的取代和缺失。然而，可獲得的證據表明氨基截斷對於致癌作用尤為關鍵。氨基截斷是所有v-erb B致癌基因的一個特徵，包括由啟動子的插入或逆轉錄病毒轉導引起的那些氨基截斷(Nilsen 等人，(1985))。"c-erbB Activation in ALV-Induced Erythroblastosis :Novel RNA Processing and Promoter Insertion Results in Expression of an Amino-Truncated EGF Receptor.，，Cell 41 :719-726 ;Gammett 等人， (1986)0 "Differences in Sequences Encoding the Carboxy-Terminal Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potential of Viral erbB Genes. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6053—6057)。相反，羧基-末端缺失似乎只與由逆轉錄病毒轉導引起的腫瘤有關，而且似乎決定了宿主範圍和腫瘤類型的特異性(Gammett等人，1986 ；Raines等人，(1985)。 「c-erbB Activation in Avian Leukosis Virus-Induced Erythroblastosis Clustered Integration Sites and the Arrangement of Provirus in the c-erbB Alleles. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :2沘7_2四1)。以氨基-截斷鳥類 c_erb B 基因或感染性病毒致癌基因-人類EGF受體的轉染實驗表明該缺失單獨即足以產生轉化蛋白質(Pelley 等人，(1988))。 "Proviral-Activated c-erbB is Leukemogenic but not Sarcomagenic Characterization of a Replication—Competent Retrovirus Containing the Activated c-erbB. "Journal of Virology 62 :1840-1844 ；Wells ^ 入，(1988)。 「Genetic Determinants of Neoplastic Transformation by the Retroviral Oncogene v-erbB. 」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :7597-7601)。EGFR基因的放大發生於40%的惡性人類神經膠質瘤中(Libermarm等人，(1985)。 "Amplification， Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin」，Nature 313 :144-147 ；Wong等人，(1987)/『Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification. nProc. Natl· Acad. Sci. USA 84 :6899-6903)，受體基因的重排在許多具有基因放大的腫瘤中較為明顯。 結構變化似乎優先影響基因的氨基末端一半(Yamazaki等人，(1985)。「Amplification， Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin", Nature 313 :144-147 ；Maiden ^A, (1988)。 「Selective Amplification of the Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme. 」Cancer Research4 :2711-2714)， 但重排的性質當時並未在任何腫瘤中準確表徵。已報導在若干人類癌症中的大小變體EGFR基因和放大(Humphrey等人，(1988))。 "Amplification and Expression of the, Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Human Glioma Xenografts". Cancer Research 48 :2231-2238 ;Bigner 等人，(1988) J. Neuropathol. Exp. Neural. ,47 :191-205 ;Wong 等人，(1987)。"Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6899—6903;禾口 Humphrey等人。表皮生長因子受體基因在人類神經膠質瘤異種移植中的放大和表達， Cancer Res. 48(8) :2231-8 (1988))。然而，尚無關於細胞中經改變EGFR分子的分子基的測定。1989年，Drs. Bigner和Vogelstein的著作說明已知為III型突變體的EGF受體突變體的序列(也稱為δ-EGFr或EGFRVIII)。此著作描述於美國專利第6，455，498號、第 6，127，126 號、第 5，981，725 號、第 5，814，317 號、第 5,710,010 號、第 5,401,828 號和第 5，212，290 號中。EGFR變體是由基因重排伴隨EGFR基因放大而引起的。存在八種主要的EGFr變體，已知為(i)EGFRvI缺少EGFR的大部分細胞外結構域，(ii) EGFRvII由EGFR的細胞外結構域中的83aa框內缺失組成，(iii)EGFRvIII由EGFR的細胞外結構域中的267aa框內缺失組成，(iv) EGFRvIV含有EGFR的細胞質結構域中的缺失，(v) EGFRvV含有EGFR的細胞質結構域中的缺失，(vi)EGFR. TDM/2-7含有EGFR的細胞外結構域中的外顯子2_7的重複， (vii)EGFR. TDM/18-25含有EGFR的酪氨酸激酶結構域中的外顯子18-26的重複，和(viii) EGFR. TDM/18-26含有EGFR的酪氨酸激酶結構域中的外顯子18-26的重複(Kuan等人，EGF 突變體受體vIII在治療癌症中作為分子目標，Endocr Relat Cancer. 8 (2) :83-96 (2001)) 另外，存在第二種更為罕見的具有第二種在外顯子U和14之間的連接點引入新穎組氨酸殘基的缺失的EGFRvIII突變體(EGFRvIII/Δ 12-13) (Kuan等人，EGF突變體受體vIII在治療癌症中作為分子目標，Endocr Relat Cancer. 8 (2) :83-96 (2001)) EGFRvIII是在人類癌症中表皮生長因子(EGF)受體最常見發生的變體(Kuan 等人，EGF突變體受體vIII在治療癌症中作為分子靶標，Endocr Relat Cancer. 8 (2) 83-96(2001))。在基因放大的過程中，在細胞外結構域中發生267個胺基酸缺失，產生腫瘤特異單克隆抗體可指向的新穎連接點。EGF受體的這種變體以配位體獨立的方式有助於腫瘤通過組成型信號發出而發展。已知EGFrVIII未表達於任何正常組織上(Wikstrand， CJ.等人，"Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas.，，Cancer Research 55(14) 3140-3148(1995) ；Olapade-Olaopa, E0.等人「Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer. Br J Cancer. 82(1) :186-94(2000))。然而，EGFRvIII顯示在腫瘤細胞中的顯著表達， 例如，27 76%乳腺癌活組織檢查表達EGFRvIII(Wikstrand，CJ.等人〃 Monoclonal antibodies against EGFRVIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. " Cancer Research 55(14) :3140-3148 (1995) ；Ge H.等人，『『Evidence of high incidence of EGFRvIII expression and coexpression with EGFR in human invasive breast cancer by laser capture microdissection and immunohistochemical analysis. " Int J Cancer. 98 (3) :357-61 (2002)), 50 ~ 70% 神經膠質癌表達 EGFRvIII (ffikstrand, CJ.等人，"Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas.，，Cancer Research 55(14) :3140-3148(1995) ；Moscatello, G.等人，"Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor inmultiple human tumors. " Cancer Res. 55(23) :5536-9 (1,995)), 16 % NSCL 症表達 EGFRvIII (Garcia de Palazzo, IE.等人，"Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell lung carcinomas.，，Cancer Res. 53 (14) 3217-20 (1993))，75%卵巢癌表達 EGFRvIII (Moscatello, G.等人，"Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors. " Cancer Res. 55(23) :5536-9 (1995))。和68%前列腺癌表達 EGFRvIII (Olapade-Olaopa，E0.等人，"Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer. "Br J Cancer. 82(1) : 186-94UOOO))。缺失267個胺基酸並替換為甘氨酸產生可定靶抗體的獨特連接。此外，鑑於 EGFRvIII在某些腫瘤中的表達及其在正常組織中的表達缺乏，EGFRvIII在腫瘤治療中可作為用於定靶藥物的理想靶標。具體而言，EGFRvIII似乎可作為腫瘤免疫偶聯物治療的理想候選物(例如，與抗腫瘤劑或毒素偶聯的抗體)。另一種治療過量表達EGFRvIII的癌症的方法涉及使用特異性定靶至未分離正常EGFR的變體受體的腫瘤特異性核酶。發現核酶在無胸腺裸鼠中顯著抑制乳腺癌生長(Luo等人，Int. J. Cancer. 104(6) :716-21 (2003)) 0 已描述用於整個EGFRvIII蛋白質的通用抗體。見國際專利申請案第WO 01/62931號和Kuan等人，"EGF mutant receptorvIII as a molecular target in cancer therapy·，，Endocr Relat Cancer. 8 (2) 83-96 (2001) ；Kuan 等人，"EGFRvIII as a promising target for antibody-based brain tumor therapy. "Brain Tumor Pathol. 17 (2) :71-78 (2000) ；Kuan 等入， 「Increased binding affinity enhances targeting of glioma xenografts by EGFRvIII-specific scFv. "International Journal of Cancer. 88(6) :962-969(2000)； Landry 等人，"Antibody recognition of a conformational epitope in a peptide antigen :Fv_peptide complex of an antibody fragment specific for the mutant EGF receptor，EGFRvIII.，，Journal of Molecular Biology. 308(5) :883-893(2001)； Reist 等人，「Astatine-211 labeling of internalizing anti-EGFRvIII monoclonal antibody using N-succinimidyl 5_[21 IAt]astato-3-pyridinecarboxylate.，，Nuclea r Medicine and Biology. 26(4) :405-411(1999) ；Reist 等人，「In vitro and in vivo behavior of radiolabeled chimeric anti-EGFRvIII monoclonal antibody !comparison with its murine parent.，，Nuclear Medicine and Biology. 24 (7) :639-647 (1997)； Wikstrand 等人，"Generation of anti-idiotypic reagents in the EGFRvIII tumor-associated antigen system.，，Cancer Immunology, Immunotherapy. 50(12) 639-652 (2002) ；Wikstrand等人，「Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas.，，Cancer Research.55(14) :3140-3148(1995) ；Wikstrand ^ 入，「The class III variant of the epidermal growth factor receptor(EGFRvIII) :characterization and utilization as an immunotherapeutic target. 「 J. Neurovirol. 4(2) :148-158 (1998)； Wikstrand 等人，「The class III variant of the epidermal growth factor receptor (EGFRvIII) :characterization and utilization as an immunotherapeutic target. 「 J. Neurovirol.4 (2) :148-158 (1998) ； Jungbluth 等人，「A monoclonal antibody recognizing human cancers with amplification/overexpression of the human epidermal growth factor receptor. 」Proc Natl Acad Sci USA. 100(2) 639-44(2003) ；Mamot 等人，「Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-targeted Immunoliposomes Mediate Specific and Efficient Drug Delivery to EGFR-and EGFRvIII-overexpressing Tumor Cells.，，Cancer Research 63:3154-3161 (2003))。然而，每一種上述抗體在變化和/或恆定區內都具有或含有鼠科序列。這些鼠科衍生蛋白質的存在可導致抗體的快速清除或可導致抵抗患者體內抗體的免疫反應的產生。另外，即使在親和力成熟之後，這些抗體仍具有2. 至1.切10_9級別的相對低的親禾口力。(Kuan 等人，"EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy.，，，Endocr Relat Cancer. 8 (2) :83-96 (2001))。為避免使用鼠科或大鼠衍生抗體，研究者已將人類抗體功能引入齧齒動物以使得齧齒動物可產生完全人類抗體，見例如Mendez等人，「Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. "Nat Genet. 15(2) : 146-56 (1997)。這種方法已結合針對野生型EGFR的成功抗體的產生而使用，見例如 Yang X 等人，「Development of ABX-EGF, a fully human anti-EGF receptor monoclonal antibody,for cancer therapy. "Crit Rev Oncol Hemato 38(1)17-23 (2001) ；Yang X-D 等人，"Eradication of Established Tumors by a Fully Human Monoclonal Antibody to the Epidermal Growth Factor Receptor without Concomitant Chemotherapy，，，Cancer Research 59(6) :1236-1243(1999)和美國專利第 6，235，883 號。

發明內容
在一個實施例中，本發明包含特異性結合至EGFRvIII的經分離人類單克隆抗體和包含序列LEEKKGNYVVTDHC的肽(SEQ ID NO 56)。在另一個實施例中，本發明包含特異性結合至於包含L EEKKGNYVVTDHC的序列(SEQ ID NO 56)中含有的表位的經分離人類單克隆抗體，其中如由SPOTs排列中的丙氨酸掃描所測定，結合所需的殘餘物選自由EEK、KKNYV, LEK、EKNY和EEKGN組成的群組。另外的實施例包括包含由VH3-33基因編碼的重鏈可變區胺基酸序列的經分離人類單克隆抗體。重鏈可變區胺基酸序列可包括由JH4b基因編碼的胺基酸序列，或由選自由 D6-13和D3-9組成的群組的D基因編碼的胺基酸序列。其它實施例包括包含由A23(VK2)基因編碼的輕鏈可變區胺基酸序列的經分離人類單克隆抗體。輕鏈可變區胺基酸序列可包括由JKi基因編碼的胺基酸序列。其它實施例包括結合至EGFRvIII的經分離抗體或其片段，而且其包含選自由標識為(SEQ ID) NO :138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和 17 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、095、 250、139、211、124、318、342和333的重鏈胺基酸序列組成的群組的重鏈胺基酸序列。抗體可為單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。抗體或片段可與醫藥學上可接受的載劑或稀釋劑締合，而且可與治療劑偶聯。治療劑可為毒素。治療劑可為諸如DM-1、AEFP、 AURISTATIN E或ZAP的毒素。所述藥劑可經連接劑與抗體締合。所述毒素可經第二抗體與抗體締合。另外的實施例包括產生抗體的雜交瘤細胞株和包含編碼抗體基因的轉型細胞。 例如，所述細胞可為中國地鼠卵巢細胞。另外的實施例包括一種抑制與EGFRvIII的表達相關聯的細胞增殖的方法，其包含以有效量的抗體或片段處理表達EGFRvIII的細胞。在一個實施例中，抗體包含選自由抗體 13. 1.2 (SEQ ID NO 138)、131 (SEQ ID NO 2) ,170 (SEQ ID NO 4) ,150 (SEQ ID NO :5)、 095 (SEQ ID NO 7),250 (SEQ ID NO :9)、139 (SEQ ID NO :10),211 (SEQ ID NO 12)、124(SEQ ID NO 13) ,318 (SEQ ID NO 15)、342 (SEQ ID NO 16)和 333 (SEQ ID NO 17)的重鏈胺基酸序列組成的群組的重鏈胺基酸序列。該方法在活體內進行，而且在哺乳動物(諸如人類) 體內進行，所述哺乳動物經受涉及上皮細胞增殖的癌症，諸如肺癌、結腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤或卵巢癌。另外的實施例包括殺死靶細胞的方法。這可以通過使靶細胞和與毒素締合的抗體接觸來達到。抗體結合至肽LEEKKGNY(SEQ ID NO :133)。在一個實施例中，抗體對於肽具有大於1. 3x1 O^9M的結合親和力。在一個實施例中，毒素選自AEFP、DM-1和ZAP。在一個實施例中，抗體毒素化合物對靶細胞的毒性是對無肽細胞毒性的10倍多。在一個實施例中，抗體包含選自由抗體 13. 1. 2 (SEQ ID NO 138)、131 (SEQ ID NO :2),170 (SEQ ID NO :4)、 150 (SEQ ID NO 5),095(SEQ ID NO 7),250(SEQ ID NO 9),139(SEQ ID NO :10),211(SEQ ID NO 12)、124(SEQ ID NO 13)、318(SEQ ID NO 15)、342(SEQ ID NO 16)和 333 (SEQ ID N0 17)的重鏈胺基酸序列組成的群組的重鏈胺基酸序列。在另一個實施例中，抗體經肽連接劑或第二抗體與毒素締合。本發明另外的實施例包括結合至EGFRvIII的經分離抗體，且其包含重鏈胺基酸序列，其包含以下互補決定區(⑶幻(a) CDRl，由選自由標識為 SEQ ID NO 138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16 和 17 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和 333 的 CDRl 區的胺基酸序列組成的群組的序列組成；(b)CDR2，由選自由標識為 SEQ ID NO 138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16 和 17 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和 333 的 CDR2 區的胺基酸序列組成的群組的序列組成；和(c)CDR3，由選自由標識為 SEQ ID NO 138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16 和 17 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和 333 的 CDR3 區的胺基酸序列組成的群組的序列組成。在一個實施例中，抗體為單克隆抗體、嵌合抗體、人類或人源化抗體。在一個實施例中，抗體與醫藥學上可接受的載劑、稀釋劑和/或治療劑締合。在一個實施例中，所述治療劑為毒素。在一個實施例中，所述毒素為DM-I或Auristatin E。也包括結合至EGFRvIII的經分離抗體或其片段，而且其包含選自由標識為(SEQ ID) NO :140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31 和 32 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、095、250、 139、211、123、318、342和333的輕鏈胺基酸序列組成的群組的輕鏈胺基酸序列。抗體可為單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。其可與醫藥學上可接受的載劑或稀釋劑締合，或與治療劑(諸如毒素，例如DMl或AURISTATIN E)偶聯。在一個實施例中，涵蓋產生抗體的雜交瘤細胞株或轉型細胞，該抗體包含選自由標識為(SEQ ID)NO :140、19、20、21、29、23、25· 26,26,28,33,31 和 32 的抗體 13. 1. 2、131、 170、150、095、250、139、211、123、318、342和333的輕鏈胺基酸序列組成的群組的輕鏈氨基
酸序列。另外的實施例包括產生該抗體的雜交瘤細胞株和包含編碼抗體基因的轉型細胞， 諸如中國地鼠卵巢細胞。另一個實施例包括一種抑制與EGFRvIII的表達相關聯的細胞增殖的方法，其包含以有效量的上述抗體或片段處理表達EGFRvIII的細胞。該方法在活體內進行，而且在哺乳動物(諸如人類)體內進行，所述哺乳動物經受涉及上皮細胞增殖的癌症，諸如肺癌、結腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤或卵巢癌。另一個實施例包括結合至EGFRvIII的經分離抗體，且其包含輕鏈胺基酸序列，其包含以下互補決定區(OTR)(a) CDRl，由選自由標識為 SEQ ID NO :140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31 和 32 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342 和 333 的 CDRl 區的胺基酸
序列組成的群組的序列組成；(b)CDR2，由選自由標識為 SEQ ID NO :140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31 和 32 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342 和 333 的 CDRl 區的胺基酸序列組成的群組的序列組成；和(c)CDR3，由選自由標識為 SEQ ID NO :140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31 和32 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342 和 333 的 CDRl 區的胺基酸
序列組成的群組的序列組成。上段所識別的抗體可進一步包括重鏈胺基酸序列，其包含以下互補決定區 (CDR)(a) CDRl，由選自由標識為 SEQ ID NO 138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16 和 17 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和 333 的 CDRl 區的胺基酸序列組成的群組的序列組成；(b)CDR2，由選自由標識為 SEQ ID NO 138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16 和 17 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和 333 的 CDR2 區的胺基酸序列組成的群組的序列組成；和(c)CDR3，由選自由標識為 SEQ ID NO 138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16 和 17 的抗體 13. 1. 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和 333 的 CDR3 區的胺基酸序列組成的群組的序列組成。另外的實施例包括一種抑制與EGFRvIII的表達相關聯的細胞增殖的方法，其包含以有效量上述抗體或片段處理表達EGFRvIII的細胞。該方法在活體內進行，而且在哺乳動物(諸如人類)體內進行，所述哺乳動物經受涉及上皮細胞增殖的癌症，諸如肺癌、乳腺癌、頭頸癌、前列腺癌或膠質母細胞瘤。其它實施例包括經分離的多聚核苷酸分子，其包含編碼重鏈胺基酸序列的多聚核苷酸序列或其片段，其選自由標識為SEQ ID NO :138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體 13. 1. 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和 333 的重鏈胺基酸序列組成的群組，或包含編碼輕鏈胺基酸序列的多聚核苷酸序列或其片段，其選自由標識為SEQ ID NO :140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31 和 33 的抗體 13.1.2、131、170、150、095、139、 250、211、318、342和333的輕鏈胺基酸序列組成的群組。另外的實施例包括包含容器，含於其中的組合物和表明所述組合物可用於治療以 EGFRvIII的表達為特徵的癌症的包裝說明書或標籤的產品，其中所述組合物包含如上文所述的抗體。所述癌症包括肺癌、乳腺癌、頭頸癌、前列腺癌或膠質母細胞瘤。也包括用於檢測哺乳動物組織或細胞中的EGFRvIII來篩選肺癌、結腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌或卵巢癌的檢定試劑盒，其中EGFRvIII為由上皮癌症表達的抗原，試劑盒包含結合抗原蛋白質的抗體和用於指示抗體與抗原的反應的構件(如果存在)。所述抗體可為經標記的單克隆抗體， 或所述抗體可為未經標記的第一抗體，且用於指示反應的構件包含為抗免疫球蛋白的經標記第二抗體。結合抗原的抗體可由選自由螢光染料、酶、放射性核素和不透射線材料組成的群組的標記物來標記。結合抗原的抗體也可結合至過量表達的wtEGFR。該試劑盒可供患者選擇臨床使用。另一個實施例包括特異性識別含有新穎Gly殘基的EGFRvIII表位的抗體。另一個實施例包括EGFRvIII的變體。所述變體可具有pFLAG插入物，可由SEQ ID NO 56胺基酸組成，且可存在於計算機模擬中。另一個實施例包括結合至識別序列EEKKGNYVVT(SEQ ID NO :57)的抗體或其變體。另一個實施例包括特異性結合至EGFRvIII的抗體變體。所述抗體變體可進一步結合至包含SEQ ID N0:57的肽。抗體變體可具有與肽中的殘基EKNY或EEKGN相互作用的
10殘基。在一個實施例中，抗體變體結合至肽序列比其結合至野生型的EGFR蛋白質緊10倍多。在一個實施例中，抗體變體特異性結合至EGFRvIII和SEQ ID NO :56肽。在一個實施例中，經分離的抗體或變體具有包含深腔的互補決定區，其中所述腔由重鏈的⑶R2和⑶R3、 輕鏈的CDR3和輕鏈CDRl的一小部分形成。在一個實施例中，經分離的抗體或變體在5埃結合腔中具有殘基 31、37、95-101、143-147、159、162-166、169-171、211-219、221 和 223。在一個實施例中，經分離的抗體或變體具有包含淺槽的互補決定區，其中所述槽由重鏈CDR2 和⑶R3與輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3形成。在一個實施例中，經分離的抗體或變體在5埃結合溝槽中具有殘基 31、33、35-39、51、54-56、58-61、94-101、144-148、160、163-166、172 和 211-221。在一個實施例中，經分離的抗體或變體在5埃結合溝槽中具有殘基31-33、35、37、 55、96-101、148、163、165、170、172、178、217和218。在一個實施例中，經分離的抗體或變體具有一成型互補位，以使得當肽EEKKGN(SEQ ID NO 127)的抗體決定基結合至抗體的互補位時，在選自由E2和Y172、K3和H31、K4和H31、N6和D33、N6和Y37及N6和K55組成的群組的兩個殘基之間形成至少一個鍵。在一個實施例中，經分離的抗體或變體具有一成型互補位，以使得當肽EEKKGNY (SEQ ID NO 131)的抗體決定基結合至抗體的互補位時，在選自由K4和Q95、K4和Q95、N6和Q98、G5和H3UY7和H31及Y7和W165組成的群組的兩個殘基之間形成至少一個鍵。在一個實施例中，抗體具有一結構或與計算機模擬中測定的結構相互作用。另一個實施例提供一種用於選擇以特定結合特徵結合至EGFRvIII的變體的方法，所述方法包含使用分子結構以形成互補位，使用分子結構以形成表位，計算二者之間的相互作用能並將所述能級與HiAb變體的表位和第二互補位的能級相比較，和基於能級差異選擇變體。所述方法可進一步包括使用互補位的第二變體與表位之間的相互作用能來測定第三相互作用能並比較第三相互作用能和第二相互作用能來決定選擇哪個變體。在一個實施例中變體形成並進行結合測試。另一個實施例提供一種選擇以特定結合特徵結合至EGFRvIII的變體的方法，所述方法檢驗與互補位相互作用的表位的殘基，選擇重要殘基以形成識別序列，使用所述序列以形成EGFRvIII變體，並使用所述EGFRvIII變體來選擇mAb變體。另一個實施例提供一種使抗體變體形成EGFRvIII的方法，所述方法包含分析與互補位相互作用的表位的殘基，選擇表位的較重要殘基以形成識別序列，使用所述識別序列以形成EGFRvIII變體，並使用所述EGFRvIII變體來選擇抗體變體。在一個實施例中，在計算機模擬中達成抗體的選擇。在一個實施例中，通過產生抵抗EGFRvIII變體的抗體來達到經使用EGFRvIII變體來選擇抗體。在一個實施例中，其中經分離的抗體變體結合至EGFRvIII和SEQ ID NO :57肽， 抗體可進一步包含以下點突變Tyrl72Arg、Leu99Glu、ArglOlGlu、Leu217Glu、Leu99Asn、 Leu99HiS、L99T、Argl01ASp或其某些組合。在一個實施例中，抗體為單克隆抗體、嵌合抗體、 人源化抗體或人類抗體。在一個實施例中，抗體或其變體結合至序列EEKKGNYVVT(SEQ ID NO: 57)，且所述抗體或變體具有次納摩爾結合能力。在又一個實施例中，抗體結合至EGFRvIII且抗體具有結合至表位的互補位，且表位具有一組與包括E、K、N和Y的互補位相互作用的殘基。在一個實施例中，所述抗體為抗體 131。在又一個實施例中，抗體結合至EGFRvIII且抗體具有結合至具有一組與包含E、 E、K、G和N的互補位相互作用的殘基的表位的互補位。在一個實施例中，表位的主要結構為EEKKGNY(SEQ ID NO :131)。在一個實施例中，抗體為13. 1. 2。在又一個實施例中，抗體結合至EGFRvIII且具有小於1. 3xl(T9M、小於1. 0χ1(Γ9Μ 或小於500ρΜ的KD。在一個實施例中，與野生型的EGFR肽相比，抗體對於SEQ ID N0:56具有特異性。在一個實施例中，抗體對野生型的EGFR肽(SEQ ID NO 134)的非特異性結合低於抗體對EGFRVIII (SEQ ID NO :135)的特異性結合的10%。在一個實施例中，抗體選自由 131、139和13. 1. 2組成的群組。在一個實施例中，抗體經內在化。在一個實施例中，至少約 70%或至少約80%的抗體都發生內在化。在一個實施例中，與對於野生型的EGFR蛋白質或其變體(SEQ ID NO :134)相比， 變體人類單克隆抗體優先結合至對於EGFRvIII蛋白質實質上獨特的表位。在一個實施例中，變體包含對應於典範類1的重鏈互補決定區(⑶Rl)。在一個實施例中，變體包含對應於典範類3的重鏈互補決定區(⑶R2)。在一個實施例中，變體包含對應於典範類4的輕鏈互補決定區(⑶Rl)。在一個實施例中，變體包含對應於典範類1的輕鏈互補決定區(⑶R2)。在一個實施例中，變體包含對應於典範類1的輕鏈互補決定區(CDR3)。在一個實施例中，變體包含對應於典範類1的第一重鏈互補決定區(CDRl)、對應於典範類3的第二重鏈互補決定區 (⑶R2)、對應於典範類4的第一輕鏈互補決定區(⑶Rl)、對應於典範類1的第二輕鏈互補決定區(CDR2)和對應於典範類1的第三輕鏈互補決定區(CDR3)，其中形成這些互補決定區以使得變體可結合至與對於EGFR蛋白質相比，對於EGFRvIII蛋白質實質上獨特的表位。在又一個實施例中，提供一種抑制與EGFRvIII的表達相關聯的細胞增殖的方法。所述方法涉及以有效量的抗體或其片段處理表達EGFRvIII的細胞，其中所述抗體或其片段結合至EGFRvIII，其中所述抗體與毒素結合，且其中所述抗體包含選自由抗體 13.1.2 (SEQ ID NO :138)、131 (SEQ ID NO 2),170 (SEQ ID NO :4)、150 (SEQ ID NO :5)、 095 (SEQ ID NO 7),250 (SEQ ID NO :9)、139 (SEQ ID NO 10)、211(SEQ ID NO 12)、124 (SEQ ID NO 13) ,318 (SEQ ID NO 15)、342 (SEQ ID NO 16)和 333 (SEQ ID NO 17)的重鏈胺基酸序列組成的群組的重鏈胺基酸序列。該方法在活體內在哺乳動物體內進行，所述哺乳動物可為人類，且可經受涉及上皮細胞增殖的癌症，且所述癌症可包含肺癌、結腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤或卵巢癌。所述毒素可為DM-1、AEFP、MMAE、AURISTATIN E 或 ZAP。在又一個實施例中，提供一種抑制表達EGFRvIII細胞的細胞增殖的方法。該方法涉及以有效量的抗體或其片段處理表達EGFRvIII的細胞，其中所述抗體與毒素結合，且其中所述抗體具有選自由標識為(SEQ ID) NO :19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗體 13. 1. 2、131、170、150、123、095、139、250、211、342、333 和 318 的輕鏈胺基酸序列組成的群組的輕鏈胺基酸序列，其中所述經分離的多聚核苷酸分子將結合具有以SEQ ID N0:56識別的序列的肽。該方法在活體內在哺乳動物體內進行，所述哺乳動物可為人類，且可經受涉及上皮細胞增殖的癌症，且所述癌症可包含肺癌、結腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤或卵巢癌。所述毒素可為DM-I、AEFP、MMAE、AURISTATIN E或ZAP。


圖1為野生型的EGFR和EGFRvIII之間的顯示沈7胺基酸缺失和G替換的序列比對。圖2為EGFRvIII PEP3 14_mer肽的設計圖。在圖2A中，具有胺基酸LEEKK的 EGFRvIII的N-末端序列。(SEQ ID NO 58) (1-5)與EGFR的N-末端序列相同，繼而為獨特甘氨酸殘基，繼而為與EGFR中的殘基273至280相同的胺基酸。圖2B代表EGFRvIII (6-272) 中缺失的EGFR的胺基酸。圖3A-L提供本發明抗體的序列。對於每一種所提供的抗體，對於重鏈和輕鏈可變區均提供多聚核苷酸和胺基酸序列。因此，對於每一種所列抗體提供四個序列。圖4為13. 1. 2抗體重鏈區與特定種系重鏈區比較的表格，「_」表示雜交瘤重鏈區的胺基酸殘基與那個特定位置處的種系相同。自種系的偏移由合適的胺基酸殘基來表示。圖5為13. 1. 2抗體輕鏈區與特定種系輕鏈區比較的表格，「_」表示雜交瘤輕鏈區的胺基酸殘基與那個特定位置處的種系相同。自種系的偏移由合適的胺基酸殘基來表示。圖6為各種雜交瘤衍生抗體重鏈區與特定種系重鏈區比較的表格，「_」表示雜交瘤重鏈區的胺基酸殘基與那個特定位置處的種系相同。自種系的偏移由合適的胺基酸殘基來表不。圖7為各種雜交瘤衍生抗體輕鏈區與特定種系輕鏈區比較的表格，「_」表示雜交瘤輕鏈區的胺基酸殘基與那個特定位置處的種系相同。自種系的偏移由合適的胺基酸殘基來表不。圖8為顯示重組EGFRvIII mAb與表達EGFRvIII的細胞(NR6細胞)的結合的代表圖。菱形代表95，三角形代表133，正方形代表139，「X」代表150，星號代表170，圓形代表221，直線代表230，和長方形代表250。 圖9A顯示對於人類抗-EGFR抗體(ABX-EGF)至H80的染色分析。圖9B顯示對於抗體131至H80的FACS染色分析。圖9C顯示對於抗體139至H80的FACS染色分析。圖9D顯示對於抗體13. 1. 2至H80的FACS染色分析。圖9E顯示對於ABX-EGF至H1477的FACS染色分析。圖9F顯示對於抗體131至H1477的FACS染色分析。圖9G顯示對於抗體139至H1477的FACS染色分析。圖9H顯示對於抗體13. 1.2至H1477的FACS染色分析。圖91顯示對於ABX-EGF 至A549的FACS染色分析。圖9J顯示對於抗體131至A549的FACS染色分析。圖9K顯示對於抗體139至A549的FACS染色分析。圖9L顯示對於抗體13. 1. 2至A549的FACS染色分析。圖9M為展示EGFRvIII mAb與膠質母細胞瘤細胞的結合的曲線圖。實心三角形代表結合至H1477的抗體131。實心正方形代表結合至H1477的抗體13. 1.2。空三角形代表結合至H80的抗體131。空正方形代表結合至H80的抗體13. 1. 2。圖9N為展示EGFRvIII mAb至人類表皮樣癌細胞株A431的結合的曲線圖。實心正方形代表抗體13. 1.2。實心三角形代表抗體131。圖90為展示抗體13. 1.2至NR6鼠科成纖維細胞細胞株的結合的曲線圖。正方形代表NR6。三角形代表具有野生型EGFR的NR6。圓形代表具有EGFRvIII的NR6。圖9P為展示抗體131至鼠科成纖維細胞細胞株的結合的曲線圖。正方形代表NR6。 三角形代表具有野生型EGFR的NR6。圓形代表具有EGFRvIII的NR6。圖IOA顯示對於人類抗-EGFR抗體(ABX-EGF)結合至表達EGFR細胞(A431)的 FACS染色分析。圖IOB顯示對於抗體131至表達EGFR細胞(A431)的FACS染色分析。圖IOC顯示對於抗體139至表達EGFR細胞(A431)的FACS染色分析。圖IOD顯示對於抗體13. 1. 2至表達EGFR細胞(A431)的FACS染色分析。圖IlA顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的AEFP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80,正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體13. 1. 2的活體外毒性。圖IlB顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的DMl結合相對於與未表達EGFRvIII _，正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體13. 1. 2的活體外毒性。圖IlC顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的ZAP結合相對於與未表達EGFRvIII _，正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體13. 1. 2的活體外毒性。圖IlD顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的AEFP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體95的活體外毒性。圖IlE顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的DMl結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體95的活體外毒性。圖IlF顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的ZAP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體95的活體外毒性。圖IlG顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的AEFP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80,正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體131的活體外毒性。圖IlH顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的DMl結合相對於與未表達EGFRvIII (H80,正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體131的活體外毒性。圖IlI顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的ZAP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80,正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體131的活體外毒性。圖12A顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的AEFP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80,正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體139的活體外毒性。圖12B顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的DMl結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體139的活體外毒性。圖12C顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的ZAP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體139的活體外毒性。圖12D顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的AEFP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體150的活體外毒性。圖12E顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的DMl結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體150的活體外毒性。圖12F顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的ZAP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體150的活體外毒性。圖12G顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的AEFP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80,正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體170的活體外毒性。圖12H顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的DMl結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體150的活體外毒性。圖121顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的ZAP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的EGFRvIII抗體150的活體外毒性。圖13A顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的AEFP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的抗體211的活體外毒性。圖1 顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的DMl結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的抗體211的活體外毒性。圖13C顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的ZAP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的抗體211的活體外毒性。圖13D顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的AEFP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的抗體250的活體外毒性。圖13E顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的DMl結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的抗體250的活體外毒性。圖13F顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的ZAP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的抗體250的活體外毒性。圖13G顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的AEFP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的抗體IgGl (消極對比)的活體外毒性。圖13H顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的DMl結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的抗體IgGl (消極對比)的活體外毒性。圖131顯示間接與表達EGFRvIII細胞(H1477，圓形)中的ZAP結合相對於與未表達EGFRvIII (H80，正方形)的細胞結合的抗體IgGl (消極對比)的活體外毒性。圖14A為條形圖，其表明EGFRvIII抗體(13. 1.2、131和139)當結合至AEFP時抑制複製生成檢定中H1477細胞的菌落形成。圖14B為條形圖，其表明EGFRvIII抗體(13. 1.2、131和139)當結合至DMl時抑制複製生成檢定中H1477細胞的群落形成。圖15A為顯示抗-EGFRvIII抗體(13.1.2)與毒素(MMAE)在表達EGFRvIII細胞 (H1477，圓形)中相對於在未表達EGFRvIII (H80，正方形)中的直接偶聯物的活體外毒性的曲線圖。圖15B為顯示抗-EGFRvIII抗體(13. 1. 2)與毒素(AEFP)在表達EGFRvIII細胞 (H1477，圓形)相對於在未表達GFRvIII (H80，正方形)的細胞中的直接偶聯物的活體外毒性的曲線圖。圖15C為顯示抗-EGFRvIII抗體(13.1.2)與毒素(DMl)在表達EGFRvIII細胞 (H1477)相對於在未表達GFRvIII (H80)的細胞中的直接偶聯物的活體外毒性的曲線圖。圖16顯示其中具有確定腫瘤異種移植的小鼠經抗-EGFRvIII (或dEGFR)抗體 (13. 1. 2)(直接結合至毒素(DM1、MMAE或AEFP))處理的活體內動物模型的結果。實心正方形代表250微克dEGFR-DMl。實心頂角向上的三角形代表75微克相同物質。實心頂角
15向下的三角形代表75微克dEGFR-MMAE。菱形代表250微克相同物質。較淺的正方形代表 75微克dEGFR-AEFP。空正方形代表250微克相同物質。空心頂角向上的三角形代表dEGFR 和自由DM1。空心頂角向上的抗體代表PBS。所有使用的抗體為13. 1.2。箭頭表示前藥處理。圖17顯示抗體131結構模型的分子表面。六個CDR被遮蔽為不同的陰影以標記它們的邊界。結合腔位於接近中心處。圖18顯示抗體13. 1.2分子表面的結構模型。六個⑶R 區域遮蔽為陰影且由數字識別。長槽大概沿垂直中心線分布。圖19A為13. 1. 2抗體和肽 EEKKGN (SEQ ID NO 127)錯合物的可能擴展模型。⑶R區域遮蔽為陰影以指示邊界。圖19B顯示13. 1. 2抗體和肽EEKKGN (SEQ ID NO :127)錯合物的可能擴展模型中的氫鍵。如圖18，CDR圈的陰影與殘基相同。肽殘基自圖頂部的N-末端至C-末端編號為1 至6。由虛線指示六個氫鍵。氫鍵形成的六對胺基酸如下:Ε2. · · Υ172、Κ3· · · Η31、Κ4· · · Η31、 Ν6. . . D33、N6. . . Y37 和 N6. . . K55。圖20為表明對於所選擴展模型之一的表位-抗體結合能與Kd的對數之間的關聯的曲線圖。圖21描繪肽-13. 1. 2抗體錯合物的精確擴展模型。肽以空格實心形式呈現。圖22描繪精確擴展模型中的氫鍵。圖23為描繪抗體-抗原結合能相對於相對親和力的對數的線性擬合的曲線圖。
具體實施例方式如上文所述，EGFRvIII為EGFR的缺失突變體，其中EGFr的細胞外結構域中的沈7 胺基酸缺失，且於連接處以甘氨酸進行單一胺基酸替換。這些特徵顯示於圖1中野生型 EGFR與EGFRvIII之間的序列比對中。鑑於在缺失的連接處的甘氨酸的胺基酸替換，理論上可能產生針對存在於EGFRvIII中而不存在於野生型的EGFR中的新穎表位的抗體。因此，如圖2中所示，設計用於免疫和篩選的肽，稱為PEP3 (Kuan等人，EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy,Endocr Relat Cancer. 8(2) :83-96 (2001))。 這種14-mer肽具有對於EGFRvIII和野生型的EGFR常見的5個η-末端胺基酸，獨特甘氨酸連接位點和野生型的EGFR(對應於殘基273480)與EGFRvIII (對應於殘基7_14)之間的保守序列中所含的8個胺基酸殘基。此外，膠質母細胞瘤細胞和以基因編碼的EGFRvIII 轉染的細胞(B300. 19細胞)也可用於免疫和篩選(在本文有時稱為B300. 19/EGFRvIII轉染子)。為產生抵抗EGFRvIII的人類抗體，將轉基因XenoMouse 小鼠以膠質母細胞瘤細胞/EGFRvIII、B300. 19/EGFRvIII細胞和針對在與野生型的EGFR相比的EGFRvIII中表示的新穎細胞外結構域中的連接區的肽(PEP3)的組合進行免疫。將來自經免疫小鼠中的 B細胞分離並用於產生膠質母細胞瘤，繼而篩選以結合至EGFRvIII或使用XenoMa^SLAM 技術直接用於篩選以結合至 EGFRvIII (Babcook 等人，Anovel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities, Proc Natl Acad Sci USA. 93(15) :7843-8(1996)和美國專利第 5，627，052號)。經識別結合至EGFRvIII的抗體經一系列檢定篩選以確定EGFRvIII的特異性識別。經過這個過程來產生、分離並表徵結合至EGFRvIII且對EGFRvIII具有特異性的人類單克隆抗體群體。隨後獨特表明表位定位，但重疊了特異性。在活體外進一步評估所有抗體以評估其為了將細胞毒素藥物傳遞到細胞而通過細胞進行內在化的能力。表明有效傳遞藥物的抗體與細胞毒素藥物直接結合，並檢測其殺死活體外和活體內表達EGFRvIII 的腫瘤細胞的能力。這些研究為用於治療患者癌症的抗體藥物偶聯物的下一次產生提供了基礎，這些患者的腫瘤隱藏有特異性基因病變。通過上述過程產生完全人類抗-EGFRvIII抗體的群體。使用雜交瘤方式，產生對於野生型的EGFR具有有限交叉反應性的幾種抗體，包括對用於與PEP3結合的ELISA呈陽性的抗體13. 1、13.2、13.3和13.4。除了這些，選擇抗體13. 1 (和尤其為它的亞克隆 13. 1.2)以供進一步研究和發展。使用XenoMax方式，產生抗體群體，包括抗體131、139、250 和095，其對於與ρ印3寡核苷酸的結合具有高度特異性，且與野生型的EGFR具有有限的交叉反應性。其中，131抗體具有最令人感興趣的特性。在圖4-7中展示每一種抗體的序列 (SEQ ID NO :1-33和141-144)。對各種抗體的序列和結合能力進行比較並將結果展示於圖 4-10中。如圖9A-9L和圖IOA-IOD中可見，與ABX-EGF相比，抗體131,139和13. 1. 2都表現出對於EGFRvIII表達細胞(H1477)的較佳選擇性。某些結果顯示於圖9M-9P中的曲線圖中，其表明簡單與EGFRvIII細胞相比，至少兩種抗體13. 1. 2和131表現出對於EGFRvIII 表達細胞的較佳選擇性。此外，檢測本實施例抗體的幾種可能用途；其結果顯示於圖11-16 中。最後，基於預測的結構模型，形成抗體的變體以獲得具有變化結合特徵的抗體。另外，本發明抗體對於結合至相同或類似表位的其它抗體的篩選極為有用。本發明抗體可用於闡明其它抗體的交叉競爭研究中，預期其它抗體對於形成的抗原-抗體錯合物的特徵具有相同或經改良的影響。每一種對於EGFRvIII具有極高親和力131抗體和13. 1.2都通過細胞良好內在化，且當結合至毒素時表現出可高效殺死細胞。令人感興趣的是，不管是否產生於 XenoMouse小鼠的不同免疫中，且不管是否使用不同的技術，兩種抗體都衍生於極為類似的種系基因。然而，基於表位定位操作，每一種抗體似乎結合至EGFRvIII分子上稍微不同的表位，且具有對於結合必要的EGFRvIII上稍微不同的殘基。這些結果表明使用種系基因對於定靶EGFRvIII的抗體療法的產生尤為重要，且小變化可通過基於這些結構發現進一步設計抗體和其它療法來改良抗體的結合和影響。高度需要結合至相同表位，或競爭與13. 1. 2和131抗體結合的抗體。如下文更詳細討論，已通過SPOTs排列的丙氨酸掃描闡明對於特定抗體結合重要的殘基。因此，也高度需要共享重要結合殘基的抗體。^X除非另外定義，本文所用的科學和技術術語將具有所屬領域的一般技術人員通常了解的含義。另外，除非本文另外要求，單數術語包括複數形式且複數術語包括單數形式。 一般而言，本文所述的結合細胞和組織培養、分子生物學及蛋白質和寡核苷酸或多聚核苷酸化學及雜交的術語及其技術是此項技術中已熟知且通常使用的那些術語。標準技術用於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養和轉型(例如，電擊、脂質轉染)。根據生產者的說明或此項技術中通常實現的或如本文所述進行酶反應和純化技術。通常根據此項技術中熟知的常規方法和如本說明書通篇所引用和討論的各種通用和更詳盡參考文獻中所述來進行前述技術禾口程序。見，例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989)。本文所述的關於分析化學、合成有機化學和藥物及醫藥化學而使用的術語及其試驗程序和技術在此項技術中已熟知且通常使用。標準技術用於化學合成，化學分析，醫藥製備、調配和傳遞以及治療患者。如本文所用的術語「經分離多聚核苷酸」意思是染色體組、cDNA或合成源的多聚核苷酸或其某種組合，由於其來源，「經分離多聚核苷酸」(1)與所有或一部分其中「經分離多聚核苷酸」在自然界中發現的多聚核苷酸無關，( 可操作性地連接至多聚核苷酸，在自然界中並未連接，或(3)在自然界中並未作為較大序列的部分而發生。本文中提到的術語「經分離蛋白質」是指cDNA、重組RNA或合成源的蛋白質或其某種組合，由於其來源或衍生源， 「經分離蛋白質」(1)與自然界中發現的蛋白質無關，(2)不含來自相同源的其它蛋白質，例如，不含鼠科蛋白質，(3)由來自不同物種的細胞來表達，或(4)在自然界中並未發生。術語「多肽」在本文中用作一般術語，是指多肽序列的天然蛋白質、片段或類似物。 因此，天然蛋白質、片段或類似物是多肽類物質。根據本發明的優選多肽包含人類重鏈免疫球蛋白分子和人類κ輕鏈免疫球蛋白分子，以及由包含重鏈免疫球蛋白分子和輕鏈免疫球蛋白分子(諸如κ輕鏈免疫球蛋白分子或λ輕鏈免疫球蛋白分子)的組合形成的抗體分子，且反之亦然，以及其片段和類似物。如本文所用的應用於一種物體上的術語「天然發生」是指在自然界中可發現一種物體的這個事實。例如，存在於可白天然源分離的有機體(包括病毒)中，而且未經在實驗室中人為或以其它方式有意改質的多肽或多聚核苷酸序列是天然發生的。如本文所用的術語「可操作性連接」是指所述組分的位置處於可允許它們以其所預期的方式發揮功能的關係中。對照序列「可操作連接」至編碼序列是以在與對照序列相容的條件下可達到表達編碼序列的方式加以綁紮。本文所用的術語「對照序列，，是指對於實現多聚核苷酸序列所連接的編碼序列的表達和處理有必要的多聚核苷酸序列。這些對照序列的本質視其宿主生物體而不同，在原核生物中，這些對照序列通常包括啟動子、核糖體結合位點和轉錄終止序列；在真核生物中，這些對照序列通常包括啟動子和轉錄終止序列。術語「對照序列，，意味著包括至少其存在對於例如先導序列和融合夥伴序列的表達和處理所必需的所有組分，而且也包括其存在對於例如先導序列和融合夥伴序列有利的其它組分。本文所提及的術語「多聚核苷酸」意思是長度至少為10個基的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一種核苷酸的改質形式。術語包括DNA的單鏈和雙鏈形式。本文提及的術語「寡核苷酸」包括天然發生的和由天然發生與非天然發生的寡核苷酸連接子連接在一起的改質核苷酸。寡核苷酸是通常包含200個鹼基或更短長度的多聚核苷酸亞組。寡核苷酸優選長度為10到60個鹼基，且最優長度為12、13、14、15、16、17、18、 19或20到40個鹼基。寡核苷酸通常為單鏈，例如用作探針；儘管寡核苷酸可為雙鏈，例如用於構建基因突變體。本發明的寡核苷酸可為正義或反義寡核苷酸。本文提及的術語「天然發生的核苷酸包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提及的術語「改質核苷酸」包括含有改質或取代糖基的核苷酸及其類似物。本文提及的術語「寡核苷酸連接子」包括寡核苷酸連接子，諸如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、 二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、磷醯胺酯及其類似物。見，例如LaPlanche等人，Nucl. Acids Res. 14 :9081 (1986) ；Stec 等人，J. Am. Chem. Soc. 106 :6077 (1984)； Stein 等人，Nucl. Acids Res. 16 :3209 (1988) ；Zon 等人，Anti-Cancer Drug Design 6 539(1991) ；Zon 等人』 Oligonucleotides and Analogues :A Practical Approach,第 87-108 頁(F. Eckstein 編，Oxford University Press, Oxford England(1991)) ；Stec 等人，美國專利第 5，151，510 號；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90 :543 (1990)。如果需要，寡核苷酸可包括用於檢測的標籤。如本文所用的術語「變體」為不同於所列舉的多肽或多聚核苷酸的多肽、多聚核苷酸或分子，但只是為了不對蛋白質活性造成不利改變。可存在表位的變體。可存在抗體的變體。在優選實施例中，蛋白質變體結合至表位的能力未不利改變。在一個實施例中，蛋白質變體可以與野生型mAb能力的10-500%結合。例如，蛋白質變體可以與野生型mAb能力的10%、50%、110%、500%或大於500%結合。在一個實施例中，包括在10-500%範圍之間的結合能力。結合能力可通過多種方式反映，包括(但不限於)變體對表位的ka、kd或KD。在一優選實施例中，表位是本說明書中所述的表位。在一個實施例中，變體抗體可通過替換、缺失或添加5個或更少胺基酸而不同於野生型的序列。這些變體通常可通過改質所揭示多肽序列之一，並使用例如本文所述的代表性程序評估經改質多肽的結合特性來識別。在另一個實施例中，多肽變體優選展示與經識別多肽至少約70%、更優至少約90%且最優至少約95%的同一性。優選地，變體只在保守替換和/或改質上不同。變體蛋白質包括那些與本說明書所述的蛋白質結構在結構上類似和功能相當的蛋白質。在另一個實施例中，如果蛋白質與本說明書中所述蛋白質功能上相當，那麼這種蛋白質可以是變體，只要變體的互補位與本說明書中所述的互補位類似。在一個實施例中，任何具有與圖17中所述互補位類似形狀的物質都是變體。在一個實施例中，任何具有與圖18中所述互補位類似形狀的物質都是變體。在一個實施例中，任何具有與圖19A和19B中所述相互作用表面類似形狀的物質都是變體。在一個實施例中，如果核酸序列在嚴格條件下可選擇性地與野生型的序列雜交， 那麼抗體為變體。在一個實施例中，合適的適度嚴格條件包括在5xSSC溶液中預洗，0. 5% SDSU.OmM EDTA(pH 8:0)；在50°C _65°C下雜交，5xSSC，隔夜或如果為種間同源物，則在 45°C下，0. 5xSSC ；繼而在65°C下以每次含有0. 1% SDS的h、0. 5x和0. 2xSSC洗脫兩次， 歷時20分鐘。這些雜交DNA序列也屬於本發明的範疇中，由於編碼的簡併性，如核苷酸序列編碼的抗體多肽也由雜交DNA序列所編碼。本文提及的術語「選擇性雜交」意思是可檢測地且特異性地結合。根據本發明的多多聚核苷酸、寡核苷酸及其片段在一定雜交和洗脫條件下與核酸選擇性雜交，所述雜交與洗脫條件可以減小與非特異核酸的可檢測結合的可測量。高度嚴謹條件可用於達到如此項技術中已知且於本文中所討論的選擇性雜交條件。 一般而言，本發明的多多聚核苷酸、寡核苷酸和片段與令人感興趣的核酸序列之間的核酸序列同源性至少為80%，且更一般的為優選至少85%、90%、95%、99%和100%的增加的同源性。如果在兩種胺基酸序列之間存在部分或完全同一性，那麼這兩種胺基酸序列即為同系。例如，85%同源性意思是當兩種序列進行最大匹配比對時，85%的胺基酸一致。在最大化匹配中允許存在間隙(兩種序列的任一種相匹配)；優選為5或更少的間隙長度，2或更少為更優。或者或優選地，如本文所用的這個術語，如果使用含有突變數據矩陣和6或更多間隙代價的ALIGN程序，兩種蛋白質序列(或自長度為至少30個胺基酸的蛋白質中衍生的多肽序列)具有多於5的比對分值，那麼它們同源。B Dayhoff,M. 0. , in Atlas ofProtein Sequence and Structure，第 101-110頁(第5卷，National Biomedical Research Foundation(1972))和此卷的第2期增刊，第1_10頁。如果兩種序列或其部分的胺基酸當使用ALIGN程序最佳比對時大於或等於50% —致，那麼這兩種序列或其部分更優同源。本文所用的術語「對應於」意思是多多聚核苷酸序列與參考多聚核苷酸序列同源(即，一致， 但非嚴格演化相關)，或多多聚核苷酸序列與參考多聚核苷酸序列一致。對比而言，本文所用術語「互補」意思是互補序列與參考多聚核苷酸序列的全部或一部分同源。例如，核苷酸序列「TATAC」對應於參考序列「TATAC」且與參考序列「GTATA」互補。以下術語用於描述兩種或兩種以上多聚核苷酸或胺基酸序列之間的序列關係 「參考序列」、「比較窗口 」、「序列一致性」、「序列一致性百分率」和「實質一致性」。「參考序列」為已確定的序列，用作序列比較的基準；參考序列可為更大序列的亞組，例如，如序列列表中給定的全長cDNA或基因序列的片段，或可包含完整cDNA或基因序列。一般而言，參考序列長度至少為18個核苷酸或6個胺基酸，長度經常為至少M個核苷酸或8個胺基酸， 且長度通常為至少48個核苷酸或16個胺基酸。由於兩個多聚核苷酸或胺基酸序列可能每一個(1)包含在兩個分子之間類似的序列(即，完整多聚核苷酸或胺基酸序列的一部分)， 和( 可能進一步包含在兩個多聚核苷酸或胺基酸序列之間不同的序列，一般通過經「比較窗口 」比較兩個分子的序列以識別和比較序列類似的局部區域來進行兩個(或更多)分子之間的序列比較。如本文所用的「比較窗口」是指至少18個鄰接核苷酸位置或6個胺基酸的概念片段，其中多聚核苷酸序列或胺基酸序列可與至少18個鄰接核苷酸或6個胺基酸序列的參考序列相比較，且其中多聚核苷酸序列在比較窗口中的位置與參考序列(其不包含添加或缺失)相比，可包含20%或更少的添加、缺失、替換及其類似物(S卩，間隙)，以供兩個序列的最優序列比對。可通過Smith和Waterman，Adv. App 1. Math. 2 :482 (1981)的局部同系物算法，通過Needleman和mmsch，J. Mol. Biol. 48 :443(1970)的同系物比對算法，通過用於 Pearson 和 Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A. )85 :2444(1988)的類似方法的研究，通過這些算法的計算機執行過程(GAP，BESTFIT, FASTA和Wisconsin Genetics Software Package Release 7. O 43 TFASTA, (Genetics Computer Group,575 Science Dr.，Madison, Wis. )，Geneworks或Mac Vector軟體封裝)，或通過觀測來進行用於比對比較窗口的序列的最優序列比對，且選擇由各種方法產生的最佳序列比對(即，導致同系物於比較窗口上的最高百分比)。術語「序列一致性」意思是兩個多聚核苷酸或胺基酸序列於比較窗口上一致(即， 在核苷酸X核苷酸或殘基X殘基的基礎上)。術語「序列一致性百分比」通過比較兩個在比較窗口上最優比對的序列，測定於兩個序列中發生一致核酸基(例如，A、T、C、G、U或 I)或殘基以產生匹配位置編號的所在位置的編號，將匹配位置的編號除以比較窗口中的位置總數(即，窗口大小)，且將所得結果乘以100，以產生序列一致性百分比。如本文所用的術語「實質一致性」表示多聚核苷酸或胺基酸序列的特徵，其中與至少18個核苷酸(6個胺基酸)位置的比較窗口上，經常於至少M-48個核苷酸(8-16個胺基酸)位置的窗口上的參考序列相比，多聚核苷酸或胺基酸包含至少85%序列一致，優選至少90%至95%序列一致，更通常至少99%序列一致的序列，其中通過將參考序列與可能包括比較窗口上總計 20%或更少參考序列的缺失或添加的序列相比較來計算序列一致性百分比。參考序列可為更大序列的亞組。與野生型的蛋白質或核酸實質上一致的胺基酸或核酸為野生型的蛋白質或核酸的變體實例。如本文所用的20種常規胺基酸及其縮寫遵循常規用法。見 Immunology-ASynthesis (第 2 版，E. S. Golub and D. R. Gren 編，Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))。20種常規胺基酸(例如，D-胺基酸)，人造胺基酸(諸如α-胺基酸、α-雙取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸)及其它非常規胺基酸的立體異構體也可以作為用於本發明多肽的合適組分。非常規胺基酸的實例包括4-羥基脯氨酸、Y-羧基穀氨酸、ε -N, N, N-三甲基賴氨酸、ε -N-乙醯基賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙醯基絲氨酸、 N-甲醯基甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、σ -N-甲基精氨酸及其它類似胺基酸和亞胺基酸(例如4-羥基脯氨酸)。在本文所用的多肽符號中，根據標準用途和常規，左手方向為氨基末端方向，且右手方向為羧基末端方向。類似地，除非另外指明，單鏈多聚核苷酸序列的左手端為5'端，雙鏈多聚核苷酸序列的左手端稱為5'方向。初生RNA轉錄的5'至3'添加的方向稱為轉錄方向，具有與 RNA相同的序列且為RNA轉錄的5'至5'端的DNA鏈上的序列區域稱為「上遊序列」，具有與RNA相同的序列且為RNA轉錄的3'至3'端的DNA鏈上的序列區域稱為「下遊序列」。如應用於多肽的術語「實質一致性」意思是當兩個肽序列諸如通過使用默認間隙重量的GAP或BESTFIT程序最優比對時，兩個肽序列共享至少80%的序列一致性，優選為至少90%的序列一致性，更優為至少95%的序列一致性，且最佳為至少99%的序列一致性。優選地，非一致的殘基位置通過保守胺基酸替換而不同。保守胺基酸替換是指具有類似側鏈的殘基的互換性。例如，具有脂肪族側鏈的胺基酸群組為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側鏈的胺基酸群組為絲氨酸和蘇氨酸；具有含氨化物側鏈的胺基酸群組為天冬醯胺和谷醯胺；具有芳香族側鏈的胺基酸群組為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有鹼性側鏈的胺基酸群組為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；且具有含硫側鏈的胺基酸群組為半胱氨酸和甲硫氨酸。優選的保守胺基酸替換基團為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、穀氨酸-天冬氨酸和天冬醯胺-谷醯胺。實質上一致的多肽可為變體。變體蛋白質也包括具有微小變化的蛋白質。如本文所討論，考慮到了本發明所包含的抗體或免疫球蛋白分子的胺基酸序列中的微小變化，只要胺基酸序列中的變化保持在至少75 %，更優至少80 %、90 %、95 %，且最優為99 %。尤其而言，也考慮到了保守胺基酸的置換。保守置換為那些發生於與其側鏈相關的胺基酸家族中的置換。經基因編碼的胺基酸通常分為以下家族(1)酸性-天冬氨酸、穀氨酸；( 鹼性-賴氨酸、精氨酸、組氨酸； (3)非極性-丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和不帶電極性-甘氨酸、天冬醯胺、谷醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。更優的家族為絲氨酸和蘇氨酸為脂肪族-羥基家族；天冬醯胺和谷醯胺為含氨化物家族；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸為脂肪族家族，且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸為脂肪族家族。例如， 可合理預期以異亮氨酸或纈氨酸經分離置換亮氨酸，以穀氨酸經分離置換天冬氨酸，以絲氨酸經分離置換蘇氨酸或以結構相關的胺基酸經分離置換胺基酸的類似置換將不會對所得分子的結合或特性具有重要影響，尤其如果置換不涉及框架位點內部的胺基酸時。胺基酸變化是否導致功能肽可易於通過檢定多肽衍生物的特異性活性來測定。檢定於下文中加以詳述。所屬領域的一般技術人員可易於製備抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物。優選片段或類似物的氨基和羧基-末端發生於功能結構域的邊緣附近。可通過將核苷酸和/ 或胺基酸序列數據與公開或專有序列資料庫相比較來識別結構和功能結構域。優選地，使用計算機比較方法來識別發生於其它已知結構和/或功能地蛋白質中的序列基元或預測蛋白質構型結構域。已知用於識別摺疊為已知的三維結構的蛋白質序列的方法。Bowie等人，Science 253 164 (1991)。因此，前述實例表明，所屬領域的技術人員可識別可用於根據本發明的抗體界定結構和功能結構域的序列基元和結構構型。優選胺基酸替換為以下替換⑴減少對蛋白水解作用的敏感性，⑵減少對氧化作用的敏感性，(3)改變供形成蛋白質錯合物的結合親和力，(4)改變結合親和力且(5)授予或改質這些類似物的其它物理化學或功能特性。類似物可包括除天然發生的肽序列之外的序列的各種突變蛋白質。例如，可在天然發生的序列(優選為形成分子間接觸的結構域外部的多肽部分)中進行單一或多重胺基酸替換(優選為保守胺基酸替換)。保守重胺基酸替換不應實質上改變親本序列的結構特徵(例如，置換胺基酸不應破壞發生於親本序列中的螺旋體，或幹擾表徵親本序列的二級結構的其它類型)。在Proteins，Structures and Molecular Principles (Creighton 編，W. H. Freeman and Company,New York(1984))、 Introduction to Protein Structure(C. Branden禾口 J. Tooze編，Garland Publishing,New York, N. Y. (1991))和Thornton等人，Nature 354 :105(1991)中描述此項技術識別的多肽二級和三級結構的實例。如本文所用的術語「多肽片段」是指具有氨基-末端和/或羧基-末端缺失的多肽，但其中殘留的胺基酸序列與自(例如)全長cDNA序列引出的天然發生的序列中的對應位置一致。片段一般為至少5、6、8或10個胺基酸長，優選為14個胺基酸長，更優為至少20 個胺基酸長，通常為至少50個胺基酸長，且甚至更優為至少70個胺基酸長。如本文所用的術語「類似物」是指包含與引出的胺基酸序列的一部分實質上一致的至少25個胺基酸片段的多肽。類似物一般為至少20個胺基酸長，優選為至少50個胺基酸長且可經常長至全長的天然發生多肽。片段和類似物都是變體形式。肽類似物通常以類似於模板肽的特性而作為非肽藥物用於醫藥工業中。這些類型的非肽化合物稱為「肽的模擬物」和「肽模擬物」，Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15 29(1986) ；Veber and Freidinger TINS，第 392 頁(1985)和 Evans 等人，J. Med. Chetn. 30 12四(1987)。通常藉助於計算機分子模型來研發這些化合物。結構類似於治療用肽的肽模擬物可用於產生相當的治療或預防效果。一般而言，肽模擬物在結構上與樣式多肽類似 (即，具有生物化學特性或藥理學活性的多肽)，諸如人類抗體，但其中一個或一個以上肽連接子通過此項技術中熟知的方法視情況由選自由-CH2NH—、-CH2S-, -CH2-CH2-, -CH =CH-(順式和反式)、一C0CH2--、一CH (OH) CH2-和-CH2SO-組成的群組的連接子所置換。 以相同類型的D-胺基酸系統替換一個或一個以上統一序列的胺基酸(例如，以D-賴氨酸代替L-賴氨酸)可用於產生更穩定的肽。此外，可由此項技術中已知的方法產生包含統一序列或實質上一致的統一序列變化的限定肽(Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 387(1992))；例如，通過添加可形成環化肽的分子內雙硫橋的內部半胱氨酸殘基。肽的模擬物和肽模擬物都是變體形式。「抗體」或「抗體肽」是指完整抗體或其與供特異性結合的完整抗體競爭的結合片段。通過重組DNA技術或通過完整抗體的酶分解或化學分解來產生結合片段。結合片段包括Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv和單鏈抗體。除「雙特異性」或「雙功能」抗體之外的抗體應理解為其每一個結合位點一致。當過量抗體將結合至反受體的受體量減少至少約20%、40%、 60%或80%，且更通常大於約85% (如由活體外競爭性結合檢定所測量)時，抗體實質上抑制受體粘合至反受體。術語「表位」包括任何可特異性結合至免疫球蛋白或T-細胞受體或否則與分子相互作用的蛋白質決定簇。表位簇通常由諸如胺基酸或碳水化合物或糖側鏈分子的化學活性表面群組組成，且通常具有特異性三維結構特徵以及特異性電荷特徵。表位可為「線性」或「構型」。在線性表位中，蛋白質與相互作用的分子(諸如抗體)之間的所有相互作用點沿蛋白質的一級胺基酸序列線性發生。在構型表位，相互作用點於彼此分離的蛋白質上的胺基酸上交叉發生。據說當解離常數彡1 μ M，優選彡IOOnM且更優彡IOnM, 且甚至更優< InM時，抗體特異性結合抗原。一旦確定抗原上需要的表位，就可能例如使用本發明所述技術產生對於那個表位的抗體。或者，在發現過程中，抗體的產生和特徵可闡明所需表位的信息。基於這些信息，隨後可能競爭性地篩選用於結合至相同表位的抗體。一種達到此目的的方式是進行尋找彼此競爭性結合的抗體(例如，競爭結合至抗原的抗體) 的交叉競爭研究。一種基於其交叉競爭的用於「結合」抗體的高產量處理描述於國際專利申請案第WO 03/48731號。如由所屬領域的技術人員所了解的，抗體可特異性結合至的任何特定物質都可以是表位。表位可包含抗體結合至的那些殘基。在一個實施例中，表位為 EGFRvIII表位。在一更優實施例中，表位為本說明書實例4中所述的表位。在一個實施例中，表位為實例14中所述的表位。在一個實施例中，表位包含序列LEEKKGNYVVTD(SEQ ID NO :59)。在一個實施例中，表位包含序列EEKKGNYWT(SEQ ID NO :57)。在一個實施例中，表位包含序列EKNY (SEQ ID NO :60)。在一個實施例中，表位包含序列EEKGN (SEQ ID NO :61)。 所屬領域的技術人員將了解到這些實際上不必在單肽上以此順序組合，而這些是形成與互補位相互作用的表位的殘基。如所屬領域的技術人員所將了解的，由產生分子形狀的殘基或側鏈佔據的空間有助於測定表位為何。同樣，與表位相關的任何官能基、範德華相互作用、側鏈的移動度等都可測定表位實際上為何。因此，表位也可以包括能量互動。
術語「互補位」意味著描述測定對於表位的結合的結合區的通用結構。這個結構影響結合區是否結合至表位及其結合的方式。互補位可指負責抗體或其片段結合至表位簇的抗體的抗原位點。互補位也指抗體的獨特位，和結合至表位的互補決定區(CDR)。在一個實施例中，互補位是圖17中的Ll 10、L2 30、L3 50、Hl 20、H2 40和H3 60的抗體區。在一個實施例中，互補位是包含實例16中用於L1、L2、L3、H1、H2和H3的⑶R序列的抗體區。 在一個實施例中，互補位是圖18中的L1，110、L2，130、L3，150、H1 120、H2 140和H3 160的抗體區。在一個實施例中，互補位是包含實例18中用於L1、L2、L3、H1、H2和H3的⑶R序列的抗體區。在一個實施例中，互補位包含實例18中所列的序列。在一個實施例中，互補位包含與表位相互作用的殘基，如圖19A和圖19B中所示。實體黑色結構為肽結構。在一個實施例中，互補位包含13. 1. 2mAb的殘基Tyrl72Arg。在一個實施例中，13. 1. 2mAb的互補位包含選自由以下各殘基組成的群組的至少一個殘基Tyr 172Arg、Argl01Glu、Leu99ASn、 Leu99His、ArglOlAsp、Leu217Gln、Leu99Thr、Leu217Asn、ArglOlGln 和 Asn35Gly。如所屬領域的技術人員所將了解的，任何抗體的互補位或其變體都可由本申請案所陳述的方式來測定。如果殘基預測可貢獻10%的結合能，就認為殘基「重要」。在一個實施例中，如果殘基預測可貢獻2%的結合能，就認為殘基「重要」。在一個實施例中，如果殘基預測可貢獻50% 的結合能，就認為殘基「重要」。在一個實施例中，如果殘基預測與表位表面或互補位表面相互作用，就認為殘基「重要」。在一個實施例中，如果改變殘基導致結合損失，就認為殘基
「重要」。術語「特異性」或「優先」結合至，或類似措辭並不意味著表示抗體只可結合至那個表位。相反，意思是抗體或其變體可結合至那個表位，其程度比抗體結合至抗體所暴露的至少一種其它物質的程度更高。在一個實施例中，特異性結合抗體將以比其至EGFR蛋白質更大的親和力結合至EGFRvIII蛋白質(更緊，或較低的KD)。例如，特異性結合抗體的結合將更緊至少增加 1%>1-2%,2-5%,5-10%, 10-20 %、20-30 %、30-50 %、50-70 %、70-90 %、 90-120 %、120-150 %、150-200 %、200-300 %、300-500 %、500-1000 % 或更多。胺基酸，編號，胺基酸的縮寫形式，例如LeU217Gln表示編號胺基酸從第一種胺基酸到第二種胺基酸的突變。因此，Tyrl72Arg意思是當野生型的蛋白質具有172位置的酪氨酸時，突變具有172位置的精氨酸。本文所用的術語「藥劑」表示化合物、化合物的混合物、生物高分子或從生物物質形成的萃取物。本文所用的「哺乳動物」指認為是哺乳動物的任何動物。哺乳動物優選人類。含有酶(木瓜蛋白酶)的抗體的消化導致兩種一致的抗原結合片段，也稱為「Fab」 片段和「Fe」片段，其不具有抗原結合活性，但具有結晶能力。含有酶(胃蛋白酶)的抗體的消化導致F(ab' )2片段，其中抗體分子的兩臂保持連接，且包含兩個抗原結合位點。 F(ab' )2片段具有交聯抗原的能力。本文所用的「Fv」指保持抗原識別和抗原結合位點的抗體的最小片段。這些片段也可認為是抗體的變體。本文所用的「Fab」指包含輕鏈的恆定結構域和重鏈的CHl結構域的抗體片段。術語「mAb」指單克隆抗體。對於XenoMax方法產生的抗體序列的描述編碼如下「AB」 -指抗體， 「EGFRvIII」-指抗體的結合特異性，「X」指衍生自小鼠的Xen0M0Use，「Gl」-指IgGl 同位型或「G2」-指IgG2同位型，最後三個數字指抗體自其衍生的單細胞編號，例如 AB-EGFRvIII-XG1-095為具有IgGl同位型XenoMouse小鼠對EGFRvIII的結合特異性的抗體，且細胞編號為95。術語「SC」指單細胞，且特定XenoMax方法衍生的抗體可稱為SC，其後緊跟三個數字，或只有三個數字，在本文中指抗體衍生的單細胞編號。對於雜交瘤衍生的抗體序列的描述編碼如下「AB」_指抗體，「EGFRvIII」-指抗體的結合特異性，「X」指衍生自小鼠的Xen0M0Use，「Gl」-指IgGl同位型或 「G2」-指IgG2同位型，「K」指k，「L」指入。最後三個數字指抗體衍生的純系，例如 AB-EGFRvIII-XG1K-13. 1. 2。本文所用的「標記」或「經標記」指對多肽添加的可檢測部分，例如，放射性同位素標記、螢光標記、酶標記、化學發光標記或生物素基。放射性同位素或放射性核素可包括咕、 wC、15N、35S、9°Y、99TC、mIn、125I、131I，螢光標記可包括羅丹明(rhodamine)、鑭系磷或 FITC，且酶標記可包括辣根過氧化物酶、β -半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶。
如本文所用的術語「醫藥劑或藥物」指當適當施與患者時可產生理想治療效果的化合物或組合物。如由 The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S.編， McGraw-Hi 11, San Franci sco (1985))所例示，根據此項技術中的常規用法在本文中使用其它化學術語。如本文所用的「實質上純」意思是靶物質為主要存在的物質(S卩，以摩爾量計，組合物中比任何其它個別物質都大量存在)，且優選地，實質上經純化的部分為其中靶物質佔存在的所有高分子物質至少約50% (以摩爾量計)的組合物。一般而言，實質上純的組合物將佔組合物中存在的所有高分子物質的多於約80 %，更優多於約85 %、90 %、95 %、99 % 和99.9%。最優地，將靶物質純化至基本上為均質(通過常規檢測方法檢測不到組合物中的汙染物質)，其中組合物基本上由單高分子物質組成。術語「患者」包括人類和獸醫受檢者。術語"SLAM Technology，，指"Selected Lymphocyte Antibody Method」 (Babcook 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, i93 :7843-7848 (1996)和 khrader，美國專利第5,627,052號)。術語「XenoMax 」指 SLAM Technology 與XenoMouse 小鼠的使用(如下文所述)O抗體結構已知基本抗體結構單位包含四聚物。每一四聚物由兩對一致的多肽鏈組成，每一對具有一個「輕鏈」(約25kDa)和一個「重鏈」(約50-70kDa)。每一個鏈的氨基-末端部分包括主要負責抗原識別的約100至110或更多個胺基酸的可變區。每一個鏈的羧基-末端部分界定主要負責效應子功能的恆定區。人類輕鏈分類為κ和λ輕鏈。重鏈分類為μ、 δ、γ、α或ε，且將抗體的同位型分別界定為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈種可變區和恆定區通過約12個或更多個胺基酸的「J」區來連接，其中重鏈也包括約10個或更多個胺基酸的「D」區。一般見，Fundamental Immunology第7章(Paul，W.編，第2版， Raven Press, N. Y. (1989))。每一輕/重鏈對的可變區形成抗體結合位點。因此，完整抗體具有兩個結合位點。除了雙功能或雙特異性抗體之外，兩個結合位點相同。這些鏈都展示由三個高變區連接的相對保守的框架區(FR)相同的通用結構，也稱為互補決定區或⑶R。每一對兩個鏈的⑶R通過框架區比對，使得可結合至特異性表位。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈都包含FR1、CDRU FR2、CDR2、FR3、CDR3 和FR4結構域。每一結構域的胺基酸分配是根據Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 禾口 1991))或 Chothia&Lesk J. Mol. Biol 196 :901-917(1987) ;Chothia 等人，Nature342 : 878-883(1989)中的定義。雙特異性或雙功能抗體是具有兩個不同重鏈/輕鏈對和兩個不同結合位點的人造雜交抗體。雙特異性抗體可通過多種包括雜交瘤的融合和Fab'片段的連接的方法來產生。見例如 Songsivilai&Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79 :315-321 (1990)，Kostelny 等人，J. Immunol. 148 :1547-1553(1992)。雙特異性抗體的產生與常規抗體的產生相比可為相對勞動密集型的工藝，而且雙特異性抗體的產量和純度通常較低。雙特異性抗體不以具有單結合位點片段的形式存在(例如，Fab、和Fv)。除了抗體的通用結構方面之外， 互補位和表位之間的更特異相互作用可通過結構方式來檢驗。在一個實施例中，CDR結構形成互補位，抗體經其可結合至表位。這種互補位的結構可通過多種方式來測定。可使用傳統的結構檢驗方法，諸如NMR或χ-射線晶體學。這些方法可檢驗單獨互補位，或當其結合至表位時的結構。或者，分子模型可在計算機模擬中產生。結構可藉助於市售的封裝，諸如Accelrys(San Diego, CA)的hsightll模型封裝，通過同系模型產生。簡而言之，可利用檢驗抗體序列來尋求已知結構蛋白質的資料庫，諸如，蛋白質結構資料庫(Protein Data Bank)。在識別具有已知結構的同系蛋白質之後，這些同系蛋白質可用作模型模板。每一種可能模板可經比對，由此產生這些模板中基於結構的序列比對。隨後可將具有未知結構的抗體序列與這些模板比對以產生具有未知結構抗體的分子模型。如所屬領域的技術人員將了解的，存在多種在計算機模擬中產生所述結構的替代方法，可使用其中任何一種。例如，可使用類似於Hardman等人，頒布的採用QUANTA(Polygen Corp.，ffaltham, Mass.)禾口 CHARM (Brooks, B. R. , Bruccoleri, R. Ε. , Olafson, B. D. , States, D. J. , Swaminathan, S.禾口 KarpIus, Μ.，1983，J. Comp. Chem, . 4 :187)的美國專利第 U. S. Pat. No. 5，958，708 號中所述工藝的工藝。不但互補位的形狀對於測定可能互補位是否結合至表位及其良好程度很重要，而且表位和互補位之間的相互作用本身是設計變體抗體的大量信息來源。如所屬領域的技術人員將了解的，存在多種研究這種相互作用的方式。一種方式是使用可能如上文所述產生的結構模型，且隨後使用諸如hsightlKAccelrys，San Diego, CA)的程序，其具有一個可對互補位和其表位之間的構型和定位空間進行Monte Carlo研究的擴展模塊。結果是可評估表位和互補位相互作用的地點和方式。在一個實施例中，只有表位的片段或變體用於協助測定相關的相互作用。在一個實施例中，整個表位用於互補位和表位之間相互作用的建模。如所屬領域的技術人員將了解的，這兩種不同方法具有不同的優點和不足。例如，僅使用表位片段使得可對每一側鏈的可能變體進行更為詳盡的檢驗，而無需耗費大量時間。另一方面，通過僅使用表位片段，或僅使用表位代替整個蛋白質，表位片段的特徵與整個表位的特徵可能不同，因此可能增加在計算建模過程中誤導的風險。在一個實施例中，以有限程度使用兩種方法以交叉檢查結果。在一優選實施例中，如果使用表位變體，可最優化以便表位變體包含表位的最重要殘基。最重要殘基的一致性可通過多種方式測定，例如如本發明實例4和14中所述。通過使用這些產生的結構，可測定哪些殘基在表位和互補位之間的相互作用中最重要。因此，在一個實施例中，可易於選擇改變哪些殘基來改變抗體的結合特徵。例如，從擴展模型顯而易見，表位中某些殘基的側鏈可在空間上阻止表位的結合，由此將這些殘基改變為具有較小側鏈一致的殘基。這可以多種方式來測定。例如，只需觀察兩個模型來評估基於官能基和鄰近基團的相互作用。或者，如上文所述，可進行表位和互補位的重複組對，以獲得更為有利的能量相互作用。也可測定多種抗體變體的這些相互作用來測定其中抗體可結合至表位的替代方式。也可將各種模型組合來測定如何改變抗體結構來獲得具有所需特定特徵的抗體。上述測定的模型可通過各種技術來測試。例如，相互作用能可由上文討論的程序來測定以決定需進一步檢驗哪種變體。又，使用庫侖和範德華相互作用來測定表位和變體互補位的相互作用能。也使用針對突變的位點來觀察抗體結構中的預定變化實際上是否可導致結合特徵的所需變化。或者，可改變表位來證實模型正確或用於測定可能在互補位和表位之間發生的一般結合主題。上述用於建模結構的方法可用於測定蛋白質結構中的何種變化將導致抗體的特定所需特徵。這些方法可用於測定蛋白質結構中的何種變化不會導致抗體的所需特徵。如所屬領域的技術人員將了解的，儘管這些模型將為形成本發明的抗體及其變體提供必要的嚮導，但仍需要進行計算機模擬模型中的常規測試，可能通過活體外研究。此夕卜，如所屬領域的技術人員將了解的，任何改質也會對抗體活性具有另外的副效應。例如， 儘管預期導致更大結合的改變可引起更大的結合，也可引起其它會減少或改變抗體活性的結構變化。對於是否為這種情況的測定在所屬領域中很常見，而且可通過多種方式來進行測定。例如，如實例21中，活性可通過ELISA測試來測試。或者，可以通過使用表面等離子體共振裝置來測試樣品。抗體結合和供優良結合的變體抗體在一個實施例中，上述模型用於增加抗體對其表位的結合能力。抗體可更易於結合至表位，且因此具有較高的締合常數00。或者，抗體可較慢自表位離解，且因此具有較低的離解常數(Kd)，或表位-互補位的Kd值較小，因此使得表位和互補位之間的結合程度更高。在某些實施例中，設計變體抗體以相反特徵結合。即，抗體不緊密結合或可能不快速結合。在其它實施例中，變體抗體的Kd與野生型的抗體不同，但變體抗體對於特定表位更具特異性。這意味著經設計抗體的互補位具有較低結合至其它表位的風險。抗體可具有已改變的其它特徵。例如，變體對非特異性抗體結合更具免疫性，或即使當抗體以高濃度存在時，在溶液中仍保持溶劑化。這種變體可存在於所討論的抗體中。例如，儘管下文檢驗的某些變體抗體的較高濃度導致了 Biacore實驗中較慢的結合組分(例如，13. 1. 2mAb)，但某些變體即使在相同濃度下仍不展示所述較慢組分，例如L217N-2. 1。可形成由上文測定的模型預測的變體，且隨後經測試來測定其實際上是否以所需特徵結合。可選擇與表位具有較大總相互作用能的突變體以供進一步測試。相互作用能可以多種方式測定，其中之一如上文所述。這些變體可以多種方式測試。示範性的選擇包括，而且不限於KinExA(例如， Lackie 頒布的專利第 5，372，783 號，1994 年 12 月 13 日)(Sapidyne Instruments Inc.， ID,Boise)、表面等離子體共振(SPR) (e. g.，BIACORE Biacore, Inc. , Pistcataway, N. J.)、 停流螢光、共振鏡和螢光偏振。許多這些選擇不但可以記錄數據，而且可以提供用於將數據擬合為各種理論曲線並由此測定ka、kd和Kd以及其它特性的現成構件。重要的是，應注意到這些曲線擬合為結果數據並不排除存在一些偏差的可能性。因此，相關的締合、離解和平衡常數不但可以通過這些曲線擬合機理來觀察，也可以根據所屬領域的技術人員的知識直接相互比較。人類抗體和抗體的人源化人類抗體避免了與具有鼠科或大鼠可變和/或恆定區的抗體相關的問題。這些鼠科或大鼠衍生蛋白質的存在可導致抗體的快速清除或可導致抵抗患者體內抗體的免疫反
27應的產生。為避免使用鼠科或大鼠衍生抗體，可通過將人類抗體功能引入齧齒動物以便於齧齒動物產生完全人類抗體來產生完全人類抗體。克隆和重構YAC中兆鹼基尺寸的人類基因座及將其引入小鼠種系的能力為說明極大或經原始映射的基因座的功能組分以及產生人類疾病的有用模型提供了有力途徑。此夕卜，使用這種技術將小鼠基因座替換為其人類等效物可為發育期間的人類基因產物的表達和調節、它們與其它系統的信息傳遞及其在疾病誘發和進展中的關聯提供獨特見解。這種策略的重要實際應用是小鼠體液免疫系統的「人源化」。將人類免疫球蛋白 (Ig)基因座引入內源Ig基因已失活的小鼠中提供機會來研究抗體的程序化表達和組合及其在B-細胞發育中的作用中的潛在機理。此外，這種策略可為產生完全人類單克隆抗體 (mAb)-—種在人類疾病種實現抗體治療前景的重要裡程碑提供理想來源。預期完全人類抗體可將免疫和過敏反應本質最小化為小鼠或小鼠衍生mAb，且因此增加了經投予抗體的功效和安全性。使用完全人類抗體預期可為治療慢性和復發性人類疾病提供實質好處，諸如炎症、自身免疫力和癌症，這些都需要反覆投予抗體。一種針對這個目的的方法是設計不足以用於具有人類Ig基因座大片段的小鼠抗體生產的小鼠品系，以預期這些小鼠可在無小鼠抗體的情況下產生人類抗體的大指令系統。大的人類Ig片段可保持大的可變基因多樣性以及對抗體生產和表達的合適調節。通過採用用於抗體多樣化和選擇的小鼠工具和對於人類蛋白質免疫耐受性的缺乏，這些小鼠品系中再現的人類抗體指令系統應產生對於任何感興趣的抗原(包括人類抗原)都具有高親和力的抗體。使用雜交瘤技術，可易於生產和選擇具有所需特異性的抗原-特異性人類 mAb。如1994年所公開的，結合第一代XenoMouse品系表明這種一般策略(見Green等人， Nature Genetics 7:13-21(1994))。XenoMouse品系設計為具有分別含有人類重鏈基因座和κ輕鏈基因座的2451Λ和1901Λ大小的種系構型片段的酵母人工染色體(YAC)，其含有核可變核恆定區序列Id。含有YAC的人類Ig經證明與供抗體重排和表達的小鼠系統相容且可替換為失活的小鼠Ig基因。這可由其誘發B-細胞發育、產生完全人類抗體的類似成人的人類指令系統和產生抗原-特異性人類mAb能力來證實。這些結果也表明，引入含有較大編號V基因的人類Ig基因座的較大部分、另外的調節元素和人類Ig恆定區可實質上概括完整指令系統，其以對於感染和免疫的人類體液反應為特徵。Green等人的著作最近由引入大於約80%的人類抗體指令系統擴展至分別引入兆鹼基大小的人類重鏈基因座和κ 輕鏈基因座的種系構型YAC片段。見Mendez等人，Nature Geneticsl5 :146-156 (1997)和美國專利申請案第08/759,620號，申請於1996年12月3日。XenoMouse小鼠的產生於以下專利中進一步討論和敘述美國專利申請案第 07/466，008號，申請於1990年1月12日；第07/610，515號，申請於1990年11月8日；第 07/919，297號，申請於1992年7月M日，第07/922，649號，申請於1992年7月30日；第 08/031, 801號，申請於1993年3月15日；第08/112，848號，申請於1993年8月27日；第 08/234，145號，申請於1994年4月沘日；第08/376，279號，申請於1995年1月20日； 第08/430，938號，申請於1995年4月27日；第08/464，584號，申請於1995年6月5日； 第08/464，582號，申請於1995年6月5日；第08/463，191號，申請於1995年6月5日； 第08/462，837號，申請於1995年6月5日；第08/486，853號，申請於1995年6月5日； 第08/486，857號，申請於1995年6月5日；第08/486，859號，申請於1995年6月5日；第08/462，513號，申請於1995年6月5日；第08/7M，752號，申請於1996年10月2日和第 08/759，620號，申請於1996年12月3日和美國專利第6，162，963號、第6，150，584號、第 6，114，598 號、第 6，075，181 號和第 5，939，598 號和日本專利第 3068180B2 號、第 3068506B2 號和第 3068507B2 號。也可見 Mendez 等人，Nature Genetics 15:146-156(1997)和 Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188 :483-495(1998)。也可見歐洲專利第EP0463151B1號，於1996年6月12日授權公開，國際專利申請案第WO 94/(^602號，於1994年2月3日公開，國際專利申請案第W096/34096號，於1996 年10月31日公開，第WO 98/24893號，於1998年6月11日公開，第WO 00/76310號，於 2000年12月21日公開，第WO 03/47336號。在另一種方法中，其它公司，包括GenPharm International公司已使用「微基因座」方法。在微基因座方法中，外源Ig基因座通過包含來自Ig基因座的物質(個別基因)來模仿。因此，一種或一種以上Vh基因、一種或一種以上Dh基因、一種或一種以上JH基因、μ恆定區和第二恆定區(優選為Y恆定區)形成為用於插入動物體內的構造。這種方法描述於以下專利中=Surani等人的美國專利第 5，545，807號和每一專利都屬於Lonberg和Kay的美國專利第5，545，806號、第5，625，825 號、第 5，625，126 號、第 5，633，425 號、第 5，661，016 號、第 5，770，429 號、第 5，789，650 號、 第 5，814，318 號、第 5，877，397 號、第 5，874，299 號和第 6，255，458 號，Krimpenfort 和 Berns的美國專利第5，591，669號和第6，023. 010號，Berns等人的美國專利第5，612，205 號、第5，721，367號和5，789，215號，及Choi和Dunnand的美國專利第5，643，763號，以及 GenPharm International美國專利申請案第07/574，748號，申請於1990年8月四日、第 07/575，962號，申請於1990年8月31日、第07/810，279號，申請於1991年12月17日、第 07/853，408號，申請於1992年3月18日、第07/904，068號，申請於1992年6月23日、第 07/990, 860號，申請於1992年12月16日、第08/053，131號，申請於1993年4月26日、第 08/096, 762號，申請於1993年7月22日、第08/155，301號，申請於1993年11月18日、第 08/161，739號，申請於1993年12月3日、第08/165，699號，申請於1993年12月10日、 第08/209，741號，申請於1994年3月9日。也可見歐洲專利第0546073B1號，國際專利申請案 WO 92/03918, W092/22645, WO 92/22647, WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、 WO 94/25585,WO 96/14436,WO 97/13852 和 WO 98/24884 及美國專利第 5，981，175 號。進一步見 Taylor 等人，1992 年；Chen 等人，1993 年；Tuaillon 等人，1993 年；Choi 等人，1993 年；Lonberg 等人，(1994) ；Taylor 等人，(1994)和 Tuaillon 等人，(1995)Fishwild 等人， (1996)。Kirin也已表明自小鼠中產生人類抗體，其中已通過微細胞融合引入大片染色體或整個染色體。見歐洲專利申請案第773288號和第843961號。Xenerex Biosciences正在研發一種用於潛在產生人類抗體的技術。在這種技術中，以人類淋巴細胞(例如，B和/ 或T細胞)重新構成SCID小鼠。小鼠隨後經抗原免疫，且可產生對抗抗原的免疫反應。見美國專利第5，476，996號、第5，698，767號和第5，958，765號。人類抗-小鼠抗體(HAMA)反應已將工業生產導向製備嵌合或其它人源化抗體。儘管嵌合抗體具有人類恆定區和鼠科可變區，仍希望可觀察到某些人類抗-嵌合抗體(HACA) 反應，尤其在抗體的慢性或多-劑量使用中。因此，為了使HAMA或HACA反應的考慮和/或影響失效，仍希望提供對抗EGFRvIII的完整人類抗體。
抗體治療如本文所述，EGFRvIII抗體的功能似乎對其操作模式的至少一部分很重要。例如， 就功能而言，意思是EGFRvIII抗體在以EGFRvIII操作中的活性。因此，在某些方面，希望結合作為對抗EGFRvIII的治療候選物的抗體的產生，抗體可固定補充物並補充細胞毒性淋巴細胞，由此參與到CDC和ADCC中。存在多種具有相同功能的抗體同位型，包括(但不限於)以下鼠科IgM、鼠科IgG^i、鼠科IgG^、鼠科IgG3、人類IgM、人類IgGl、人類IgG3和人類IgA。又，希望結合作為對抗EGFRvIII的治療候選物的抗體的產生，抗體可通過Fc受體接合於諸如自然殺手(NK)細胞的效應細胞來活化依賴抗體介導的細胞毒反應(ADCC)。存在多種可ADCC的抗體同位型，包括(但不限於)以下鼠科IgG^i、鼠科IgG2b、鼠科IgG3、 人類IgGl和人類IgG3。應了解，產生的抗體不必一開始就具有這種同位型，但是相反地，產生的抗體可具有任何同位型且抗體可為隨後使用此項技術中熟知的常規技術轉換的同位型。這些技術包括使用直接重組技術(例如，見美國專利第4，816，397號)和細胞-細胞融合技術(例如，見美國專利第5，916，771號和第6，207，418號)。在細胞-細胞技術中，製備具有含有任何所需同位型的重鏈的骨髓瘤或其它細胞株和另一種具有輕鏈的骨髓瘤或其它細胞株。隨後這些細胞可經融合，且可分離表達細胞株的完整抗體。例如，本文討論的某些抗-EGFRvIII抗體為人類抗-EGFRvIII IgGl抗體。如果這種抗體具有對EGFRvIII分子的所需結合，同位型應易於轉換以產生人類IgM、人類IgG3或人類IgGA，儘管仍具有相同的可變區(其界定了抗體的特異性及其某些親和力)。這些分子(包括IgGl)隨後將可固定補充物並參與CDC，且如果包含IgGl或IgG3恆定區，這些分子也將可通過補充細胞毒性淋巴細胞參與依賴抗體介導的細胞毒反應(ADCC)。因此，由於產生了達到上文所述所需「結構」屬性的抗體候選物，因此，其通常通過同位型轉換可具有至少某些所需「功能」屬性。其它治療的設計和產生基於本文中關於EGFRvIII產生和表徵的抗體活性，促進了除抗體部分之外的其它治療形態的設計。這些形態包括(但不限於)高級抗體療法(諸如雙特異性抗體、免疫毒素和放射性同位素標記的療法)、肽療法的產生、基因療法，尤其為內抗體、抗致敏療法和小分子。例如，結合高級抗體療法的產生，其中補充物固定和細胞毒性淋巴細胞的補充為理想屬性，可能通過使用雙特異性、免疫毒素或放射性同位素標記來增強細胞殺死。例如，結合雙特異性抗體，可產生包含以下的雙特異性抗體(i)兩種抗體，一種具有對EGFRvIII的特異性且另一種具有對結合在一起的第二種分子的特異性；(ii) 一條鏈對EGFRvIII具有特異性且第二條鏈對第二種分子具有特異性的單抗體；或(iii)對於 EGFRvIII和另一種分子具有特異性的單鏈抗體。這些雙特異性抗體可使用熟知技術產生， 例如，結合(i)和(ii),例如見 Immunol Methods 4 :72-81 (1994)和上述的 Wright and Harris，及結合(iii)，例如見 Traunecker 等人，Int. J. Cancer (Suppl.) 7 :51-52 (1992)。在每一種情況下，第二種特異性可賦予Fc鏈活化受體，包括(但不限於)CD16或CD64 (例如見，Deo 等人，18 127 (1997))、CD3 (Micromet 『 sBiTE 技術)或 CD89 (例如見，Valerius 等人，Blood 90:4485-4492(1997))。根據前述製備的雙特異性抗體可能殺死表達EGFRvIII 的細胞，且尤其是其中本發明的EGFRvIII抗體有效的那些細胞。
結合免疫毒素，抗體可使用此項技術中熟知的技術改質而作為免疫毒素。例如見Vitetta Immunol Today 14 :252 (1993)。也例如見美國專利第 5，194，594 號。結合製備放射性同位素標記的抗體，這些經改質抗體也可易於使用此項技術中熟知的技術來製備。例如見 Junghans 等人，Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 中 (第 2 版，Chafner and Longo 編，Lippincott Raven (1996))。也見美國專利第 4，681，581 號、第 4，735，210 號、第 5，101，827 號、第 5，102，990 號(RE 35，500)、第 5，648，471 號和第 5，697，902號。每一種免疫毒素和放射性同位素標記的分子都可能殺死表達EGFRvIII的細胞，且尤其是其中本文所述抗體有效的那些細胞。可設計抗體更快速結合，或更慢自表位離解，且因此可將抗體本身設計為治療劑。 例如，抗體的經改變特徵可用於對患者投予治療劑。治療免疫偶聯物如所了解的，與藥物、毒素或其它分子(免疫偶聯物或免疫毒素)結合的抗體在定靶殺死表達可通過特異性結合分子(諸如抗體)特異性結合的分子的細胞中極為有用。如上文所述，尚未已知在任何正常組織上表達過EGFRvIII。此外，EGFRvIII顯示顯著表達於多種人類腫瘤中。因此，EGFRvIII是用於以免疫毒素定靶的最受矚目的分子。已出現許多關於試圖特異性定靶具有單克隆抗體-藥物偶聯物的腫瘤細胞的報導(Sela 等人，Immunoconjugates 189-216 中(C. Vogel, ed. 1987) ；Ghose 等人，Targeted Drugs 1-22 ψ (Ε. Goldberg H, 1983 $ ) ；Diener 等人，Antibody Mediated Delivery Systems 1-23 ψ (J. Rodwell H, 1988 ^Ξ ) ；Pietersz ^A, Antibody Mediated Delivery Systems 25-53 ψ (J. Rodwell H, 1988 ^ ) ；Bumol ^A, Antibody Mediated Delivery Systems 55-79中(J. Rodwell編，1988年))。細胞毒素藥物，諸如氨甲喋呤、柔紅黴素、 阿黴素、長春新鹼、長春鹼、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C和苯丁酸氮芥已與多種鼠科單克隆看體結合。在某些情況下，通過中間體載劑分子將藥物分子連接至抗體分子， 這些中間體載劑分子諸如血白蛋白(Garnett等人，Cancer Res. 46 :2407-2412(1986)； Ohkawa 等人』 Cancer Immumol. Immunother. 23 :81-86(1986) ；Endo 等人』 Cancer Res. 47 :1076-1080(1980))、右旋糖酐(Hurwitz 等人，Appl. Biochem. 2 :25-35(1980)； Manabi 等人，Biochem. Pharmacol. 34 :289-291 (1985) ；DiIlman 等人，Cancer Res. 46 4886-4891 (1986) ；Shoval 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :8276-8280 (1988))或多聚穀氨酸(Tsukada 等人，J. Natl. Cane. Inst. 73 :721-729 (1984) ；Kato 等人，J. Med. Chem. 27 1602-1607(1984) ；Tsukada 等人，Br. J. Cancer 52 111-116 (1985)) 已採用多種連接子技術以用於製備這些免疫偶聯物，且已研究了可離解和不可離解連接子。然而，在大部分情況下，如果藥物分子可從在定靶位點為非改質形式的偶聯物釋放出來，就只能觀察到藥物的完全細胞毒性潛能。已用於製備抗體-藥物偶聯物的可離解連接子之一為基於順-丙烯三羧酸的酸-不穩定連接子，其利用不同細胞內間隔的酸性環境，諸如在受體調節的內吞作用中遇到的內體和溶酶體。Sien和Ryser引入這種方法來製備柔紅黴素與大分子載劑的偶聯物 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 102 1048-1054(1981))。Yang 和 Reisfeld 使用相同技術將柔紅黴素偶聯至抗-黑素瘤抗體(J. Natl. Cane. Inst. 80 1154-1159 (1988)) 近來， Dillman等人也使用酸不穩定連接子以類似方式製備柔紅黴素與抗-T細胞抗體的偶聯物 (Cancer Res. 48 :6097-6102(1988))。
由Trouet等人研究的另一種方法涉及將柔紅黴素經肽空間臂連接至抗體(Proc. Natl. Acad. Sci. 79 :626-629 (1982))。這是在通過溶菌酶肽酶的作用無藥物從這種偶聯物中釋放出來的前提下進行的。然而，在活體外細胞毒性測試中已揭示，抗體-藥物偶聯物很少達到與自由非偶聯藥物相同的細胞毒性效能。這表明，藥物分子從抗體釋放出來的機理效率很差。在免疫毒素的範圍內，經單克隆抗體與催化活性蛋白質毒素之間的雙硫橋形成的偶聯物顯示比含有其它連接子的偶聯物更具細胞毒性。見，Lambert等人，J. Biol. Chem. 260 12035-12041(1985) ；Lambert 等人，Immunotoxins 175—209 中(A. Frankel 編，1988)； Ghetie等人，Cancer Res. 48 :26104617 (1988)。這歸因於對抗體分子與毒素之間的雙硫鍵的有效離解有利的穀胱甘肽的高細胞內濃度。儘管如此，僅有少量關於使用雙硫橋製備藥物和大分子之間的偶聯物的報導實例。Sien等人描述了氨甲喋呤轉化為巰乙基醯胺衍生物，繼而經雙硫鍵與聚-D-賴氨酸偶聯(J. Biol. Chem. 260 10905-10908 (1985))。此外， 一報導描述了含三硫化物的毒素藥物刺孢黴素與抗體的偶聯物的製備(Menendez等人， Fourth International Conference on Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer, San Diego, Abstract 81(1989))。另一報導描述了含三硫化物的毒素藥物刺孢黴素與抗體的偶聯物的製備(Hinman等人，53Cancer Res. 3336-3342 (1993))。缺少二硫化物連接的抗體-藥物偶聯物的一個原因是帶有含有可易於用於將藥物經二硫化物橋連接至抗體的部分的硫原子的細胞毒素藥物的不可利用性。此外，現存藥物在其細胞毒性潛能不減少的情況下，其難於進行化學改質。現存抗體-藥物偶聯物的另一主要不足在於因為有限數目的定靶抗原及靜止癌藥物(如氨甲喋呤、柔紅黴素和長春新鹼)的相對適度細胞毒性，其不能將足夠濃度的藥物傳遞到定靶位點。為了達到顯著的細胞毒性，有必要將大量的藥物分子直接或通過聚合載劑分子連接至抗體。然而，這些高度改質的抗體通常展示出對於定靶抗原削弱的結合且快速從血流中活體內清除。Maytansinoid為高度細胞毒素藥物。美登素首先由Kupchan等人自東非灌木齒葉美登木中分離，且其顯示比常規癌症化學治療劑(如氨甲喋呤、柔紅黴素和長春新鹼) 大100到1000倍的細胞毒性(美國專利第3，896，111號)。後來發現某些微生物也產生 maytansinoid,諸如異戊酸美登素酯和異戊酸美登素酯的C_3酯(美國專利第4，151，042 號)。也已報導異戊酸美登素酯的合成C-3酯和異戊酸美登素酯的類似物(Kupchan等人， J. Med. Chem. 21 :31-37(1978) ；Higashide 等人，Nature270 :721-722(1977) ；Kawai 等人， Chem. Pharm. Bull. 32 :3441-3451 (1984))。C-3酯由其製備的異戊酸美登素酯的類似物的實例包括芳族環上(例如，脫氯)或在C-9、C-14(例如，羥基化甲基)、C-15、C-18、C-20和 C-4，5處經改質的異戊酸美登素酯。 天然發生和合成C-3酯可分為兩個群組(a)具有簡單羧酸的C-3酯(美國專利第4，248，870號、第4，沈5，814號、第 4，308，268 號、第 4，308，269 號、第 4，309，428 號、第 4,317,821 號、第 4，322，348 號和第 4，331，598 號)和(b)具有N-甲基-L-丙氨酸的衍生物的C-3酯(美國專利第4，137，230號、第 4，260, 608 號、第 5，208，020 號和 Chem. Pharm. Bull. 12 :3441 (1984))。
發現群組(b)的酯的細胞毒性比群組(a)的酯的細胞毒性大得多。美登素為有絲分裂抑制劑。已報導以美登素活體內處理L1210細胞導致67%的細胞聚集於有絲分裂中。已報導未經處理的比對細胞顯示3. 2 %至5. 8 %之間的有絲分裂指數 (Sieber 等人，43 Comparative Leukemia Research 1975，Bibl. Haemat. 495-500 (1976))。 海膽卵和蛤蜊卵的實驗已表明，美登素通過抑制微管蛋白質(微管蛋白)的聚合幹擾微管形成來抑制有絲分裂(Remillard 等人，Sciencel89 1002-1005 (1975))。活體外，已發現以10_3 to 10_11^/^1劑量的美登素即可抑制？388、1^1210和 LY5178鼠科白血病細胞懸浮液，其中P388細胞株最敏感。也已顯示美登素是人類鼻咽癌細胞活體外生長的活性抑制劑，且報導人類急性淋巴母細胞白血病細胞株CEM可由低至 l(T7mg/ml 的濃度抑制(Wolpert-DeFillippes 等人，Biochem. Pharmacol. 24 1735-1738(1975))。活體內，美登素也顯示具有活性。顯示在50至100倍劑量範圍內抑制P388淋巴母細胞白血病系統的腫瘤生長，這表明具有高治療指數；L1210小鼠白血病系統、人類 Lewis肺癌系統和人類B-16黑素癌系統也顯示顯著抑制活性(Kupchan，Ped. Proc. 33 2288-2^5(1974))。目前偶聯maytansinoids和細胞結合劑(諸如抗體)的方法包括兩個反應步驟。首先將細胞結合劑(例如抗體)以交聯試劑(諸如N-琥珀醯亞胺基吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP))改質以將二硫代吡啶基引入抗體(Carlsson等人，Biochem. J. 173 723-737(1978)；美國專利第5，208，020號)。在第二個步驟中，將具有硫醇基的反應性 maytansinoid (諸如DMl (形式上稱為N2'-去乙醯基-N2' _ (3-巰基-1-氧代丙基))-美登素)作為起始試劑添加至經改質抗體中，導致改質抗體中硫代吡啶基的置換，及由二硫化物連接的細胞毒性maytansinoid/抗體偶聯物的產生(美國專利第5，208，020號)。在美國專利第6，441，163號中描述用於偶聯maytansinoids的一步驟工藝。由 ImmUnogen Corporation (Cambridge, MA)可獲得基於 Maytansinoid 的免疫毒素技術。另一種重要的毒素技術是基於auristatin毒素。Auristatins衍生自由印度洋海的海兔獲得的海兔毒素Dolastatin 10，作為有效的細胞生長抑制物質。見美國專利第4，816，444號和第4，978，744號。關於其它的海兔毒素，也見美國專利第4，414，205號 (Dolastatin-l、2 和 3)、第 5，076，973 號(Dolastatin-3)、第 4，486，414 號(Dolastatin-A 和 B)、第 4，986，988 號(Dolastatin-13)、第 5，138，036 號(Dolastatin-14)和第 4，879，278號(dolastatin_15)。由Dr. Pettit和亞利桑那州大學的同事分離和合成的各種 auristatine衍生物已經測試且顯示出對細胞的高度毒性。見Pettit等人，抗腫瘤劑337。 海兔毒素 10 結構改質的合成。Anticancer Drug Des. 10(7) :529-44(1995)，Woyke 等人。 有效海兔毒素10結構改質auristatin PHE的細胞外活性和後抗真菌作用。Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 :3580-3584 (2001)，Pettit 等人。海兔毒素 10 禾口月太 行生物對抗新生隱球菌的特異性活性。Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 2961-2965(1998) ,Woyke0新生隱球菌細胞周期期間微管的三維顯影和auristatin PHE對微管整體性和核位置的影響。Submitted，Antimicrobial Agents and Chemotherapy。近來，已研發在作為有效負載在抗體上傳遞時似乎相當有效的其它auristatin 衍生物。例如，已顯示單甲基auristatin E(MMAE)在與腫瘤特異性抗體偶聯時作為對於月中瘤細胞的有效毒素。Doronina 等人，Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. (2003)( 線可得)；Francisco 等人，cAClO-vcMMAE, an anti-CD30_monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity. Blood. (2003)May 8 [E 印刷前公開].Epub2003 Apr 24(在線可得)。除auristatin分子的毒性之外，研究已顯示經肽連接的偶聯物更穩定，且因此在緩衝劑和血漿中比其它連接子技術對正常組織的特異性更大且毒性更小。Doronina 等人，Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. (2003)(在線可得)；Francisco 等人，cAC 10-vcMMAE, an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity. Blood. (2003)May 8[E 印刷前公幵]·' Epub 2003 Apr 24(在線可得)。這些連接子基於支鏈肽設計且包括例如mAb-纈氨酸-瓜氨酸-MMAE和mAb_苯丙氨酸-賴氨酸-MMAE 偶聯物。Doronina 等人，Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. (2003) ( ^οΤ Ι) ；Francisco ^A. cAC 10-vcMMAE, an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity. Blood. (2003)May 8 [E B\i 刷前公開].'Epub 2003 Apr 24(在線可得)。這些設計和偶聯技術由以下所述，例如 King等人的Monoclonal antibody conjugates of doxorubicin prepared with branched peptide linkers inhibition of aggregation by rnethoxytriethyleneglycol chains. J Med Chem. 45(19) :4336-43(2002)和 Dubowchik 等人的 Cath印sin B-sensitive dipeptide prodrugs. 2. Models of anticancer drugs paclitaxel (Taxol), mitomycin C and doxorubicin. Bioorg Med Chem Lett. 8 (23) :3347-52 (1998)。基於前述的 Auristatin E- 1 ^:^ Seattle Genetics Corporation (Seattle, WA) "SJH。存在大量由自然源萃取物及半合成和合成類似物獲得的影響微管的新穎化合物，其似乎具有作為用於產生免疫偶聯物的毒素的潛能。(見newmedinc.com網站)。這些分子及使用這些分子的藥物實例包括以下秋水仙鹼-位點結合劑(Curacin)、風車子素(AVE806，風車子素 A-4 前藥(CA4P)，0xi-4503)、隱藻素(LY!355703)、Discodermolide、 Dolastatin 禾口 Analogs (Auristatin PHE、Dolastatin 10、ILX-651、Symplostatin 1、 TZT-1027)、埃博黴素(BMS-247550、BMS-310705、EP0906、K0S-862、ΖΚ-ΕΡ0)、榴塞洛素 (Eleutherobin) ,FR182877,Halichondrin B(E7389)、月節三甲氯銨(Halimide) (NPI-2352 和 NPI-2358)、Hemiasterlins (HTU86)、Laulimalide、Maytansinoids ( 「 DMl 「) (Bivatuzumab 美登素、Cantuzumab 美登素、huN901-DMl/BB_10901TAP、MLN591DM1、 My9-6-DMl、曲妥珠單抗(Trastuzumab)-DMl), PC-SPES, Peloruside A、白藜蘆醇 (Resveratrol)、S-烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)、海綿素(Spongistatin)、維提島醯胺 (Vitilevuamide)、分子發動機-驅動蛋白(Molecular Motor-Kinesins) (SB-715992)、設計的秋水仙鹼-位點結合劑(A-289099, A-293620/A-318315, ABT-751/E7010, D-24851/ D-64131，ZD6U6)、其它新穎紡錘體毒素甲氧雌二醇0-ME2)，苯並咪唑氨基甲酸酯 (ANG 600 系列，甲苯咪唑)，CP248/CP461, HMN-214, R440, SDX-103，T67/T607)。此外，在 1998年的Mayer, A. M. S. Marine Pharmacology :Antitumor and Cytotoxic Compounds. ThePharmacologist. 41(4) :159-164(1999)中評論了其它的鼠科衍生毒素。治療投予和配方延長的作用時間可以通過交替的非經腸途徑(諸如，靜脈內、皮下或肌肉內注射) 使得給料進程較不頻繁且更為便利。當用於活體內投予時，本文所述的抗體配方應該是無菌的。例如，這可易於通過在凍幹和重組之前或之後經無菌過濾膜過濾來實現。抗體通常以凍幹形式儲存或儲存在溶液中。治療抗體組合物通常放置在具有無菌存取入口的容器中，例如，具有可回收配方的接合器(諸如皮下注射針可穿過的塞子)的靜脈內溶液袋或小瓶。抗體投予的路徑是根據已知方法，例如通過靜脈內、腹膜內、腦內、肌肉內、眼內、 動脈內、鞘內、吸入或病灶內途徑，或通過如下文所述的緩釋系統注射或灌輸。抗體優選通過灌輸或通過大丸劑注射連續投予。治療學上採用的抗體的有效量取決於(例如)治療對象，投藥途徑和患者的病況。 因此，對於治療學家而言，優選視需要滴定劑量並改良投藥路徑以獲得最優的治療效果。理論上，臨床醫師將投予抗體，直到達到理想效果的劑量。這種療法的進程易於通過常規的檢定或通過本文所述的檢定來控制。如本文所述的抗體可在含有醫藥學上可接受的載劑的混合物中製備。治療組合物可優選以液體或粉末氣溶膠(經凍幹)的形式經靜脈內或經鼻或肺投予。組合物也可以視需要非經腸或經皮下投予。當進行全身性投予時，治療組合物應該是無菌，無熱源且在非經腸可接受的具有應有PH值、等滲性和穩定性的溶液中。這些條件為所屬領域的技術人員所已知。簡而言之，通過將具有所需純度的化合物與生理學上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備化合物劑量配方以供儲存和投予。這些材料在所採用的劑量和濃度時對於接受者是無毒性的，且其包括緩衝劑，諸如TRIS HC1、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽和其它有機酸鹽；抗氧化劑，諸如抗壞血酸；低分子量(小於約十個殘基)肽，諸如聚精氨酸；蛋白質，諸如血白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，諸如甘氨酸、穀氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖及其它碳水化合物，包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA ；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡離子，諸如鈉和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENPLURONICS或聚乙二醇。用於注射的無菌組合物可根據Remington' s Pharmaceutical Sciences(第18 版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1990)中所述的常規醫藥實踐來調配。例如，可能需要活性化合物在諸如水或天然發生的植物油，如芝麻油、花生油或棉籽油的媒介物，或如油酸乙酯或其類似物的合成脂肪媒介物中的溶解液或懸浮液。可根據可接受的醫藥實踐併入緩衝劑、防腐劑、抗氧化劑及其類似物。緩釋製劑的合適實例包括含有多肽的固體疏水性聚合物的半透性基質，所述基質為成形物件、膜或微膠囊的形式。緩釋基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如，由Langer等人的 J. Biomed Mater. Res.，(1981) 15 :167-277 和 Langer 的 Chem. Tech.，(1982) 12 :98-105 所述的聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國專利第3，773，919 號、EP 58，481)、L-穀氨酸和γ乙基_L_穀氨酸酯的共聚物(Sidman等人的Biopolymers， (1983)22 :547-556)、非降解伸乙基-乙酸乙烯酯(Langer等人，上述)、降解乳酸-乙醇酸共聚物，諸如LUPRON Depot (由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)和聚-D- (-) -3-羥基丁酸(EP 133，988)。儘管諸如伸乙基-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物使得可釋放分子100天， 但某些水凝膠仍持續較短時間釋放蛋白質。當包膠蛋白質在體內長時間保留時，它們可能因為暴露於37°C的溼氣下而變性或聚集，導致生物活性的喪失且可能改變免疫原性。可根據所涉及的機理設計合理的策略以供穩定蛋白質。例如，如果發現聚集機理為經二硫化物互換形成分子間S-S鍵，就可以通過改質硫氫基殘基、自酸性溶液中凍幹、控制溼氣含量、 使用合適的添加劑和研發特異性聚合物基質組合物來達到穩定。緩釋組合物也包括懸浮於可將晶體保持在懸浮液中的合適配方中抗體晶體的製劑。當通過皮下或腹膜內注射時，這些製劑可產生緩釋效應。其它組合物也包括脂質體截留的抗體。含有這些抗體的脂質體由本身已知的方法來製備美國專利第DE3，218，121 號、Epstein 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985)82 :3688-3692, Hwang 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980)77 :4030-4034,EP 52,322,EP 36，676、EP88,046、EP 143,949、 142，641、日本專利申請案第83-118008號、美國專利第4，485，045號和第4，544，545號及 EP 102,324ο用於給定患者的抗體配方的劑量可由主治醫師結合考慮已知的各種因素來測定以改質藥物的作用，包括疾病的嚴重程度和類型、體重、性別、飲食、投藥時間和路徑、其它藥劑和其它相關臨床因素。治療有效劑量可通過活體外或活體外方法來測定。治療學上採用的抗體的有效量取決於(例如)治療對象，投藥途徑和患者的病況。 因此，治療學家優選視需要滴定劑量並改良投藥路徑以獲得最優的治療效果。根據上文提及的因素，一般的日劑量可在約0.001mg/kg到多至100mg/kg或更多之間。理論上，臨床醫師將投予治療抗體，直到達到理想效果的劑量。這種療法的進程易於通過常規的檢定或如本文所述來控制。應了解，根據本文的組合物和方法進行的治療實體的投予應與併入配方中的合適載劑、賦形劑及其它試劑一起投予，以提供經改良的轉移、傳遞、耐受性及其類似性質。 在所有藥劑化學師已知的配方中可發現多種合適配方Remington' s Pharmaceutical kiences (第 18 版，Mack Publishing Company, Easton, PA (1990))，尤其為其文中的 Block, Lawrence的第87章。例如，這些配方包括粉末、漿料、軟膏、膠質物、蠟、油、脂質、 含脂質(陽離子或陰離子)氣泡(諸如Lipofectin )、DNA偶聯物、無水吸收漿料、水中油和油中水乳液、乳液聚乙二醇(各種分子量的聚乙二醇)、半固凝膠和含有聚乙二醇的半固混合物。根據本發明，任何前述混合物可適於治療和療法中，只要配方中的活性成分不會被配方鈍化，且所述配方生理學上相容且可容忍所述投藥路徑。也見Baldrick P.的 「Pharmaceutical excipient development :the need for preclinical guidance.，，， Regul.Toxicol, Pharmacol.32 (2) :210-8(2000) ；Wang W. ^"Lyophilization and development of sol id protein Pharmaceuticals·」，Int. J. Pharm. 203 (1-2) 1-60(2000) ；Charman WN 的"Lipids，lipophilic drugs，and oral drug delivery-some emerging concepts. 」 J Pharm Sci. 89(8) :967-78(2000) ；Powell ·入的 「Compendium of excipients for parenteral formulations」， PDA J Pharm Sci Technol.52 238-311(1998)且其中引用的與配方、賦形劑和載劑相關的額外信息已為藥劑化學師所熟知。
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抗體的製備如本文所述，抗體可通過使用如下文所述的XenoMouse 技術來製備。所述小鼠隨後即可產生人類免疫球蛋白分子和抗體，但不足以產生鼠科免疫球蛋白分子和抗體。用於達到相同目的的技術揭示於本文所揭示的專利、申請案和參考案中。然而，尤其為關於轉基因生產小鼠及由其產生的抗體的一個實施例揭示於申請於1996年12月3日的美國專利申請案第08/759，620號和1998年6月11日公開的國際專利申請案WO 98/24893和 2000 年 12 月 21 日公開的 WO 00/76310 中。也見 Mendez 等人的 Nature Genetics 15: 146-156(1997)。通過使用這種技術，可生產針對多種抗體的完全人類單克隆抗體。在一個實施例中，將小鼠的XenoMouse 細胞株以令人感興趣的抗原(例如，EGFRvI11)免疫，自表達抗體的小鼠中回收淋巴細胞(諸如B-細胞)，且將所述細胞與骨髓型細胞株融合以製備永生化雜交瘤細胞株，且篩選並選擇這些雜交瘤細胞株以識別產生對於令人感興趣的抗原具有特異性的抗體的雜交瘤細胞株。本文提供用於產生可產生對EGFRvIII具有特異性的抗體的多種雜交瘤細胞株的方法。此外，本發明提供由這些細胞株產生的抗體的表徵，包括這些抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸和胺基酸序列。或者，代替與骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤，根據對初始抗原(優選為EGFRvIII 蛋白質)的反應活性進一步篩選由所回收的細胞產生、自經免疫小鼠XenoMouse 細胞株分離的抗體。所述篩選包括以EGFRvIII蛋白質進行ELISA，活體外結合至穩定表達全長EGFRvIII的NR6M細胞且由NR6M細胞中的抗體內在化EGFRvIII受體。隨後使用 EGFRvIII-特異性溶血性平板檢定分離分泌令人感興趣的抗體的單B細胞(Babcook等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, i93 :7843-7848 (1996))。定靶用於溶菌的細胞優選為以 EGFRvIII抗原塗敷的綿羊紅細胞(SRBC)。在分泌令人感興趣的免疫球蛋白的B細胞培養基和補充物的存在下，平板的形成表明靶細胞的特異性EGFRvIII介導溶菌作用。可分離平板中心處的單抗原-特異性血漿細胞，且編碼抗體特異性的遺傳信息可自單血漿細胞分離。使用反轉錄酶PCR可克隆編碼所分泌抗體的可變區的DNA。所述經克隆DNA隨後可進一步插入合適表達載體中，優選為載體盒，諸如pcDNA，更優為含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恆定結構域的PcDNA載體。隨後，所產生的載體可轉染為宿主細胞，優選為CHO細胞，且培養於經合適改質的常規營養培養基中以供誘發啟動子、選擇轉化體或放大編碼基因的所需序列。本文中描述產生對EGFRvIII具有特異性的抗體的多個單血漿細胞的分離。此外， 將編碼抗-EGFRvIII抗體特異性的遺傳物質分離、引入隨後轉染為宿主細胞的合適表達載體中。來自XenoMouse小鼠的B細胞也可用作遺傳物質的來源，自其可產生抗體展示文庫。所述文庫可使用所述領域的一般技術經由核糖體展示在噬菌體、酵母或活體外製得。經超免疫的XenoMouse小鼠可作為一種豐富來源，自其可分離具有高親和力的抗原_反應性抗體。因此，經對抗EGFRvIII超免疫的XenoMouse小鼠可用於產生抗體展示文庫，自其可分離對抗EGFRvIII的高親和力抗體。所述庫可針對ρ印3寡肽進行篩選，且所得衍生抗體針對表達EGFRvIII的細胞進行篩選以確定對於自然展示抗原的特異性。完全IgG抗體隨後可使用重組DNA技術來表達。例如見W099/53049。一般而言，由上述細胞株產生的抗體具有完全人類IgGl或IgG2重鏈和人類κ輕鏈。在一個實施例中，抗體具有高親和力，當通過固相和溶液相測量時，其一般具有約KT9M 至約10 M的Kd值。在其它實施例中，抗體具有較低的親和力，自約KTfiM至約ΙΟΛ 。如所屬領域的技術人員所了解的，根據本實施例的抗體可在除雜交瘤細胞株之外的細胞株中表達。編碼特定抗體的序列可用於合適哺乳動物宿主細胞的轉型。可通過任何已知方法進行轉型以將多聚核苷酸引入宿主細胞，例如包括將多聚核苷酸封裝於病毒(或病毒載體)中且以病毒(或載體)或通過此項技術中已知的轉染程序轉換宿主細胞，如由美國專利第4，399，216號、第4，912，040號、第4，740，461號和第4，959，455號中所例示。 所使用的轉型程序取決於待轉型的宿主。此項技術中已熟知將異種多聚核苷酸引入哺乳動物細胞中的方法，且其包括右旋糖酐調節轉染、磷酸鈣沉澱、聚凝胺調節轉染、原生質體融合、電擊、多聚核苷酸封裝於脂質體中和DNA直接微注射於胞核中。此項技術中已熟知可用作供表達宿主的哺乳動物細胞株，且其包括由多種由美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))獲得的永生化細胞株，包括 (但不限於)中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞(BHK)、猴腎臟細胞(COS)、 肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)和許多其它細胞株。通過測定哪些細胞株具有高表達水平且產生具有組成型EGFRvIII結合特性的抗體來選擇尤其較優的細胞株。^M提供以下實例，包括進行的實驗和得到的結果僅為了達到說明的目的而並不解釋為對本發明的限制。最初產生EGFRvIII-特異抗體的策略涉及用複合抗原(肽、多種可溶性蛋白質和抗原表達細胞)免疫XenoMouse小鼠，隨後通過融合產生雜種細胞或通過XenoMa^SLAM 技術分離B細胞而分離抗體產生細胞。抗體產生細胞通過ELISA為特異性而呈遞到一級篩選，通過FMAT和/或FACS為細胞表面結合而呈遞到二級篩選。隨後進行內在化檢定以識別可能對藥物輸送有用的抗體。測量這些抗體的親和力。選擇特定抗體進行表位定位。此外，選擇特定抗體進行體內及體外測試以分析這些抗體對治療癌症的功效。實例1'抗原製備A. EGFRvII I PEP3-KLH 抗原製備連同實例2，14-mer 人 EGFRvIII PEP3 (L EEKKGNYVVTDH C (SEQ ID NO 56))肽通過R&D系統常規合成。隨後PEP3肽與匙孔血藍蛋白(KLH)結合，如下EGFRvIII PEP3 (200mcg) (R&D)與 50mcg 的匙孔血藍蛋白(KLH ；Pierce, Rockford, IL)混合併用蒸餾水定容到165mcL·加入250mcl結合緩衝液(0. IM MES, 0. 9M NaCl, pH 4.7)並通過加入 25mcl的10mg/ml的1_乙基_3-[3_ 二甲基氨丙基]碳化二醯亞氨氫氯化物的儲存液(EDC， Pierce, Rockford, IL)使EGFRvIII PEP3和KLH交聯。在室溫下培養結合2小時，使用pH7. 4 的PBS通過IkDa濾膜(離心濾膜，Millipore, Bedford, ΜΑ)將未反應的EDC離心除去。連同實例3，14-mer 人 EGFRvIII PEP3 (L EEKKGNYVVTDH C (SEQ ID NO 56))肽通過R&D系統常規合成。隨後PEP3肽與KLH結合，如下EGFRvIIIPEP3 (200mcg)與 50mcg的匙孔血藍蛋白(KLH ;Pierce，Rockford，IL)混合併用蒸餾水定容到165mcl。加入 250mcl 結合緩衝液(0. IM MES, 0. 9M NaCl，pH 4. 7)並通過加入 25mcl 的 10mg/ml 的 1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二醯亞氨氫氯化物的儲存液(EDC，Pierce，Rockford，IL)使 EGFRvIII PEP3和KLH交聯。在室溫下培養結合2小時，使用pH7. 4的PBS通過IkDa濾膜(離心濾膜，Millipore, Bedford, ΜΑ)將未反應的EDC離心除去。
B. Β300. 19/EGFRvIII 轉染子為了製備B300. 19/EGFRvIII轉染子，從A431細胞初始克隆出野生型EGFR，且用於編碼EGFRvIII的EGFR基因被更改從而缺失編碼殘基6-273的密碼子，而在缺失的連接處產生編碼甘氨酸殘基的密碼子。該缺失發生在缺失GTT(纈氨酸)和CGT(精氨酸)周圍的密碼子內，而得到的缺失後密碼子為GGT (甘氨酸)。(ffikstrand et al. J Neurovirol. 4 (2) 148-58(1998))1.野生型EGFR構建的克隆使用Micro-fast RNA 試劑盒 Qnvitrogen, Burlington, ON)從 A431 (ATCC)中提取聚 A+mRNA。用隨機 pdN6 引物和 M-MuLV 逆轉錄酶(NEB，New England Biolabs, Beverly, Mass.)從polyA+mRNA合成總cDNA。用下列引物由A43IcDNA擴增2. 3kb的PCR產物正義5' -GGATCTCGAGCCAGACCGGAACGACAGGCCACCTC-3' ； (SEQ ID NO 62)反義5' -CGGATCTCGAGCCGGAGCCCAGCACTTTGATCTT-3' (SEQ ID NO 63)使用Pfu DNA聚合酶。將PCR產物用B10I消化，凝膠純化，並連接到被BioI線型化的質粒pWBFNP (見國際專利申請案第WO 99/45031號)中，以產生質粒Wt_EGFR/pWBFNP。2. EGFRvIII 構建的產生用引物對C13659/C29538 和 C29539/C14288 (BioSource International)由質粒 Wt-EGFR/pffBFNP擴增出PCR產物，其中C29538和C29539被T4多核苷酸激酶(NEB，New England Biolabs, Beverly, Mass.)磷酸化C13659 5' -CGGATGAATTCCCAGACCGGACGACAGGCCACCTC-3『(正義)(SEQ ID NO 64)C29538 5' -CTTTCTTTTCCTCCAGAGCC-3『(反義)(SEQ ID NO :65)；C29539 5' -GTAATTATGTGGTGACAGATC-3『(正義)(SEQ ID NO :66)；C14288 5' -CGGATCTCGAGCTCAAGAGAGCTTGGTTGGGAGCT-3『(反義)(SEQ ID NO 67)。被連接以在編碼EGFR細胞外結構域的6至273胺基酸的序列中引入缺失，並亞克隆到表達載體PWBDHFR2中(見國際專利申請案第WO 99/45031號)。用引物對C13659/C29538由 Wt-EGFR/pWBFNP模板用 Pfu聚合酶(NEB，New England Biolabs,Beverly,Mass.)擴增產生代表缺失的5'端的232bp的片段。用EcoRl (NEB,New England Biolabs, Beverly, Mass.)消化並凝膠純化 PCR 產物。用引物對 C29539/C14288 從Wt-EGFR/pWBFNP產生代表缺失的3 『端的1273bp的片段，且用Pfu聚合酶擴增模板。用 Xhol (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.)消化 PCR 產物。用 T4DNA 連接酶(NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.)將片段連接到用 EcoRl/Xhol 消化的 pWBDHFR2 以產生構建 EGFRvIII/pWBDHFR。EGFR的細胞內結構域被引入下列獲得的構建中從質粒Wt_EGFR/pWBFNP中分離出1566bp的片段並連接到用DraIII/Xhol消化的EGFRvIII/pWBDHFR以產生EGFRvIII-FL/ pffBDHFRo3.用 EGFRvIII-FL/pWBDHFR 轉染 B300. 19 細胞:
B300. 19細胞(8xl06)被用於每700 μ 1 DMEM/III介質中的轉染。力口入 20 μ gEGFRvIII-FL/pffBDHFR 和 2μ g CMV-Puro 質粒 DNA。用 Bio-Rad Gene Pulser 在 300voltS/960uF下將細胞電擊。電擊後，在冰上冷卻細胞10分鐘，隨後加入10非選擇性介質(DMEM/HI葡萄糖，10% FBS, 50 μ M BME, 2mM L-穀氨醯胺，100單位青黴素_G/ml，100單位MCG鏈黴素/ml)。在37°C、7. 5% CO2下培養細胞48小時。培養後，將細胞分裂於選擇性介質(DMEM/HI葡萄糖，10% FBS, 2mM L-穀氨醯胺， 50 μ M ΒΜΕ，100單位青黴素-G/ml，100單位MCG鏈黴素/ml，2ug/ml嘌呤黴素)中，在96 孔板中以2X104、0.4X104'和0. OSxlO4細胞/孔的濃度，在選擇性介質中被選擇14天以產生穩定的克隆。將Puro抗性克隆用E752mAb (抗-EGFR抗體，在Yang等人，Crit Rev Oncol Hematol.，38(1) :17-23(2001)中有所描述)和山羊抗人IgGPE染色，隨後在FACS Vantage (Becton Dickinson)上分析。 C.構津 EGFRvIII-RbFc 表汰構津為產生EGFRvIII兔融合蛋白，我們首先構建含有編碼兔Fc的DNA的載體。這與編碼EGFRvIII的DNA連接。下面將詳細描述此方法1. RbFc/pcDNA3. 1 Hygro 的構建(下列)引物1322/867用於擴增編碼兔IgG的Hinge-CH2_CH3結構域的721bp的片段。#1322(正義)5' -GGTGGCGGTACCTGGACAAGACCGTTGCG-3『 (SEQ ID NO 68)#867(反義)5' -ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGAGCGGGA-3『 (SEQ ID NO 69)將得到的PCR產物用KpnI和NotI消化，凝膠純化並連接到用KpnI/NotI消化的 pcDNA3. 1 (+)/Hygro(Invitrogen, Burlington, ON)，以/^tM半立 RbFc/pcDNA3. IHygro。2. EGFRvIII-RbFc/pCEP4 的構建(下列)引物1290/1293用於用Pfu聚合酶擴增自EGFRvIII_FL/pWBDHFR質粒模板的1165bp的產物。#1290(正義)5' -CTACTAGCTAGCCACCATGCGACCCTCCGGGA-3『 (SEQ ID NO 70)#1四3(反義)5' -CGGGGTACCCGGCGATGGACGGGATC-3『 (SEQ ID NO 71)將PCR產物用NheI和KpnI消化，凝膠純化並連接到用Nhel/Kpnl消化的RbFc/ pcDNA3. 1 以產生質粒 EGFRvIII-RbFc/pcDNA3. 1 Hygro02170bp 的 SnaBI/XhoI 片段被從 EGFRvIII_RbFc/pcDNA3. 1 Hygro 中分離出來並亞克隆入SnaBI/XhoI消化的pCEP4(Invitrogen, Burlington, ON)中，以產生質粒 EGFRvIII-RbFc/pCEP4。3.產生 EGFRvIII-RbFc 穩定細胞系用如下方法將質粒EGFRvIH_RbFc/pCEP4通過磷酸鈣轉染引入細胞(Gibco， Grand Island, NY):轉染前一天，lxlO%93F細胞被平板接種到明膠覆蓋的IOOmm組織培養基培養皿中，並在5%C02、37°C下培養。轉染前，用IOml新鮮非選擇性介質(DMEM/F12，10% FBS, 2mM L-穀氨醯胺，100U/ml青黴素G，100U/ml MCG鏈黴素)培養細胞2_3小時。在微離心管中製備轉染試劑，如下:10μ g的DNA (EGFRvII I-RbFc/pCEP4)與62 μ 1的2Μ磷酸鈣混合，並用去離子水定容到500 μ 1。用另一移液管吸取500ul的2XHBS用於轉移所述轉染試齊LU逐滴將移液管中的溶液加入細胞，同時為保持合適的PH值，將細胞置於5% CO2培養箱中直至進行轉染。轉染後15-20小時，用PBS洗滌細胞並用IOml新鮮非選擇性介質餵養細胞。用胰蛋白酶48-72後轉染收穫表達的細胞，並將細胞以0. OSxlO4細胞/孔平板接種到96孔板，置於選擇性介質(DMEM/F12，10% FBS, 2mM L-穀氨醯胺，100U/ml 青黴素G，100U/ml MCG鏈黴素，250ug/ml溼黴素)中14天。使用lug/ml的抗-EGFR抗體E763 (美國專利第6，235，883號)作捕捉抗體並用 1 100稀釋的山羊抗-兔IgG HRPO(CalTag)檢測，通過ELISA篩選溼黴素抗性克隆，。用如下方法製作用於抗體滴定(實例3)的EGFRvIII肽-OVA 使用來自Pierce (#20291)的經預稱量的DTT還原207 μ g EGFRvIII PEP3。使用 100 μ L去離子水溶解小瓶7. 7mg的經預稱量的DTT。將DTT貯存液加入EGFRvIIIPEP3。使用pH 7. 4的PBS將反應液定容到600 μ L。室溫下旋轉反應液30分鐘。通過稱量5克GlO葡聚糖凝膠珠子並加入40mlPBS，混合併在室溫下靜置10分鐘， 然後以IOOOrpm離心珠子10分鐘製成GlO管柱。除去上清液，並再加入20ml的PBS。將珠子在IOOOrpm下離心10分鐘。除去上清液，加入足夠量的PBS以產生50% GlO葡聚糖凝膠珠子的懸浮液。在5ml旋轉柱中加入5ml所述50%懸浮混合物，隨後將該柱置於Hml 聚丙烯管中。將柱子在IOOOrpm下離心3分鐘。另外再加入3ml的PBS，然後再將柱子在 IOOOrpm下離心3分鐘。更換新的聚丙烯管，這樣所述柱子就可以使用了。從還原肽中移除DTT。在將肽還原的30分鐘反應之後，向每個柱子中加入300 μ L 的還原肽。將柱子在IOOOrpm下離心3分鐘。另外再向每個柱子中加入250 μ L的PBS，然後再在IOOOrpm下離心3分鐘。將還原肽收集到Hml的聚丙烯管中。將所述還原肽與用馬來醯亞胺激活的OVA連接，並收集到微量離心管中。將2mg 的馬來醯亞胺激活的OVA用馬來醯亞胺結合緩衝液溶解(Pierce :77126, Rockford IL)以製成10mg/ml貯存液。將414 μ g的馬來醯亞胺激活的OVA加入微量離心管中的還原肽中。 向反應中加入500 μ L馬來醯亞胺結合緩衝液。將反應液在室溫下培養2小時並隨後加入 2mg的半胱氨酸以猝滅可能存在的任何活性馬來醯亞胺基團。室溫下允許所述半胱氨酸再反應30分鐘。將所述偶聯物使用pH 7. 4的IxPBS洗滌並用IOK離心柱離心3次。這去除了沒有與OVA結合的所有自由肽和自由的半胱氨酸。使用凝膠加樣吸頭將所述結合物從離心柱上取下並加入微量離心管中。最後，使用PH 7. 4的IXPBS將結合物定容到期望濃度。 所述結合物的摩爾比為14.5 1(肽OVA)。實例2通過雜種細胞產生製造抗-EGFRvIII抗體將產生具有、-1恆定區的抗體的八隻小鼠(XenoMouse Gl小鼠)在第0天免疫， 然後對於此方案要在第11、21、32、44和M天加強，然後在第58天進行融合。所有免疫均通過在尾根部皮下給藥和腹腔給藥的方式注射。第0天免疫是用1. 5x107B300. 19/EGFRvIH轉染的細胞(實例1A)懸浮在與完全Freunds佐劑(CFA) (Sigma, St. Louis, MO) 1 lv/v混合的無致熱原的DPBS中完成的。第11、21和32天加強是用1. 5xl07B300. 19/EGFRvIII轉染的細胞在與不完全Freunds佐劑(IFA) (Sigma, St. Louis,MO) 1 lv/v混合的DPBS中完成的。第44天加強是用與IFAl lv/v混合的5 μ g的PEP3 (EGFRvIII肽)-KLH結合(實例1)完成的，且最後的加強是用沒有佐劑的DPBS中5μ gPEP3(EGFRvIII肽)-KLH結合完成的。在第58天，對小鼠實施安樂死，隨後回收其腹股溝和腰椎淋巴結。使用組織粉碎機通過機械破壞從淋巴結中釋放出淋巴細胞，隨後通過CD90陰性選擇除去T細胞。通過將洗滌並富集的 B 細胞和購自 ATCC，cat#CRL 1580 (Kearney et al, J. Immunol. 123 1548-1550(1979))的非分泌型骨髓瘤P3)(63Ag8. 653細胞以1 1的比例混合而進行融合。此細胞混合物通過以800g離心被輕輕地沉澱。徹底去除上清液後，用2-細1鏈黴蛋白酶溶液(CalBiochem, cat. #53702,0. 5mg/ml在PBS中)處理不超過2分鐘。隨後，加入 3-5ml FBS終止酶活性，用電細胞融合溶液ECFS (0. 3M蔗糖，Sigma, Cat#S7903,0. ImM醋酸鎂，Sigma，Cat#M2545,0. ImM 醋酸鈣，Sigma，Cat#C4705 (St. Louis, MO))定容至 40ml。離心後除去上清液，通過在40ml ECFS中再次懸浮洗滌細胞。重複洗滌步驟， 再次用ECFS懸浮細胞以達到2xl06細胞/ml的濃度。使用融合產生器(型號ECM2001， Genetronic, Inc.，San Diego, CA)進行電-細胞融合。所用的融合室大小為2. 0ml，並使用下列儀器設置比對條件電壓50V，時間50s，膜破裂條件電壓:3000V，時間:30μ s， 融合後固定時間3s。融合後，在 DMEM(JRH Biosciences) ,15% FCS(Hyclone)並含有 HAT 的溶液中懸浮細胞，並加入L-穀氨醯胺、青黴素-鏈黴素、OPI (草醯乙酸、丙酮酸、牛胰島素)(均購自 Sigma, St. Louis, MO)和 IL-6 (Boehringer Mannheim)在 37VM 10% CO2 空氣中培養。將細胞以4xl04細胞/孔平板接種到平底96孔組織培養板上。在轉移到HT(次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷)補料介質前，培養被保存在HAT (次黃嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷)補料介質中2星期。通過在HAT介質的存活選擇雜種細胞，並用ELISA篩選上清液的抗原活性。ELISA格式需要在抗原塗覆平板(作為計數篩選的EGFRvIII肽-OVA 塗覆平板和野生型EGFr ρ印tide-OVA塗覆平板)上的培養上清液並使用辣根過氧化物酶 (HRP)標記的小鼠抗人類IgG檢測EGFRvIII特異結合(見表2. 1)。表 2. 權利要求
1.一種經分離的人類單克隆抗體，其特異性結合至包含序列LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO 56)的肽亞抑制表皮生長因子(EGF)與表皮生長因子受體VlII (EGFRvIII)的結合，其中所述抗體與選自由 Auristatin E 毒素(AEFP)、單甲基 auristatin E(MMAE) ,Auristatin E、Maytansinoid (DM-I)和ζ-相關蛋白(ZAP)所組成群組的毒素締合。
2.根據權利要求1所述的經分離人類單克隆抗體，其特異性結合至EGFRvIII的抗原決定基，其中所述抗原決定基包含序列LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)。
3.根據權利要求1所述的人類單克隆抗體，其中所述抗體特異性識別一包含 LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)之抗原決定基於位置6處的甘氨酸殘基。
4.根據權利要求1所述的人類單克隆抗體，其中所述抗體進一步結合具有序列 EEKKGNYVVT(SEQ ID NO 57)的肽。
5.根據權利要求1所述的單克隆抗體，其中所述抗體與醫藥上可接受的載體或稀釋劑地和O
6.根據權利要求1所述的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是完全人類單克隆抗體。
7.根據權利要求6所述的抗體，其中所述抗體具有小於1.3 X KT9M的KD。
8.根據權利要求6所述的抗體，其中所述抗體具有小於500pM的KD。
9.根據權利要求1所述的抗體，其中所述抗體可被內在化。
10.根據權利要求1所述的抗體，其與醫藥上可接受的載體或稀釋劑締合。
11.一種在活體外殺死靶細胞的方法，其包括使靶細胞接觸與毒素締合的抗體，其中所述抗體結合至具有序列LEEKKGNY(SEQ ID NO 133)的肽且所述肽是由所述靶細胞所表達，並且其中毒素是Auristatin E毒素 (AEFP)、單甲基 auristatin E(MMAE) ,Auristatin E^Maytansinoid(DM-I)或 ζ-相關蛋白 (ZAP)。
12.根據權利要求11所述的方法，其中與所述毒素締合的所述抗體對所述靶細胞的毒性比對不表達所述肽的細胞的毒性大至少十倍。
13.根據權利要求11所述的方法，其中所述抗體經由肽連接子與所述毒素締合。
14.根據權利要求11所述的方法，其中所述抗體經由第二抗體與所述毒素締合。
15.一種根據權利要求1至10所述的抗體於製備供處理表達表皮生長因子受體 VlII (EGFRvIII)癌細胞的藥物中的用途。
16.根據權利要求15所述的用途，其中所述癌細胞是上皮細胞。
17.根據權利要求15所述的用途，其中所述癌細胞是選自由肺癌、結腸癌、胃癌、腎癌、 前列腺癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤或卵巢癌細胞所組成的群組。
全文摘要
本發明涉及新穎抗體，尤其涉及針對表皮生長因子受體的缺失突變體的抗體，而且尤其涉及III型缺失突變體EGFRvIII。本發明也涉及針對表皮生長因子受體的缺失突變體的人類單克隆抗體，而且尤其為EGFRvIII。本發明也提供這些抗體的診斷和治療調配物，及其免疫偶聯物。
文檔編號G01N33/53GK102558352SQ20111023378
公開日2012年7月11日 申請日期2004年6月25日 優先權日2003年6月27日
發明者喬斯·克爾瓦蘭, 伊恩·福爾茨, 馮曉, 劉穎, 奧裡特·福德, 巧娟·簡·蘇, 布魯斯·基特, 帕拉尼·拉塔納斯瓦米, 拉裡·格林, 斯科特·L·克拉坎普, 楊曉東, 查德威克·T·金, 理察·韋伯, 瓊·古達斯, 羅伯特·拉亞, 賈小池, 賈斯帕·康 申請人:艾默根佛蒙特有限公司