一種增強mlpa檢測snp位點的特異性方法
2023-05-23 20:32:16 2
一種增強mlpa檢測snp位點的特異性方法
【專利摘要】本發明公開了一種增強ＭＬＰＡ檢測ＳＮＰ位點的特異性方法，設計針對Ｋｒａｓ基因２１６Ｇ-ＣＳＮＰ位點的ＭＬＰＡ探針，使用ＭＬＰＡ實驗，觀察其對ＳＮＰ位點檢測時的影響,本發明的核心是在ＳＮＰ位點檢測特異度時減少探針在ＳＮＰ位點的錯配率，可以使用特定化學修飾的核苷酸合成探針，本研究發現使用ＬＮＡ修飾ＭＬＰＡ探針的ＳＮＰ位點後，ＬＮＡ修飾可明顯降低鹼基錯配率，消除假陽性產物峰；但ＬＮＡ修飾探針的檢測靈敏度有所下降，表現為檢測陽性標本時，與未加修飾的ＭＬＰＡ探針相比，產物峰面積下降ＬＮＡ修飾可能導致探針雜交或連接效率下降，降低了ＭＬＰＡ檢測的靈敏度。
【專利說明】—種增強M LPA檢測S N P位點的特異性方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種增強M L Ρ Α檢測S N P位點的特異性方法，屬於基因檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphis m, S NP)是基因組水平上由單個核苷酸變異引起的D ΝΑ序列多態性，包括置換、顛倒、缺失和插入，且任一等位基因在人群中的頻率不小於1 %，隨著人類基因組計劃的完成和S Ν Ρ資料庫Η AP MAP的繪製，S N P檢測在臨床分子診斷、法醫鑑定、新藥研發等領域發揮著越來越重要的作用，常見的S NP檢測方法包括DN A晶片雜交、限制性長度多態性(res t r i c t 1nf ragment 1 engthpolymor ph i s m, R F L P)及等位基因特異性 P CRCallelespe cificPCR，A S - P C R)等，但這些方法均無法同時滿足高通量、高準確度和價格低廉的要求。多重連接依賴性探針擴增(m ultiplexligat1n dependentprobeampl i f i cat i ο η , M L P A)技術由 Schouten 於 2002年發明，可同時檢測4 0多條目標序列的拷貝數變化，且改進後的M L Ρ A技術還可同時檢測RN A、S Ν P位點和甲基化的變化，已在產前、遺傳和腫瘤檢測等領域得到廣泛應用，雖然M L Ρ A反應中的探針連接反應只有當探針和目標序列靶D Ν A完全配對，且兩條探針之間沒有空隙的條件下才可能發生，但由於鹼基之間可能出現錯配，而S Ν P序列只有一個鹼基的區別，導致M L Ρ Α檢測S Ν P時經常由於錯配連接而出現假陽性結果，影響結果判讀。此類由於鹼基錯配導致的假陽性問題在A S - PCR中已通過鹼基修飾、添加阻滯探針等方法得到改善，但在M L Ρ Α中尚未得到解決。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是:提供一種增強M L Ρ Α檢測S Ν P位點的特異性方法，能快速檢測S Ν P位點，以克服現有技術的不足。
[0004]本發明的技術方案
一種增強M L Ρ Α檢測S Ν P位點的特異性方法，設計針對K r a s基因2 1 6 G -C SNP位點的ML PA探針，使用ML PA實驗，觀察其對SNP位點檢測時的影響。
[0005]前述的一種增強M L Ρ Α檢測S Ν P位點的特異性方法中，直接用鎖核酸修飾ΜLΡΑ探針的S ΝP位點或添加阻滯探針均可顯著提高S Ν P檢測時的特異性，3個L NA修飾的阻滯探針能最好地保證檢測的靈敏度和特異性
由於採用上述技術方案，與現有技術相比，本發明的核心是在S Ν P位點檢測特異度時減少探針在S Ν P位點的錯配率，可以使用特定化學修飾的核苷酸合成探針，包括L N八、肽核酸(卩eptidenu cleicaci d , Ρ Ν A)等,這些化學修飾能夠顯著降低鹼基錯配率，L Ν A是一種經過修飾的核酸類似物，和普通核酸分子的區別是碳環的2』-oxygen和4』- ca rbo n位置上引入了亞甲基橋形成鎖狀結構，因此稱為鎖核酸，L Ν Α修飾鹼基的配對特異性高，結合力強，還可以提高寡核苷酸的解鏈溫度，被廣泛用於DN A晶片，螢光原位雜交和螢光定量P C R中，以提高探針雜交的特異性，本研究發現使用L Ν A修飾M L Ρ Α探針的S Ν P位點後，與未加修飾的M L Ρ Α探針相t匕，假陽性產物峰面積明顯下降(32.9vsl8.4，P<0 01)，Ct值明顯上升(41.0 7 v s 3 4.17，P<0.01)31WL Ν A修飾可明顯降低鹼基錯配率，消除假陽性產物峰HML Ν A修飾探針的檢測靈敏度有所下降，表現為檢測陽性標本時，與未加修飾的M L Ρ Α探針相比，產物峰面積下降(80.0 2 v s 9 5.0 0 , P< 0.01，Ct值上升(2 5.2 v s 2 4.5 3 , P< 0.Q 1 )，說明L Ν Α修飾可能導致探針雜交或連接效率下降，降低了M L Ρ A檢測的靈敏度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0006]附圖1為M L Ρ Α探針及阻滯探針序列表；
附圖2為各實驗組探針組成示意圖；
附圖3為各組檢測探針峰面積和C t值比較表；
附圖4為MLΡA產物毛細電泳結果示意圖。
【具體實施方式】
[0007]下面結合附圖對本發明作進一步的詳細說明，但不作為對本發明的任何限制。
[0008]本發明的實施例:
1材料和方法
1.1 主要試劑和儀器
鎖核酸(1 ockednuc 1 e i c a c i d , L N A)引物及探針由上海輝睿生物科技有限公司合成，質粒P c DN A 3 K r a s 2 1 6 G和p c D Ν A 3 Kras2 1 6 C由本室保存，T a q酶(大連寶生物公司)，T 4 - D Ν A連接酶(北京Ν E B公司)，S Y B RG RE EN定量P C RM a s t e rm i x (上海羅氏公司)，測序儀(美國A B I 3 7 3 0 )，定量 P C R儀(美國 A B 1 7 5 0 0 )。
[0009]1.2 方法
1.2.1引物
以包含野生型人K r a s基因(r e f I N M_ 0 0 4 9 8 5.3 |)的pcDNA3-K r a s 2 1 6 G質粒和包含2 1 6位G - C SNP位點K r a s基因的p c D NA3- K r a s 2 1 6 C質粒為模板，設計相應的M L P A探針序列(附圖1 )。
[0010]1.2.2 實驗分組
實驗共分為9組，以探討不同優化方法對M LPAS Ν Ρ檢測結果的影響(附圖2 )。
[0011]1.2.3 ML Ρ Α實驗流程
(1 )將 5 μ 1 DNAfe^:( 2 0 0 n g )置 P C R儀內 9 8 °C變性 5 m i n，然後根據分組加入1.5 μ 1混合探針(根據實驗分組包含不同檢測探針和阻滯探針，每組均加入pcDNA3-cont r ο 1探針,每對探針各5 f m ο 1 / L )和1.5 μ 1雜交緩衝液，9 5 °C變性1 m i η後6 0 V雜交1 6 h ; ( 2 )在雜交產物內加入d d Η 2 0、TaqDNALi g a s ebuf f e r和lUTaqDNALi g a s e ,調至 3 Ο μ1反應體系，5 4 °C孵育1 5 m i η , 9 5 °C滅活5min;(3)取5μ 1連接產物作為模板進行P C R擴增，反應體系2 Ο μ 1，上遊引物Forward為FAM GGTTCCCTAAGGGTTGGA,下遊 Re v e r s e為CTAGATTGGATCTTGCTGGCAC,反應條件:9 5 °C 預變性 2min，95°C 3 0 s , 6 0 °C 3 0s,7 2 °C 3 0 s ;共3 3個循環，7 2 °C 2 0 m i η, 4 °C保存；(4 )取1 μ 1擴增產物，加入 9μ lHiDiformamidehe 和 0.5μ 1ROX500 內參，9 5 V 變性5 m i η，冰上放置2min，ABI373Q毛細電泳儀進行片段分離，G e n e Μa ρ ρ e r 4.0軟體分析結果，計算各產物峰面積，每組實驗重複3次。
[0012]1.2.4 定量PCR檢測各組只加檢測探針和阻滯探針，不加p c DN A3- c ο n t r ο 1內參探針，其餘雜交和連接反應同前，各取2.5 μ 1連接產物作為模板進行定量p c R檢測，引物同前，反應體系為2 0 μ 1，反應條件為9 5 °C預變性2 m iη，9 5 °C 1 5 s，6 Q°C 1 m i η ;共5 Q個循環，計算各組C t值。每組實驗重複3次。
[0013]1.3 統計學分析
使用S P S S 1 2.0統計軟體進行統計學分析，各組毛細管電泳的峰面積比較及定量P C RC t值比較用獨立樣本T檢驗，P< 0.0 5為有統計學意義，由儀器自動確定檢測閾值，比較各組C t值大小(附圖3)。
[0014]2 結果
MLP A毛細管電泳結果分析見附圖4。
[0015]以各組中pcDNA3-cont r ο 1探針的平均峰面積為參照進行標準化，比較各組檢測探針產物的平均峰面積(附圖3 )。
[0016]3 討論
M L Ρ Α作為一種高通量、準確、廉價的基因拷貝數檢測技術，對於一般的基因拷貝數變化檢測已十分可靠，但在檢測S Ν P位點時卻往往因為鹼基錯配的原因出現假陽性產物峰，嚴重影響結果判讀。本研究中組2的錯配產物峰面積達到對照組的1 8.4%，而一般ML ΡA檢測的基因缺失閾值為1 5 %，可見這種錯配產物可嚴重影響結果的判讀，必須加以改進。
[0017]提高S Ν P位點檢測特異度的關鍵在於減少探針在S Ν P位點的錯配率，可以使用特定化學修飾的核苷酸合成探針，包括L Ν A、肽核酸(P eptidenu cleic a c i d，Ρ Ν A)等，這些化學修飾能夠顯著降低鹼基錯配率，L Ν A是一種經過修飾的核酸類似物，和普通核酸分子的區別是碳環的2』-oxygen和4』 - ca rbon位置上引入了亞甲基橋形成鎖狀結構，因此稱為鎖核酸，L Ν A修飾鹼基的配對特異性高，結合力強，還可以提高寡核苷酸的解鏈溫度，被廣泛用於D Ν A晶片，螢光原位雜交和螢光定量P C R中，以提高探針雜交的特異性，本研究發現使用LN A修飾ML Ρ A探針的SNP位點後，與未加修飾的MLPA探針相比，假陽性產物峰面積明顯下降(3 2.9 νs 1 8.4 , Ρ < 0 01)，Ct 值明顯上升(41.0 7 v s 3 4.1 7 , Ρ < 0.0 1 ),說明L N A修飾可明顯降低鹼基錯配率，消除假陽性產物峰HML Ν A修飾探針的檢測靈敏度有所下降，表現為檢測陽性標本時，與未加修飾的ML Ρ A探針相比，產物峰面積下降(80.0 2 v s 9 5.0 0 , P < 0.0 1，Ct 值上升(25.2 v s 2 4.53，P<0.0 1)，說明LNA修飾可能導致探針雜交或連接效率下降，降低了 MLPA檢測的靈敏度。
【權利要求】
1.一種增強M L P A檢測S N P位點的特異性方法，其特徵在於:設計針對K r a s基因2 I 6 G - C S N P位點的M L P A探針，使用M L P A實驗，觀察其對S N P位點檢測時的影響。
2.根據權利要求1所述的一種增強ML P A檢測S N P位點的特異性方法，其特徵在於:直接用鎖核酸修飾M L P A探針的S N P位點或添加阻滯探針均可顯著提高S N P檢測時的特異性，3個L N A修飾的阻滯探針能最好地保證檢測的靈敏度和特異性。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450907SQ201410739866
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月8日 優先權日:2014年12月8日
【發明者】敖雲霞 申請人:敖雲霞