利用稀土元素提高南方紅豆杉細胞培養物中紫杉醇含量的方法
2023-05-23 08:40:41 2
專利名稱:利用稀土元素提高南方紅豆杉細胞培養物中紫杉醇含量的方法
技術領域：
本發明涉及一種在南方紅豆杉植物細胞培養液中添加稀土元素來提高紫杉醇產率的方法。
背景技術：
紫杉醇(taxol)是從紅豆杉屬植物中提取的一種萜類化合物，是當今公認的最有效的抗癌製劑之一。自1967年被首次分離以來，已證明其對白血病、轉移性乳腺癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤、腦癌、頸癌和肺癌均有療效，對睪丸癌、膀胱癌和食道癌的治療也有一定幫助。被美國國立癌症研究所譽為過去十五年內開發的「最好的抗癌製劑」。
現已對紫杉醇的抗癌作用機理有了較清晰的了解。經過近十年的一期、二期臨床試驗，1992年12月29日美國食品與藥物管理局批准紫杉醇用於晚期卵巢癌；1994年4月批准用於乳腺癌。1993年7月瑞典在歐洲國家中第一個同意使用紫杉醇，同年10月歐盟的醫藥產品專賣委員會推薦在歐盟允許使用紫杉醇。在我國含紫杉醇的粗品製劑也獲準使用。
癌症是威脅人類生命的最為嚴重的疾病，預計全球每年需要紫杉醇200-300Kg。然而，紫杉醇主要是從紅豆杉類植物的樹皮中製備，它在原植物中的含量非常之低，一般僅為乾重的0.005％-0.07％；另外，紅豆杉類植物多屬珍稀物種，全世界現存紅豆杉屬植物的數量很少，加之其生長又十分緩慢，這就造成紫杉醇生產的原料供應極度匱乏。由於供不應求，目前紫杉醇的價格非常昂貴，售價高達4000美元/g。因此，建立新的獲取紫杉醇的方法已成為受到高度重視的研究領域，也是當今各國在植物生物技術領域：
爭奪的一個焦點。
目前應用細胞培養生產紫杉醇主要是採用兩步法，即細胞株先在生長培養基中培養一段時間以積累生物量，再轉入生產培養基促使細胞大量合成紫杉醇(專利公開號CN1096820)。另外，在植物細胞培養期間利用改變培養基溫度大量生產紫杉醇，在培養基中於20至25OC下培養紅豆杉屬植物細胞，當植物細胞充分生長後，將培養基溫度變為26至320C並繼續培養(專利公開號CN1237210A)。兩種方法存在著一定的缺陷，兩步法在工業生產上應用不方便，更換培養基既費時，又容易造成培養基汙染。改變培養基溫度大量生產紫杉醇，必須嚴格培養溫度、培養基及其它條件，否則細胞充分生長的時間就有變化，影響紫杉醇含量的增加。
南方紅豆杉是分布在廣東的陽春、乳源和連山的珍貴裸子植物。南方紅豆杉各部位紫杉醇含量分別為根0.02351％、皮0.01777％、果實0.01409％、種子0.01406％、枝條0.01280％和葉0.00946％，比其他紅豆杉屬植物所含紫杉醇含量高，因而造成每年至少50噸的南方紅豆杉樹皮的流失和上萬株南方紅豆杉的毀滅。南方紅豆杉的資源狀況已岌岌可危，處於瀕危狀態，林業部於1992年將其列為一級珍貴保護樹種。
發明內容
本發明的目的是提供一種提高南方紅豆杉細胞培養液中紫杉醇含量的方法，通過篩選合適的稀土元素作為誘導子加入到南方紅豆杉細胞培養液中，使紫杉醇含量明顯提高。
本發明的方法是將南方紅豆杉細胞按常規方法培養15-18天，然後在培養液中加入稀土元素鋱(Tb)或鐿(Yb)，加入量為10-5-10-7mmol/L培養液(最好為10-5mmol/L)，於23-25℃黑暗振蕩繼續培養20-25天(振蕩條件通常為搖床120-125r/min)。
所用的Tb或Yb一般為TbCl3或YbCl3。
所用的培養基為常規培養紅豆杉細胞的培養基(例如B5+NAA1.0+2.4-D0.5+KT0.5培養基)。
本發明通過選用適當濃度的稀土鋱(Tb)或鐿(Yb)作為誘導子，刺激南方紅豆杉懸浮培養細胞，使培養細胞中以及培養液中紫杉醇含量明顯提高，其紫杉醇總含量分別可達到1.2418mg/L、1.3246mg/L，最高釋放率分別為76.1％、78.5％。本發明方法既能提高細胞乾重，又能增加紫杉醇的含量，而且操作方便，只需在南方紅豆杉懸浮培養過程中加入一定量的稀土Tb或Yb，就可明顯增加紫杉醇的含量，適合於工業上應用。所使用的稀土還能誘導細胞積累的紫杉醇分泌至胞外，有利於紫杉醇收集，這對工業化生產具重要價值。
具體實施方式
表3是本發明的實施例1至8所用的稀土及其用量，以及培養後南方紅豆杉培養細胞的紫杉醇產量。各實施例及對照例的培養方法如下1.材料南方紅豆杉細胞懸浮培養液。
2.培養基的配製培養基成分及配比如表1所示，按常規方法配製，得到B5+NAA1.0+2.4-D0.5+KT0.5培養基。
3.稀土的製備將稀土Tb2O3和Yb2O3在鹽酸和鹽酸羥胺中溶解後，加入過量草酸使其沉澱，再用蒸餾水洗滌至沉澱中不含Cl-。沉澱以濃硝酸溶解後，加熱除去多餘的硝酸，控制pH4.5，以二甲酚橙為指示劑，用EDTA溶液標定濃度。
4.培養方法各實施例分別在B5+NA1.0+2.4-D0.5+KT0.5培養基中培養南方紅豆杉細胞15天，再按表3所示加入稀土鋱或鐿，在25℃、搖床120r/min繼續黑暗培養20天。分別測定幹細胞重及紫杉醇的產量。結果如表3所示。
從表3的結果說明，用10-5-10-7mmol/L鋱或10-5-10-7mmol/L鐿作誘導子，可促進南方紅豆杉細胞紫杉醇的合成，在1×10-5mmol/L時誘導效果最好，紫杉醇在細胞內的最大含量分別為0.1107mg/g、0.1126mg/g，在細胞外的最大含量分別為0.3518mg/g、0.4103mg/g，總含量分別為1.2418mg/L、1.3246mg/L，最高釋放率分別為76.1％、78.5％，紫杉醇含量最高分別相對提高28.6％、37.2％。
5.含量測定(1)測量幹細胞重將細胞培養液倒入120目不鏽鋼篩網中，過濾，收穫細胞，蒸餾水清洗3次，用吸水紙充分吸乾細胞表面的水份，稱鮮重，將溼細胞置於60℃烘箱烘至恆重，得幹細胞重。
(2)紫杉醇含量的測定取液體培養物，以4500×g離心20min，取沉澱物稱鮮重，置於40℃下乾燥至恆重。研碎後，加入150ml氯仿，於80℃以下索式抽提器提取4h，回收氯仿。提取物以甲醇定容至10ml，用HPLC測定紫杉醇的含量。另取上清液加入氯仿(1∶1)萃取，超聲乾燥後用HPLC測定紫杉醇的含量。兩者相加，為紫杉醇的總含量。
採用表2中HPLC條件定量分析紫杉醇產量。
表1 南方紅豆杉細胞培養基(B5+NAA1.0+2.4-D0.5+KT0.5)
表2 紫杉醇的定量分析條件
表3 各實施例的稀土用量及培養後南方紅豆杉細胞紫杉醇產量
權利要求
1.一種利用稀土元素提高南方紅豆杉細胞培養物中紫杉醇含量的方法，其特徵是將南方紅豆杉細胞按常規方法培養15-18天，然後在培養液中加入稀土元素鋱或鐿，加入量為10-510-7mmol/L，於23-25℃黑暗振蕩繼續培養20-25天。
2.按照權利要求
1所述的方法，其特徵是稀土元素的加入量為10-5mmol/L。
3.按照權利要求
1或2所述的方法，其特徵是所用的Tb或Yb為TbCl3或YbCl3。
4.按照權利要求
1或2所述的方法，其特徵是所用培養基為B5+NAA1.0+2.4-D0.5+KT0.5培養基。
5.按照權利要求
1或2所述的方法，其特徵是培養過程中的振蕩條件為搖床120-125r/min。
專利摘要
本發明涉及一種利用稀土作誘導子提高南方紅豆杉細胞培養物中紫杉醇含量的方法。將南方紅豆杉細胞按常規方法培養15－18天，然後在培養液中加入稀土元素鋱(Tb)或鐿(Yb)，加入量為10
文檔編號C12N5/04GKCN1390944SQ02134214
公開日2003年1月15日 申請日期2002年6月21日
發明者王艇, 蘇應娟, 吳惠勤, 葛發歡 申請人:中山大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan