纖維素分解酶基因及其用途的製作方法

2023-06-05 17:24:16 1

專利名稱：纖維素分解酶基因及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種使用編碼纖維素分解酶的基因的反義基因處理木屑的方法。
背景技術：
在造紙和紙漿工業中生產的紙漿根據其生產方法的不同分為機械紙漿和化學紙漿。
機械紙漿是通過用機械能物理研磨木纖維而生產的。因為這種機械紙漿幾乎含有所有木成分，因此它可以較高產率生產，並由此，可生產出高度不透明的薄紙。然而，機械紙漿的缺點在於研磨時需要較高的電力，且所生產出來的紙幾乎不具有紙強度。
人們已經廣泛篩選過可解決上述問題且不會降低紙漿產率的微生物。例如，已經報導過在有葡萄糖存在的條件下，用擔子菌Phanerochaete chrysosporium處理榿木第一次精製過的熱機械紙漿(TMP)，然後經過第二次精製，則精製所需的能量降低了25％-30％(Bar-Lev和T.K.Kirk，Tappi J.，65，111，1982)。此外，當用Phanerochaete chrysosporium和Dichomitus squalens處理山楊木時，所得紙的強度高於對照組的強度(Myers.，Tappi J.，105，1988)。Akamathu等人已經在楊木上培養了包括毛革蓋菌在內的10株白腐真菌，從而檢驗紙漿產率、精製能、和紙漿強度。結果，他們發現，在所用菌株中，毛革蓋菌可優選作為木屑預處理中所用的真菌，這是因為這種真菌可降低精製能並增加結晶度。然而，同時，毛革蓋菌可產生約7％的產率(Akamathu等人，Mokuzai gakkaishi，30(8)697-702，1984)。此外，使用從61種類型(85株)的白腐真菌中初步選擇的10種類型的白腐真菌，Nishibe等人已經微生物分解了來源於水胡桃碎屑和軟木的二次精製TMP。之後，他們選擇性地進行去木質作用。他們選擇了Coprinus cinereus和Phanerochaetechrysosporium，它們可導致紙漿纖維更少降解，且他們已經指出在有葡萄糖和尿素存在的條件下，這些真菌可控制紙強度的降低。然而，當在30℃下用上述真菌處理紙漿共14天時，紙漿產率分別降低了6.3％和9.7％。當使用毛革蓋菌時，產率降低了7.5％(Nishibe等人，Japan Tappi，42(2)，1988)。Kashino等人已經從自然界篩選出了白腐真菌IZU-154，且木質素已經選擇性被Phanerochaetechrysosporium和Trametes versicolor分解。他們已經證實當如此處理硬木7天時，精製能降低1/2-2/3。此外，他們還證實了紙漿強度大約增加了2倍。當處理軟木10-14天時，精製能降低2/3，還觀察到紙漿強度增加。當加入培養基時，7天即可獲得相同的結果(Kashino等人，Tappi.J.，76(12)，167，1993)。此外，近來已在U.S.A建立了由研究院和幾個紙漿和造紙公司，包括作為中心的USDA Forest Products Laboratory組成的木質素協會。木質素協會已篩選了一種菌株，其具有較高的分解木質素的能力，和較低的分解纖維素的能力，結果該協會從自然界中新分離出了Ceriporiopsissubvermispora。該協會已經研究出了使用這種菌株可降低機械紙漿所用的能量。該協會已經報導了這種菌株可使生產TMP所需的能量降低近40％，例如在這種情況下，產率降低約3％-5％。該協會還報導了對紙強度沒有所擔心的不利作用，但這種強度稍稍增加。USDA ForestProducts Laboratory已經建造了一個試驗工廠，並在其中進行了分離的Ceriporiopsis subvermispora的驗證試驗。美國工廠考慮在工廠的木屑堆置場進行微生物處理(Scott等人，Tappi J.，81.12.153，1998)。在這種情況下，因保存木屑的木屑堆的內部具有較高溫度，因此甚至在高溫下仍然需要具有作用的菌株。然而因為分離的Ceriporiopsis subvermispora僅在32℃或更低的溫度下具有作用，因此這種真菌不適於實際使用。
此外，已經通過先前篩選獲得的微生物並不是必然對木質素分解具有高度選擇性。因為它們不僅分解木質素而且分解纖維素，它們導致紙漿產率或紙強度降低。因此，進一步希望獲得或生產對木質素分解具有較高選擇性的微生物，即對分解纖維素具有抑制能力並對分解木質素具有極好能力的微生物。
Ander等人已經生產出了對木質素分解具有較高選擇性的突變體。他們已經通過UV輻射將突變引入到Sporotrichum pulverulentum中，如此他們研製出了具有較低纖維素酶活性的菌株Cel44。樺木屑是利用野生型菌株和上述纖維素酶-缺乏的Cel44而被分解的。因此，人們發現前者分解木質素和木聚糖較好，而後者分解木質素和木聚糖較好但幾乎不能分解葡聚糖(Ander和Eriksson，SvenskPapperstidning，18，643，1975)。用這種Cel44處理樺木6周，之後，從其生產機械紙漿。結果，人們發現紙強度增加了(Ander和Eriksson，Svensk Papperetidning，18，641，1975)。此外，已經報導過當使用樺木和松木進行實驗時，用於纖維化和精製纖維所需的能量通過增加處理時間而降低了30％(Eriksson和Vallander.，Svensk Papperstid 85，R33，1982)。他們還從輻射射脈菌生產出了具有較低纖維素酶活性的Cel26。用這種Cel26處理由松木製造的木屑和紙漿，然後從其生產機械紙漿。結果，人們發現紙強度在兩種情況下都沒有提高，但是觀察到精製能降低了。此外，重量降低了2％或更少(Samuelsson等人，Svensk Papperstid，8，221，1980)。
如上所述，已經生產出了具有較低纖維素酶活性的突變株，而且已經考慮了這種突變株在處理機械紙漿中的用途。然而，因為這些突變株是通過紫外輻射而被誘變處理的，它們具有生長速度緩慢和需要花費較長時間分解紙漿的問題。因此，希望生產出一種突變株，它具有正常的生長速度，而且具有被抑制的纖維素分解活性。
另一方面，化學紙漿是通過使用化學品溶解木材的木質素，從而得到纖維素和半纖維素的生產方法獲得的。目前，用氫氧化鈉和硫酸鈉對牛皮紙漿進行去木質作用已經成為主流。相對於機械紙漿而言，牛皮紙漿也是用微生物處理的，並在蒸煮之前經過去木質作用，由此嘗試降低生產能量並提高紙漿質量。
例如，已經報導過當用Phanerochaete chrysosporium處理紅橡木或山楊木30天，則相同Ka值下的產率提高，並由此降低了打漿能，提高了抗拉強度和爆裂強度(Oriaran等人，Tappi，73，147，1990)。同樣，已經根據使用Phanerochaete chrysosporium進行的實驗報導了爆裂強度和撕裂強度的增加(Chen等人，Wood Fiber Sci.，27.198，1995)。Molina等人已經報導了當用Trametes versicolor和Pleurotus ostreatus處理輻射松木時，生產能量可降低11％-14％。然而在使用Trametes versicolor的情況下，觀察到紙漿強度降低(Molina，50thAppita Annual General Conference，pp.57-63，1996；Molina，51stAnnual General Conference，pp.199-206)。Ba jpai等人已經報導過在使用微生物Ceriporiopsis subvermispora進行的實驗中，活性鹼可降低18％，蒸煮時間可降低33％，白液中硫的程度降低30％(P.Bajpai等人，J.Pulp and PaperScience27(7)，235-239，2001)。
如上所述，用微生物處理牛皮紙漿可改善蒸煮，由此導致能量降低。然而，在某些情況下，這種用微生物進行的處理可降低產率或紙強度。因此，在機械紙漿的情況下，對於用微生物進行處理的實際應用而言，需要獲得或生產出對木質素分解具有較高選擇性的微生物，這種微生物具有極好的分解木質素的能力和被抑制的分解纖維素的能力。
在這種纖維素分解酶(分解纖維素的酶)中，一種通常被稱作纖維素酶的酶可將β-1，4-葡聚糖(纖維素)或其衍生物中β-1，4-吡喃葡萄糖基的鍵水解。這種酶廣泛分布在高等植物、微生物如真菌或細菌、軟體動物等中。已知纖維素酶廣義上分為以在內-方式水解纖維素主鏈中的β-1，4-吡喃葡萄糖基鍵的內切葡聚糖酶(CMC酶)，和主要除去纖維素主鏈末端上的纖維二糖殘基的外切葡聚糖酶(微晶纖維素酶)。這些水解酶協同作用於纖維素，以致纖維素底物可降低其分子量從而產生纖維二糖，並進一步，由於β-葡萄糖苷酶的涉及，它可被分解成葡萄糖單元。
此外，纖維二糖脫氫酶是一種氧化還原酶，它可將纖維二糖或纖維低聚糖氧化產生cellobionolactone，並同時，還原醌，如鐵的金屬絡合物，苯氧基，或氧。這種酶在微生物分解纖維素時，與纖維素酶同時產生(Eriksson等人，FEBS Lett.，49，282-285，1974)。此外，這種酶可免除由於纖維二糖造成的纖維素酶活性的抑制，即，免除由於纖維二糖造成的產品的抑制(Igarashi等人，Eur.J.Biochem.，253，101，1998)。從這些事實可以看出纖維二糖脫氫酶與纖維素酶結合促進纖維素的分解。此外，因為纖維二糖脫氫酶可引起Fenton反應，產生可有力分解纖維素的羥基，因此認為這種酶與纖維素的分解十分相關。這種推論還可從Dumonceaux等人生產出具有被抑制的纖維二糖脫氫酶活性的突變株，及其性質的分解結果得到支持。Dumonceaux等人已經使用抗生素菲洛黴素作為指標，通過同源重組生產出了纖維二糖脫氫酶-缺乏株。他們已經報導當使用無定形纖維素作為碳源時，纖維二糖脫氫酶-缺乏株的生長速度與野生型菌株的生長速度幾乎相等，但是當在微晶纖維素上培養時，纖維二糖脫氫酶-缺乏株的生長速度明顯減慢，且纖維二糖脫氫酶-缺乏株可以和野生型菌株相等的水平分解包含在闊葉樹未漂白紙漿中的木質素或合成木質素14C-DHP(Dumonceaux，Enzyme and Microb.29，478-489，2001)。
按照有關纖維二糖脫氫酶等的一般性介紹(G.Henriksson等人，J.Biotechnol.78(2000)93-113)，產生這種酶的微生物的例子包括使木材腐爛的真菌，如Phanerochaete chrysosporium、Trametesversicolor、群交裂褶菌、單純粉孢革菌、Myceliophtorethermophila、或Fumicola insolens。
此外，關於編碼纖維二糖脫氫酶的基因(此後稱作纖維二糖脫氫酶基因)，在Phanerochaete chrysosporium的情況下，例如，已經克隆了K3株的cDNA(Raices等人，FEBS Letters，69，233-238，1995)，和OGC101株的cDNA(Li等人，Appl.Environ.Microbiol.，62(4)，1329-1335，1996)和染色體DNA(Li等人，Appl.Environ.Microbiol.，63(2)，796-799，1997)。此外，關於Trametes versicolor(T.J.Dumonceaux等人，Gene.210.211-219(1998))和朱紅密孔菌(S.M.Moukha等人，Gene，234，23-33，1999)，且，已經報導了纖維二糖脫氫酶基因的存在。
如上所述，纖維二糖脫氫酶和編碼該酶的基因已經公開。然而，沒有關於纖維素分解酶，包括作為典型例子的來源於毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶，或纖維素分解酶基因的報導，而它們是獲得或生產對木質素分解具有較高選擇性的微生物所必需的，用於使用微生物進行處理生產機械紙漿或化學紙漿，也沒有關於應用上述基因的基因重組技術的報導。此外，沒有公開過使用通過這種基因重組獲得的轉化體處理紙漿的有效方法。
另一方面，纖維素分解酶的使用長時間具有吸引人的強烈興趣。例如，纖維素分解酶以各種方式的使用，如將該酶加入到家用洗滌劑中、由於用該酶進行表面處理的纖維素聚合物質、如纖維的重整、廢紙的脫墨處理、或食品加工已經被研究。因此，需要生產大量纖維素分解酶的方法。作為生產大量纖維二糖脫氫酶的嘗試，已經報導過將作為結構有效啟動子的D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶與Phanerochaetechrysosporium的纖維二糖脫氫酶-1基因的上遊連接(Li.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，270，141-146，2000)。然而，因為Phanerochaete chrysosporium在日本被稱作破壞性真菌，而不能使用它。因此，希望研究出一種使用無害微生物生產大量纖維素分解酶，包括作為典型例子的纖維二糖脫氫酶的技術，但迄今為止，還沒有報導過有關使用纖維素分解酶基因，如來源於毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶基因的上述技術。

發明內容
本發明的目的是提供一種使用編碼纖維素分解酶的基因的反義基因處理木屑的方法。
為了解決上述問題，本發明人已經集中研究並廣泛篩選了產生纖維素分解酶，包括作為典型例子的纖維二糖脫氫酶的真菌。結果，他們已經發現毛革蓋菌可產生纖維素分解酶。此外，本發明人還成功克隆了編碼這種纖維素分解酶的基因。此外，他們還研究出了一種使用其反義基因控制上述基因表達的方法。他們已經按照上述方法從木屑生產紙漿，並已經成功控制了產率或紙強度的降低，由此完成了本發明。
也就是說，本發明提供下列特徵(1)一種製造牛皮紙漿的方法，包括下列步驟製備編碼反義RNA的DNA，所述反義RNA與來源於擔子菌的纖維素分解酶基因的轉錄產物的全部或一部分基本互補；製備含有(a)上述DNA，或(b)含有上述DNA的重組DNA和具有啟動子活性的DNA片段的載體，其中上述DNA與上述DNA片段結合，這樣纖維素分解酶基因的反義RNA就可作為轉錄的結果而產生；用上述載體轉化宿主細胞，從而製備具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞；將上述具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞接種到木屑中，而處理它們；並且蒸煮經過處理的木屑。
(2)根據(1)的方法，其中所述纖維素分解酶基因含有選自編碼纖維二糖脫氫酶、纖維二糖水解酶I、纖維二糖水解酶II、屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶、屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶、屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶、和屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶的各基因的一個或多個基因。
(3)根據(2)的方法，其中所述纖維二糖脫氫酶基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的纖維二糖脫氫酶基因(a)SEQ ID No.1或3所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有纖維二糖脫氫酶酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.1或3的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有纖維二糖脫氫酶酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(4)根據(2)的方法，其中所述纖維二糖水解酶I的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的纖維二糖水解酶I的基因(a)SEQ ID No.7、9或11所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有纖維二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.7、9或11的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有纖維二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(5)根據(2)的方法，其中所述纖維二糖水解酶II的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的纖維二糖水解酶II的基因(a)SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有纖維二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.14的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有纖維二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(6)根據(2)的方法，其中所述屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.18的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(7)根據(2)的方法，其中所述屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.20的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(8)根據(2)的方法，其中所述屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.24所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.24的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(9)根據(2)的方法，其中所述屬於糖醇解酶家族9的內切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.28所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.28的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(10)根據(1)-(9)任何一項的方法，其中擔子菌是毛革蓋菌或Phanerochaete chrysosporium。
(11)根據(1)-(10)任何一項的方法，其中宿主細胞是毛革蓋菌。
本說明書包括日本專利申請號第2002-48675的說明書和/或附圖中公開內容的一部分或全部，其是本申請的優先權文件。


圖1是表示本發明纖維二糖脫氫酶作用於纖維二糖的反應的分析結果圖；圖2是表示本發明纖維二糖脫氫酶最佳pH的圖。在圖中，◆代表甘氨酸-HCl，■代表醋酸，▲代表磷酸；圖3是表示本發明纖維二糖脫氫酶的pH穩定性的圖。在圖中，◆代表甘氨酸-HCl，■代表醋酸，▲代表磷酸；圖4是表示本發明纖維二糖脫氫酶的最佳反應溫度的圖；和圖5是表示本發明纖維二糖脫氫酶的熱穩定性的圖。
生物材料保藏說明本發明中涉及的大腸桿菌JM109/pCHCDH1和大腸桿菌JM109/pCHCDH2在獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心(the AIST Tsukuba Central6，Higashi 1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，Japan)中保藏，保藏號分別為FERMBP-8278和FERMB-8279，保藏日期為2002年2月8日。
序列表的描述SEQ ID NO.5是噬斑雜交中所用的探針。
SEQ ID NO.6是噬斑雜交中所用的探針。
SEQ ID NO.13是噬斑雜交中所用的探針。
SEQ ID NO.16是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.17是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.22是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.23是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.26是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.27是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.30是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.31是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.32是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.33是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.34是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.35是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.36是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.37是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.38是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.39是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.40是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.41是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.42是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.43是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.44是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.45是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.46是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.47是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.48是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.49是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.50是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.51是PCR反應中所用的引物。
SEQ ID NO.52是PCR反應中所用的引物。
具體實施例方式
下面將進一步詳細描述本發明。
本發明提供一種處理木屑的方法，包括下列步驟製備編碼反義RNA的DNA，所述反義RNA與來源於擔子菌的纖維素分解酶基因的轉錄產物的全部或一部分基本互補；製備含有(a)上述DNA、或(b)含有上述DNA的重組DNA和具有啟動子活性的DNA片段的載體，其中上述DNA與上述DNA片段結合，這樣纖維素分解酶基因的反義RNA就可作為轉錄的結果而產生；使用上述載體進行轉化，從而製備具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞；並將上述具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞接種到木屑中，由此處理它們。
在本說明書中，可使用任何類型的擔子菌，只要它具有分解纖維素的能力。特別優選毛革蓋菌，它的日本名稱是Aragekawaratake。
此外，對纖維素分解酶基因沒有特別限制，只要該酶可分解纖維素。這種纖維素分解酶基因的優選例子可包括纖維二糖脫氫酶基因、纖維二糖水解酶I基因、纖維二糖水解酶II基因、和內切葡聚糖酶基因。更具體而言，可使用下面1-7中描述的各種基因。值得注意的是，這些基因可單獨使用，但它們也可以一種或多種類型組合的形式使用。
1.一種含下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的纖維二糖脫氫酶基因(a)SEQ ID No.1或3所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有纖維二糖脫氫酶酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.1或3的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有纖維二糖脫氫酶酶活性的蛋白的核苷酸序列。
2.一種含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的纖維二糖水解酶I的基因(a)SEQ ID No.7、9或11所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有纖維二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.7、9或11的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有纖維二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
3.一種含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的纖維二糖水解酶II的基因(a)SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；
(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有纖維二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.14的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有纖維二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
4.一種含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.18的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
5.一種含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.20的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
6.一種含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.24所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID NO.24的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
7.一種含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.28所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列在嚴格條件下雜交、並編碼具有屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID NO.28的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，並編碼具有屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
上面1.中描述的纖維二糖脫氫酶基因可通過下列過程獲得。
染色體DNA是通過提取染色體DNA的常規方法，如Yelton等人的方法從毛革蓋菌製備的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，1470(1984))。隨後，用部分分解的適宜限制酶如Sau3AI處理所得的染色體DNA，然後通過蔗糖密度梯度超速離心分離所得產物，從而獲得10kbp-25kbp大小的DNA片段。將所得DNA片段與噬菌體DNA連接，其已經用產生相同粘性末端的限制酶處理過。EMBL3(A-M，Frishauf等人，J.Mol.Biol.170，827(1983))λ噬菌體DNA是這種噬菌體DNA的例子。使所得與DNA片段連接的噬菌體經過體外包裝，將所得產物用作染色體DNA文庫。進行亞克隆時，可使用通常所用的克隆載體，優選大腸桿菌載體。例如，可使用pUC質粒，如pUC18(C.Yanisch-Perron等人，Gene，33，103(1985))。克隆載體不限於上述例子，還可使用可商業得到的克隆載體或在公開出版物中描述的已知載體。
為了從上述染色體基因文庫分離纖維二糖脫氫酶基因，用賴氨醯內肽酶完全消化從毛革蓋菌獲得並已純化的纖維二糖脫氫酶，然後使消化物經過胺基酸測序。之後，使用合成DNA探針進行噬斑雜交，其中所述合成DNA探針是以從所得胺基酸序列估計的核苷酸序列為基礎生產的，從而選擇含有纖維二糖脫氫酶基因的克隆。含有纖維二糖脫氫酶基因的DNA片段是從所選擇的克隆中分離出來的。之後，製備其限制性酶切圖譜，並測定其序列。該序列可通過將上述含有纖維二糖脫氫酶基因的片段插入到適宜的克隆載體(例如，pUC載體，如pUC19)中，然後應用Sanger等人的方法而測定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977))。
按照上述過程，已經測定了SEQ ID NOS1和3所示、編碼來源於毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶的核苷酸序列。SEQ ID No.1所示具有3,420bp核苷酸序列的基因是來源於毛革蓋菌的7,207bp纖維二糖脫氫酶基因組基因的結構基因，其被稱作纖維二糖脫氫酶1基因。SEQID No.3所示具有3,480bp核苷酸序列的基因是來源於毛革蓋菌的5,345bp纖維二糖脫氫酶基因組基因的結構基因，其被稱作纖維二糖脫氫酶2基因。
SEQ ID No.1所示纖維二糖脫氫酶1基因的結構基因部分由16個外顯子和15個內含子(間插序列)組成。
更具體而言，外顯子1位於129-177之間，內含子1位於178-239之間，外顯子2位於240-498之間，內含子2位於499-557之間，外顯子3位於558-667之間，內含子3位於668-716之間，外顯子4位於717-833之間，內含子4位於834-885之間，外顯子5位於886-1028之間，內含子5位於1029-1077之間，外顯子6位於1078-1242之間，內含子6位於1243-1301之間，外顯子7位於1302-1374之間，內含子7位於1375-1425之間，外顯子8位於1426-1480之間，內含子8位於1481-1534之間，外顯子9位於1535-2165之間，內含子9位於2166-2223之間，外顯子10位於2224-2351之間，內含子10位於2352-2407之間，外顯子11位於2408-2456之間，內含子11位於2457-2509之間，外顯子12位於2510-2598之間，內含子12位於2599-2653之間，外顯子13位於2654-2799之間，內含子13位於2800-2859之間，外顯子14位於2860-2930之間，內含子14位於2931-2995之間，外顯子15位於2996-3100間，內含子15位於3101-3157之間，外顯子16位於3158-3274之間。此外，由核苷酸序列No.3275代表和正向的區是包括終止子在內的3』-非翻譯區。
此外，人們發現從核苷酸序列分析估計的胺基酸序列是由768個胺基酸殘基組成的胺基酸序列，其在SEQ ID No.2中表示。
另一方面，SEQ ID No.3中所示纖維二糖脫氫酶2基因的結構基因部分由16個外顯子和15個內含子組成。
更具體而言，外顯子1位於159-207之間，內含子1位於208-269之間，外顯子2位於270-528之間，內含子2位於529-587之間，外顯子3位於588-697之間，內含子3位於698-746之間，外顯子4位於747-863之間，內含子4位於864-915之間，外顯子5位於916-1058之間，內含子5位於1059-1107之間，外顯子6位於1108-1272之間，內含子6位於1273-1331之間，外顯子7位於1332-1404之間，內含子7位於1405-1455之間，外顯子8位於1456-1510之間，內含子8位於1511-1564之間，外顯子9位於1565-2195之間，內含子9位於2196-2253之間，外顯子10位於2254-2381之間，內含子10位於2382-2437之間，外顯子11位於2438-2486之間，內含子11位於2487-2539之間，外顯子12位於2540-2628之間，內含子12位於2629-2683之間，外顯子13位於2684-2829之間，內含子13位於2830-2887之間，外顯子14位於2888-2958之間，內含子14位於2959-3025之間，外顯子15位於3026-3130之間，內含子15位於3131-3208之間，外顯子16位於3209-3325之間。此外，由核苷酸序列No.3326代表和正向的區是包括終止子在內的3』-非翻譯區。
此外，人們發現從核苷酸序列分析估計的胺基酸序列是由768個胺基酸殘基組成的胺基酸序列，其在SEQ ID No.4中表示。
此外，在纖維二糖脫氫酶1基因中，SEQ ID No.1所示核苷酸序列中的核苷酸129-核苷酸3274的纖維二糖脫氫酶基因部分是有用的。在纖維二糖脫氫酶2基因中，SEQ ID No.3所示核苷酸序列中的核苷酸159-核苷酸3325的纖維二糖脫氫酶基因部分是特別有用的。
來源於毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶基因的DNA片段可通過PCR從含有上述纖維二糖脫氫酶染色體基因的DNA片段獲得。作為PCR中所用的引物，由大約10-50個核苷酸組成、優選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以SEQ ID NOS1和3所示的上述核苷酸序列為基礎獲得的，以及與其互補的序列，可被用作有義引物和反義引物。例如，可使用SEQ ID No.31所示的有義引物和SEQ ID No.32所示的反義引物(參考實施例12)。
應注意的是，轉化的大腸桿菌菌株，大腸桿菌JM109/pCHCDH1和大腸桿菌JM109/pCHCDH2，它們的基因組DNA含有來源於毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶基因的序列，所述菌株獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心(the AIST Tsukuba Central 6，Higashi1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，Japan)中保藏，保藏號分別為FERM BP-8278和FERM B-8279，保藏日期為2002年2月8日。含有包含在這些保藏菌株中的、SEQ ID No.1或3所示的核苷酸序列的DNA也包括在本發明中。
上面2.中所述的纖維二糖水解酶I基因可通過下列過程獲得。
噬斑雜交是按照與上面1.中所述基因製備相同的方式進行的，從而製備含有纖維二糖水解酶I基因的克隆。含有纖維二糖水解酶I基因的DNA片段是從所選擇的克隆中分離出來的，接著製備其限制性酶切圖譜，並測定其序列。這種測序可通過將含有纖維二糖水解酶I基因的DNA片段插入到適宜的克隆載體(例如，pUC載體，如pUC19)中，然後應用Sanger等人的方法(如上所述)進行。
按照上述過程，測定SEQ ID NOS7、9、或11所示、編碼來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I的核苷酸序列。如此測定的核苷酸序列分別被稱作纖維二糖水解酶I-1基因、纖維二糖水解酶I-2基因、和纖維二糖水解酶I-3基因。
此外，人們發現從上述核苷酸序列分析估計的胺基酸序列分別是SEQ ID No.8所示的由456個胺基酸殘基組成的胺基酸序列、SEQ IDNo.10所示的由456個胺基酸殘基組成的胺基酸序列、SEQ ID No.12所示的由457個胺基酸殘基組成的胺基酸序列。
上述纖維二糖水解酶I-1-I-3基因的DNA片段可通過PCR從含有上述纖維二糖水解酶I-1-I-3的染色體基因的DNA片段獲得。作為PCR引物，由大約10-50個核苷酸組成、優選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以上述核苷酸序列(SEQ ID NOS7、9、和11)為基礎獲得的，以及與其互補的序列，可被用作有義引物和反義引物。
上面3.中所述的纖維二糖水解酶II基因可通過下列過程獲得。
噬斑雜交是按照與上面1.中所述基因製備相同的方式進行的，從而製備含有纖維二糖水解酶II基因的克隆。含有纖維二糖水解酶II基因的DNA片段是從所選擇的克隆中分離出來的，接著製備其限制性酶切圖譜，並測定其序列。這種測序可通過將含有纖維二糖水解酶II基因的DNA片段插入到適宜的克隆載體(例如，pUC載體，如pUC19)中，然後應用Sanger等人的方法(如上所述)進行。
按照上述過程，測定SEQ ID No14所示、編碼來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶II的核苷酸序列。此外，人們發現從上述核苷酸序列分析估計的胺基酸序列是SEQ ID No.15所示的由453個胺基酸殘基組成的胺基酸序列。
上述纖維二糖水解酶II基因的DNA片段可通過PCR從含有上述纖維二糖水解酶II染色體基因的DNA片段獲得。作為PCR引物，由大約10-50個核苷酸組成、優選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以上述核苷酸序列為基礎獲得的，以及與其互補的序列，可被用作有義引物和反義引物。
上面4.中所述的屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶的基因可通過下列過程獲得。
mRNA是從通過使毛革蓋菌在木屑上生長而獲得的細胞體中回收的，然後按照常規方法產生cDNA文庫。為了從所得的cDNA文庫中分離屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶基因，在適宜的瓊脂培養基上形成噬斑，並從其中隨機分離若干噬斑。之後，用兩種類型的適宜引物擴增來源於毛革蓋菌的cDNA部分，並分析其核苷酸序列，從而分離含有屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶基因的DNA片段。
按照上述過程，測定SEQ ID No18所示、編碼屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶的核苷酸序列。此外，人們發現從上述核苷酸序列分析估計的胺基酸序列是SEQ ID No.19所示的由374個胺基酸殘基組成的胺基酸序列。
屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶基因的DNA片段可通過PCR從含有上述屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶基因的DNA片段獲得。作為PCR引物，由大約10-50個核苷酸組成、優選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以SEQ ID No18所示的核苷酸序列為基礎獲得的，以及與其互補的序列，可被用作有義引物和反義引物。
此外，上面5.中所述的屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶的基因可通過下列過程獲得。
按照與上面4.中所述基因製備相同的方式，從cDNA文庫中隨機分離噬斑。之後，擴增來源於毛革蓋菌的cDNA部分，並分析其核苷酸序列，從而分離屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶的基因。
按照上述過程，測定SEQ ID No20所示、編碼屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶的核苷酸序列。此外，人們發現從上述核苷酸序列分析估計的胺基酸序列是SEQ ID No.21所示的由至少215個胺基酸殘基組成的胺基酸序列。
屬於來源於毛革蓋菌的糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶基因的DNA片段可通過PCR從含有上述屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶基因的DNA片段獲得。作為PCR引物，由大約10-50個核苷酸組成、優選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以SEQ ID No20所示的核苷酸序列為基礎獲得的，以及與其互補的序列，可被用作有義引物和反義引物。
此外，上面6.中所述的屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶的基因可通過下列過程獲得。
在適宜的培養基中培養擔子菌Phanerochaete chrysosporium，然後通過上面1.中所述Yelton等人的方法回收染色體DNA。關於所得的染色體DNA，產生兩個適宜的PCR引物，它們是根據Phanerochaetechrysosporium的染色體DNA的資料庫預測的。之後，通過常規方法擴增目標DNA片段，從而獲得屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶基因。
按照上述過程，測定SEQ ID No24所示、編碼來源於Phanerochaete chrysosporium的屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶的核苷酸序列。此外，人們發現從上述核苷酸序列分析估計的胺基酸序列是SEQ ID No.25所示的由386個胺基酸殘基組成的胺基酸序列。
來源於Phanerochaete chrysosporium的屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶基因的DNA片段可通過PCR從含有上述屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶基因的DNA片段獲得。作為PCR引物，由大約10-50個核苷酸組成、優選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以SEQID No24所示的核苷酸序列為基礎獲得的，以及與其互補的序列，可被用作有義引物和反義引物。
此外，上面7.中所述的屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶的基因可通過下列過程獲得。
含有屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶基因的克隆是按照與上面6.中所述基因製備相同的方式，使用適宜的PCR引物製備的。含有屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶基因的DNA片段是從所選擇的克隆中分離出來的，然後製備其限制性酶切圖譜，並測定其序列。這種測序可通過將含有屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶基因的DNA片段插入到適宜的克隆載體(例如，pUC載體，如pUC19)中，然後應用Sanger等人的方法(如上所述)進行。
按照上述過程，測定SEQ ID No28所示、編碼來源於Phanerochaete chrysosporium的屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶的核苷酸序列。此外，人們發現從上述核苷酸序列分析估計的胺基酸序列是SEQ ID No.29所示的由592個胺基酸殘基組成的胺基酸序列。
屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶基因的DNA片段可通過PCR從含有上述屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶基因的DNA片段獲得。作為PCR引物，由大約10-50個核苷酸組成、優選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以SEQ ID No28所示的核苷酸序列為基礎獲得的，以及與其互補的序列，可被用作有義引物和反義引物。
在本方法的第一步中，存在著編碼反義RNA的製備DNA，所述反義RNA與來源於上述擔子菌的纖維素分解酶基因轉錄產物的全部或一部分基本互補。
在本說明書中，術語「反義RNA」是指所含序列與作為上述纖維素分解酶基因轉錄產物的mRNA的全部或一部分基本互補的核苷酸序列，其中，在它存在於細胞中的情況下，它與和其互補的纖維素分解酶基因的mRNA結合，且它由此抑制纖維素分解酶基因的轉錄並抑制其表達。
此外，術語「基本上」在這裡是指只要反義RNA與mRNA結合形成雙鏈，且它抑制mRNA翻譯為蛋白，則所述序列可包含突變，如缺失、取代或添加。
上述序列的長度可適當測定，只要它能夠抑制本發明纖維素分解酶基因中任何一個的表達。它無需與纖維素分解基因的整個核苷酸序列的長度相等。例如，當纖維素分解酶基因的表達被抑制時，所述序列優選含有這種核苷酸序列，即它編碼屬於血紅素-結合位點的SEQ IDNOS2和4中位置80和128上的胺基酸，和與黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)-結合位點相對應的SEQ ID NOS2和4中位置236和241上的胺基酸。
反義RNA的製備和所述序列的使用是通過本領域技術人員已知的常規方法進行的。更具體而言，纖維素分解酶基因的反義RNA可通過進行PCR從而得到纖維素分解酶基因核苷酸序列的外顯子部分而獲得，或通過用適宜的限制酶消化纖維素分解酶基因而獲得。此外，反義RNA還可從纖維素分解酶基因的cDNA獲得。此外，這種反義RNA可以是根據纖維素分解酶基因的核苷酸序列信息人工生產的合成RNA。
在本方法的第二步中，製備了一種載體，它含有(a)編碼上面得到的反義RNA的DNA，或(b)含有編碼上面得到的反義RNA的DNA的重組DNA和具有啟動子活性的DNA片段，其中上述DNA與上述DNA片段連接，這樣纖維素分解酶基因的反義RNA就可作為轉錄的結果而產生。
在本說明書中，表達方式「這樣纖維素分解酶基因的反義RNA就可作為轉錄的結果而產生」用於表示當編碼反義RNA的DNA在宿主中啟動子的作用下，被轉錄到mRNA中時，可產生能夠結合本發明纖維素分解酶基因的mRNA從而形成雙鏈，並由此抑制纖維素分解酶基因表達的反義RNA。
為了使DNA結合DNA片段從而產生反義RNA，編碼反義RNA的DNA可與反義方向(反向)具有啟動子序列的DNA片段下遊連接，然後通過啟動子的作用，它被轉錄到mRNA中。所得mRNA是纖維素分解酶基因核苷酸序列的反義RNA。
對啟動子基因沒有特別限制，只要它是具有啟動子功能的基因片段，但可使用任何類型的基因作為啟動子基因。啟動子基因的例子可包括GPD啟動子和ras基因啟動子。這些啟動子基因可以在基因庫中登記的序列、在公開出版物中描述的序列等為基礎，通過已知的基因組克隆方法或PCR方法獲得。否則，關於保藏的基因，還可使用由於供給需要而可獲得的那些。
含有啟動子序列和纖維素分解酶基因或編碼上述基因反義RNA的DNA的基因可經過限制性位點的引入，或粘性末端處理，如果需要，然後使用適宜的DNA連接酶將它們彼此連接起來。作為重組DNA技術，包括克隆、連接反應、PCR等，例如，可使用在J.Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989，和Short Protocols InMolecular Biology，Third Edition，A Compendium of Methods fromCurrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，Inc.中描述的那些。
對載體的類型沒有特別限制。它是根據用載體轉化的宿主類型而選擇的。作為載體，可使用能夠在原核生物或真核生物宿主細胞中自主複製或能夠在染色體中同源重組的那些。這種載體的例子可包括質粒、病毒包括噬菌體、和粘粒。載體可適當含有選擇性標記、複製起點、終止子、多接頭、增強子、核糖體-結合位點等。原核生物或真核生物，如細菌、高等真菌、酵母菌、動物、或植物所用的各種載體可商業得到，或這些載體在公開出版物等中描述。使用這些載體，可將編碼本發明纖維二糖脫氫酶基因的反義RNA的DNA或重組DNA引入到載體中。
DNA可使用，例如，J.Sambrook等人(如上所述)描述的技術引入。為了將編碼本發明纖維二糖脫氫酶基因的反義RNA的DNA或重組DNA引入到載體中，如上所述，它應被引入到載體中，這樣本發明纖維二糖脫氫酶基因的反義RNA可作為轉錄的結果而產生。
在本方法的第三步中，轉化是用上述載體進行的，從而製備具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞。
這裡可使用任何宿主細胞，只要該細胞在表達編碼本發明纖維二糖脫氫酶基因的反義RNA的DNA時發揮啟動子活性。這種宿主細胞的例子不僅可包括真菌，如擔子菌、真菌、或酵母菌，還可包括其它真核生物(動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、藻類等)和原核生物(細菌、裂殖藻等)。這些之中，優選的宿主細胞是擔子菌，更優選毛革蓋菌。更具體而言，例如，隨後在實施例中描述的營養缺陷型突變株OJI-1078(FERM BP-4210)，其缺少毛革蓋菌的鳥氨酸氨基甲醯基轉移酶，可被用作宿主。
轉化方法的實例可包括氯化鈣/PEG法、磷酸鈣法、醋酸鋰法、電穿孔、原生質體法、原生質球法、脂質轉染、和農桿菌法，但不限於此。
在本方法的第四步中，將上述具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞接種在木屑上，由此處理木屑。
在本說明書中，術語「木屑」用於表示通過將木材機械破碎成2-3cm大小所獲得的木屑。這裡可使用任何類型的木屑，只要它們可從包括針葉樹，如松果松、日本柳松、冷杉、雲杉、花旗松或輻射松在內的樹木，闊葉樹如Fagales、樺、榿、楓、桉、楊、刺槐、柳安木或橡樹獲得，它們可被用作紙漿等的原料。
用具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞處理木屑。如果具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞可在其中充分生長，則木屑可在不經過預處理的情況下直接使用。然而，如果具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞由於預處理而更容易生長，由此殺死其它微生物，那麼優選進行這種預處理以使用高壓滅菌器或通入蒸汽進行消毒。
使用具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞處理木屑的溫度優選10℃-60℃，更優選20℃-30℃。木屑中的水含量設定為20％-80％，優選30％-50％。如果具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞可在沒有空氣供給的條件下充分生長，則無需向木屑中供給空氣。然而，通常可將0.001-1L/(1分鐘)的空氣供給1L木屑(在下文中，空氣供給單位為L/(1分鐘))，且優選將0.01vvm-0.1vvm空氣供給上述體積的木屑。
接種到木屑中的具有被抑制纖維素分解酶活性的宿主細胞用量可適宜測定，除非它降低了紙漿產率或紙強度。
具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞可用滅菌水降解，然後將它們接種在木屑上並在其中培養。否則，可將培養基加入到木屑中，以便處理它們。其中可使用任何培養基，只要具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞可在其中生長。這種培養基的例子可包括碳源，如葡萄糖、纖維二糖、或無定形纖維素。此外，還可使用氮源，如酵母提取物、腖、各種類型的胺基酸、大豆、玉米漿、或氮化合物，如各種類型的無機氮。此外，如果需要，可適當使用各種類型的鹽、維生素、礦物質等。
在用具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞處理木屑的情況下，可在機械紙漿如熱機械紙漿(TMP)、磨碎紙漿(GP)、或精製磨碎紙漿(RGP)的生產中觀察到精製能量的降低或紙強度的增加，在化學紙漿如牛皮紙漿或亞硫酸鹽紙漿的生產中獲得蒸煮的提高或紙強度的增加。
此外，本發明方法中使用的具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細胞還可用於生產纖維素分解酶，其包括在適宜的培養基中培養和所產生的纖維素分解酶的回收。
在這種情況下，當纖維素分解酶以具有信號肽的融合形式被表達或翻譯時，它是以分泌物的形式產生的，且可從培養基中直接分離它。相反，當纖維素分解酶以非分泌物的形式產生時，細胞可被分離，然後通過處理，如超聲波處理或勻化而被分解，從而獲得細胞提取物，且可從提取物中分離纖維素分解酶。酶的分離和純化可通過使用，如溶劑提取、鹽析、脫鹽、有機溶劑沉澱、超濾、離子交換、疏水相互反應、HPLC、凝膠過濾和親和色譜、電泳、或色譜聚焦的單一方法或若干方法的組合來進行。
例如，使GPD啟動子，一種ras啟動子與本發明纖維素分解酶基因的上遊連接，接著通過應用重組DNA技術，產生大量纖維素分解酶。上述啟動子，例如，可從含有來源於毛革蓋菌的GPD啟動子基因的重組大腸桿菌，即大腸桿菌JM109/pCHGP(FERM P-15015)製備，上述啟動子還可從含有來源於毛革蓋菌的ras啟動子基因的重組大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pCHRAS(FERM P-17352)製備。
本發明方法中所用的由纖維二糖脫氫酶基因編碼的蛋白(纖維二糖脫氫酶)具有下列物理化學性質。
(1)作用纖維二糖脫氫酶的活性是通過在Method in Enzymology中描述的方法測量的(Wood等人，Vol.160，Academic press，INC.Calfornia)。也就是說，將二氯酚靛酚(由Sigma Chemical Company製造)和纖維二糖(由Kanto Kagaku製造)溶解在pH5的50mM醋酸鹽緩衝溶液中，兩個成分的濃度分別變為0.33mM和0.67mM。之後，將纖維二糖脫氫酶加入到所得緩衝溶液中，接著在37℃下反應。反應開始後，連續測量550nm處的吸光度(光學長度1cm)，即二氯酚靛酚的最大吸收波長。由此獲得圖1所示的結果。
如圖1所示，二氯酚靛酚的降低是由於纖維二糖脫氫酶的還原反應結果而觀察到的。根據當消除反應系統中的纖維二糖或纖維二糖脫氫酶時，沒有觀察到二氯酚靛酚降低的事實，以及雖然使用細胞色素C或Mn(III)-丙二酸絡合物代替二氯酚靛酚，但還是觀察到相同的還原反應的事實，顯然該酶是纖維二糖脫氫酶。
(2)測量滴度的方法纖維二糖脫氫酶的活性是如下測量的。通過將250μl 0.67mM二氯酚靛酚(由Sigma Chemical Company製造)、100μl 3.33mM纖維二糖(由Kanto Kagaku製造)、和100μl pH5的250mM醋酸鹽緩衝溶液混合而生產溶液，之後向混合溶液中加入50μl試驗溶液，接著在37℃下反應。反應開始後，連續測量550nm處的吸光度(光學長度1cm)(摩爾吸收係數3965L/mol/cm)，即二氯酚靛酚的最大吸收波長。關於纖維二糖脫氫酶的活性單位，將1個單位定義為在上述條件下，每分鐘還原1μmol二氯酚靛酚所需酶的量(單位U)。
(3)底物特異性纖維二糖脫氫酶不僅作用於纖維二糖和纖維低聚糖，而且作用於含有纖維素的Avicel和硬木牛皮紙漿。
(4)最佳pH和穩定的pH範圍最佳反應pH和pH穩定性是使用甘氨酸-HCl緩衝溶液(pH2-4)、醋酸鹽緩衝溶液(pH4-6)、和磷酸鹽緩衝溶液(pH6-8)測量的。酶活性是在上述各pH下測量的。結果在圖2中表示。
從圖2可以發現，酶反應的最佳pH是pH4-pH6。此外，酶是4℃下在50mM各緩衝溶液中培養2 4小時，然後測量酶活性。結果在圖3中表示。該酶在pH2-pH5之間穩定。
(5)適於發揮作用的溫度範圍酶活性是在改變反應溫度時測量的。結果在圖4中表示。該酶在20℃-40℃的溫度範圍顯示較高活性。此外，將酶在特定溫度下的50mM醋酸鹽緩衝溶液(pH5)中培養30分鐘，然後測量酶活性。結果在圖5中表示。
從圖5可以發現在40℃下處理30分鐘後，該酶可維持大約80％或更高活性，且在50℃下處理30分鐘後，它可維持大約30％甚或更高活性。
(6)等電點等電聚焦是使用由SERVA Electrophoresis GmbH製造的PRECOAT在pH3-pH10下進行的。因此發現等電點為4.2。
(7)分子量分子量是通過SDS聚丙稀醯胺凝膠電泳測量的。結果，發現分子量約為91,700。
(8)金屬離子或抑制劑的影響將各種物質，如金屬鹽或抑制劑加入到酶溶液中，使濃度變為1mM，接著在4℃下過夜培養。之後，將相同類型的金屬鹽加入到反應溶液中，使濃度變為1mM，然後測量酶活性。結果在表1中表示。從表1可以發現，酶被疊氮化鈉和EDTA較弱抑制，被Hg2+和SDS較強抑制。
表1

而還存在著有關先前已知的纖維二糖脫氫酶的下列報導。
Henriksson等人已經報導了來源於Phanerochaetechrysosporium的纖維二糖脫氫酶具有5.0的最佳反應pH、約4.2的等電點、和89,000的分子量(Eur.J.Biochem.，196(1991)101-106)。然而，該纖維二糖脫氫酶的最佳反應溫度是50℃。
Roy等人已經報導了來源於Trametes versicolor的纖維二糖脫氫酶具有5.0的最佳反應pH、約4.2的等電點、和97,000的分子量(Appl.Environ.Microbiol.，62(1996)4417-4427)。然而，該纖維二糖脫氫酶的最佳反應溫度是50℃。
Fang等人已經報導過來源於群交裂褶菌的纖維二糖脫氫酶(Arch.Biochem.Biophys.，353-1(1998)37-46)。然而，該纖維二糖脫氫酶的最佳反應pH是4.5，其分子量是102,000。他們既沒有描述它的最佳溫度也沒有描述它的等電點。
Schmidhalter、Canevascini等人已經報導過來源於單純粉孢革菌的纖維二糖脫氫酶，其具有約3.9的等電點(Arch.Biochem.Biophys.，300-2(1993)559-563)。然而，該纖維二糖脫氫酶的最佳反應pH是4.0，其分子量是111,000。他們沒有描述最佳反應溫度。
Canevascini等人已經報導過來源於Myceliophtorethermophila的纖維二糖脫氫酶，其具有約4.1的等電點和91,000的分子量(Eur.J.Biochem.，198(1991)43-52)。然而該纖維二糖脫氫酶的最佳反應pH是7.0，其反應最佳溫度沒有描述。
Shou等人已經報導過來源於Humicola insolens的纖維二糖脫氫酶，其具有約4.0的等電點和92,000的分子量(Biochem.J.，330(1991)565-571)。該纖維二糖脫氫酶的最佳反應pH是7.0，其反應最佳溫度是65℃。
如上所述，由本發明方法中所用的纖維二糖脫氫酶基因編碼的纖維二糖脫氫酶在最佳溫度、最佳pH、分子量、和等電點方面不同於已知的纖維二糖脫氫酶。因此，認為這種纖維二糖脫氫酶是一種新的纖維二糖脫氫酶。已知的纖維二糖脫氫酶的物理化學性質在表2中表示。
表2

對具有產生纖維二糖脫氫酶能力的毛革蓋菌沒有特別限制。例如，可使用毛革蓋菌IFO4917株。
來源於毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶可通過，例如，在培養基中培養可產生纖維二糖脫氫酶的毛革蓋菌，並收集所得培養物中的纖維二糖脫氫酶而獲得。具有任何組成的培養基都可被用作上述培養毛革蓋菌的培養基，只要上述真菌可在其中增殖。作為培養基的營養物，可廣泛使用通常在毛革蓋菌培養中所用的那些。其中可使用任何碳源，只要它可被吸收。葡萄糖、紙漿、微晶纖維素等可被用作這種碳源。其中可使用任何可得到的氮化合物作為氮源。例如，酵母提取物、腖、各種類型的胺基酸、大豆、玉米漿、各種類型的無機氮都可被用作這種氮源。此外如果需要，可適當使用各種類型的鹽、維生素、礦物質等。
培養的溫度和pH可在毛革蓋菌能夠增殖的範圍內適當確定。例如，培養溫度是20℃-55℃，更優選25℃-30℃，pH是3-9，優選4-6。
來源於毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶是由於在上述條件下培養毛革蓋菌，而作為分泌產物在培養液中產生的。因此，該酶是從由於培養得到的培養產物中收集的。從培養產物收集的溶液可直接用作纖維二糖脫氫酶粗酶溶液。然而，還可通過鹽析、超濾、或冷凍乾燥而濃縮或合併纖維二糖脫氫酶。此外，纖維二糖脫氫酶可通過硫酸銨分離、凝膠過濾的分子量分離、各種類型的離子交換樹脂、羥磷灰石、疏水色譜、等電分離等而被純化。這些方法可重複進行，且此外如果需要，該方法可與其它純化方法結合使用。
實施例本發明將在下列實施例中更詳細地描述。然而，這些實施例不是對本發明範圍的限制。
來源於毛革蓋菌的染色體DNA文庫的製備在瓊脂平板培養基中培養毛革蓋菌IFO4917株，並使用軟木塞鑽孔器從培養物中切下一直徑5mm的瓊脂片。然後將它接種到200ml的葡萄糖-腖培養基中(其含有2％葡萄糖、0.5％聚腖、0.2％酵母提取物、KH2PO4、和0.05％MgSO4，然後用磷酸調節至pH4.5)，接著在28℃下旋轉搖動7天。培養完成後，收集細胞體，然後用1L滅菌水洗滌。之後，用液氮將細胞體冷凍。
將5g冷凍的細胞體在研缽中壓碎。將壓碎的細胞體轉移到離心試管中，然後向其中加入10ml溶解緩衝溶液(100mM Tris(pH8)、100mMEDTA、100mM NaCl、和蛋白酶K，這樣變為100μg/ml)，接著在55℃下培養3小時。培養完成後，進行苯酚處理和氯仿處理。向水相中逐漸加入乙醇。當DNA沉積時，採集染色體DNA，然後將其混懸在TE溶液中。
用限制酶Sau3AI部分分解100μg所得染色體DNA，然後通過5％-20％蔗糖密度梯度超速離心(30,000rpm，18小時)分離，從而收集具有20-40kbp大小的斷裂部分。使用T4 DNA連接酶將該斷裂部分與Toyobo Co.，Ltd.製造的噬菌體λEMBL3-Bam臂連接。所得噬菌體DNA用STRATAGENE製造的Gigapack Gold包裝。之後，用所得產物感染大腸桿菌P2329，從而得到染色體DNA文庫。
從染色體DNA文庫分離纖維二糖脫氫酶基因含有纖維二糖脫氫酶基因的克隆是通過噬斑雜交從上述染色體DNA文庫中選擇的。按照常規方法進行一系列操作(Sambrook等人，Molecular Cloning A Laboratory Manua l/2ndEdition(1989))。噬斑雜交所用探針是通過使用由Amersham製造的寡DNA標記試劑盒，用螢光素標記具有下列序列的合成寡聚物的3』-末端而獲得的。
5』-TA(T/C)GA(A/G)AA(T/C)AA(A/G)ATT(T/C/A)TT(T/C/A/G)-3』(SEQ ID No.5)結果，4個陽性克隆可從大約40,000個噬斑中選擇。重組噬菌體DNA是通過常規方法從所述陽性克隆製備的，然後用各種類型的限制酶消化它，接著使用上述合成DNA進行DNA雜交。結果，在通過用限制酶XhoI消化獲得的片段中，觀察到與探針雜交的兩個不同克隆，它們是5.3kbp和7.2kbp大小的DNA帶。
通過瓊脂糖凝膠電泳切下上述具有7.2kbp和5.3kbp大小的DNA片段，然後將它們亞克隆到大腸桿菌載體pBluescriptII SK+的XhoI位點中。之後，用載體轉化大腸桿菌JM109株。大量製備亞克隆的DNA，然後通過超速離心(50,000rpm，16小時，15℃)純化，接著測序。核苷酸序列是使用由United States Biochemical製造的測序試劑盒測定的。
核苷酸序列在SEQ ID NOS1和3中表示。人們發現來源於毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶基因在上述核苷酸序列的範圍內被15個內含子斷開。此外，證實了從所述核苷酸序列估計的胺基酸序列(SEQ ID NOS2和4)與迄今為止已經報導過的纖維二糖脫氫酶基因的那些高度相似。
從染色體DNA文庫分離纖維二糖水解酶I-1基因噬斑雜交是按照與實施例2相同的方式進行的。其中所用探針是通過使用由Amersham製造的寡DNA標記試劑盒，用螢光素標記具有下列序列的合成寡聚物的3』-末端而獲得的，其中所述序列是以從其它生物中分離出來的纖維二糖水解酶I基因的核苷酸序列為基礎製備的。
5』-GA(T/C)ATCAAGTT(T/C)ATC(A/G)ATGG-3』(SEQ ID No.6)結果，2個陽性克隆可從大約40,000個噬斑中選擇。重組噬菌體DNA是通過常規方法從所述陽性克隆製備的，然後用各種類型的限制酶消化它，接著使用上述合成DNA進行DNA雜交。結果，在通過用限制酶PstI和NheI消化獲得的片段中，觀察到與探針雜交的克隆，它是3.9kbp的單一DNA帶。
通過瓊脂糖凝膠電泳切下上述3.9-kbp的DNA片段，然後將它亞克隆到大腸桿菌載體pBluescriptsII SK-的PstI-SpeI位點中。之後，用載體轉化大腸桿菌JM109株，從而得到含有來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I-1基因的質粒pCHCBHI26。測定亞克隆的DNA片段的核苷酸序列。
所述核苷酸序列在SEQ IN No.7中表示。人們發現來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I-1基因在上述核苷酸序列的範圍內被2個內含子斷開。此外，從所述核苷酸序列估計的胺基酸序列在SEQ ID No.8中表示。
從染色體DNA文庫分離纖維二糖水解酶I-2基因噬斑雜交是按照與實施例2相同的方式進行的。其中所用探針是通過使用由Amersham製造的寡DNA標記試劑盒，用螢光素標記具有實施例3中所用、SEQ ID No.6所示核苷酸序列的合成寡聚物的3』末端而獲得的。
結果，3個陽性克隆可從大約40,000個噬斑中選擇。重組噬菌體DNA是通過常規方法從所述陽性克隆製備的，然後用各種類型的限制酶消化它，接著使用上述合成DNA進行DNA雜交。結果，在通過用限制酶SalI消化獲得的片段中，觀察到與探針雜交的克隆，它是4.2-kbp的單一DNA帶。
通過瓊脂糖凝膠電泳切下上述4.2-kbp的DNA片段，然後將它亞克隆到大腸桿菌載體pUC19的SalI位點中。之後，用載體轉化大腸桿菌JM109株，從而得到含有來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I-2基因的質粒pCHCBHI27。測定亞克隆的DNA片段的核苷酸序列。
所述核苷酸序列在SEQ IN No.9中表示。人們發現來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I-2基因在上述核苷酸序列的範圍內被2個內含子斷開。此外，從所述核苷酸序列估計的胺基酸序列在SEQ ID No.10中表示。
從染色體DNA文庫分離纖維二糖水解酶I-3基因噬斑雜交是按照與實施例2相同的方式進行的。其中所用探針是通過使用由Amersham製造的寡DNA標記試劑盒，用螢光素標記具有實施例3中所用、SEQ ID No.6所示核苷酸序列的合成寡聚物的3』末端而獲得的。
結果，2個陽性克隆可從大約40,000個噬斑中選擇。重組噬菌體DNA是通過常規方法從所述陽性克隆製備的，然後用各種類型的限制酶消化它，接著使用上述合成DNA進行DNA雜交。結果，在通過用限制酶EcoRI和BamHI消化獲得的片段中，觀察到與探針雜交的克隆，它是4.6-kbp的單一DNA帶。
通過瓊脂糖凝膠電泳切下上述4.6-kbp的DNA片段，然後將它亞克隆到大腸桿菌載體pUC19的EcoRI-BamHI位點中。之後，用載體轉化大腸桿菌JM109株，從而得到含有來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I-3基因的質粒pCHCBHI31。測定亞克隆的DNA片段的核苷酸序列。
所述核苷酸序列在SEQ IN No.11中表示。人們發現來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I-3基因在上述核苷酸序列的範圍內被2個內含子斷開。此外，從所述核苷酸序列估計的胺基酸序列在SEQ ID No.12中表示。
從染色體DNA文庫分離纖維二糖水解酶II基因噬斑雜交是按照與實施例2相同的方式進行的。其中所用探針是通過使用由Amersham製造的寡DNA標記試劑盒，用螢光素標記具有下列序列的合成寡聚物的3』末端而獲得的，其中所述序列是以從其它生物中分離出來的纖維二糖水解酶II基因的核苷酸序列為基礎製備的。
5』-CAGTGGGGOGACTGGTGCAAC-3』(SEQ ID No.13)結果，8個陽性克隆可從大約100,000個噬斑中選擇。重組噬菌體DNA是通過常規方法從陽性克隆製備的，然後用各種類型的限制酶消化它，接著使用上述合成DNA進行DNA雜交。結果，在通過用限制酶EcoRI和NcoI消化獲得的片段中，觀察到與探針雜交的克隆，它是5.0kbp的單一DNA帶。
為了回收上述DNA片段，通過瓊脂糖凝膠電泳切下5.0-kbp的DNA片段，該DNA片段是通過用限制酶NcoI消化，用克列諾夫片段使其平滑，並進一步用EcoRV消化而獲得的。然後將它亞克隆到大腸桿菌載體pUC19的SamI位點中，從而得到含有來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶II基因的質粒pCHCBHII。之後，用該質粒轉化大腸桿菌JM109株。測定亞克隆的DNA片段的核苷酸序列。
所述核苷酸序列在SEQ IN No.14中表示。人們發現來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶II基因在上述核苷酸序列的範圍內被6個內含子斷開。此外，從所述核苷酸序列估計的胺基酸序列在SEQ ID No.15中表示。
毛革蓋菌cDNA文庫的製備將6g乾重的藍桉木屑放在具有9.5cm直徑的玻璃量器中，然後在121℃下滅菌15分鐘。培養基是通過將20ml腖培養基(其含有1.0％聚腖、0.2％酵母提取物、KH2PO4、和0.05％MgSO4，然後用磷酸調節至pH4.5)加入到如此處理的木屑中製備的。之後，使用軟木塞鑽孔器，從毛革蓋菌IFO4917株的瓊脂平板培養物中切下每個均為5mm直徑的瓊脂片，然後將所得的3個瓊脂片接種在上述獲得的培養基中，接著在30℃下靜止培養10天。培養完成後，收集細胞體，然後用液氮冷凍。
之後，通過胍-鹽酸法收集冷凍細胞體中的總RNA。隨後，使用由Takara Shuzo Co.，Ltd.製造的Oligotex-dTsupermRNA純化試劑盒製備多(A)+RNA。之後，使用由STRATAGENE製造的cDNA合成試劑盒合成cDNA，並使EcoRI位點與其5』側連接，使XhoI位點與其3』側連接。然後將它插入到λZAPII載體的EcoRI-XhoI位點中，並使用體外包裝試劑盒生產cDNA文庫。
從毛革蓋菌cDNA文庫中分離屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶基因將實施例7中生產的cDNA文庫溶液適當稀釋至可在量器上分離噬斑，然後用該溶液感染大腸桿菌XL1 Blue MRF』株，接著在37℃下過夜培養，從而形成噬斑。將上述獲得的單一噬斑混懸在SM緩衝液中。使用通用測序引物，M13(-20)引物(GTAAAACGACGGCCAGT，SEQ IDNo.16)和M13反向引物(GGAAACAGCTATGACCATG，SEQ ID No.17)進行PCR反應以擴增cDNA片段。隨機分析由此獲得的cDNA片段的核苷酸序列。結果，發現了編碼屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶的cDNA基因。所述核苷酸序列在SEQ ID No.18中表示，從其估計的胺基酸序列在SEQ ID No.19中表示。
從毛革蓋菌cDNA文庫中分離屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶基因將實施例7中生產的cDNA文庫溶液適當稀釋至可在量器上分離噬斑，然後用該溶液感染大腸桿菌XL1 Blue MRF』株，接著在37℃下過夜培養，從而形成噬斑。將上述獲得的單一噬斑混懸在SM緩衝液中。使用通用測序引物，M13(-20)引物(GTAAAACGACGGCCAGT，SEQ IDNo.16)和M13反向引物(GGAAACAGCTATGACCATG，SEQ ID No.17)進行PCR反應以擴增cDNA片段。隨機分析由此獲得的cDNA片段的核苷酸序列。結果，發現了編碼屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶的cDNA基因。所述核苷酸序列在SEQ ID No.20中表示，從其估計的胺基酸序列在SEQ ID No.21中表示。
從擔子菌Phanerochaete chrysosporium的染色體DNA中分離屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶基因使用軟木塞鑽孔器，從Phanerochaete chrysosporium ATCC34541株的瓊脂平板培養物中切下每個具有5mm直徑的瓊脂片，並將這5片接種到100ml葡萄糖-腖培養基(其含有2％葡萄糖、0.5％聚腖、0.2％酵母提取物、KH2PO4、和0.05％MgSO4，然後用磷酸調節至pH4.5)中，接著在30℃下搖動培養5天。培養完成後，收集細胞體，然後用液氮冷凍。將5g冷凍的細胞體在研缽中壓碎。將壓碎的細胞體轉移到離心試管中，然後向其中加10ml溶解緩衝溶液(100mMTris(pH8)、100mM EDTA、100mM NaCl、和蛋白酶K，這樣它變為100μg/ml)，接著在55℃下培養3小時。培養完成後，進行苯酚處理和氯仿處理。向水相中逐漸加入乙醇。當DNA沉積時，採集染色體DNA，然後將其混懸在TE溶液中，從而產生Phanerochaete chrysosporium的染色體DNA溶液。
使用下述兩個DNA引物，在上述Phanerochaete chrysosporium的染色體DNA溶液上進行PCR反應，從而獲得屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶的染色體基因。
5』-ATGAAGTTACTTCTTGCTCTC-3』(SEQ ID No.22)5』-TCACAGGAAGGGTTCGAGTGC-3』(SEQ ID No.23)所得核苷酸序列在SEQ ID No.24中表示。人們發現來源於Phanerochaete chrysosporium的屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶基因在上述核苷酸序列的範圍內被15個內含子斷開。此外，從所述核苷酸序列估計的胺基酸序列在SEQ ID No.25中表示。
從擔子菌Phanerochaete chrysosporium的染色體DNA中分離屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶基因使用下述兩個DNA引物，在實施例10中製備的Phanerochaetechrysosporium的染色體DNA溶液上進行PCR反應，從而獲得屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶基因。
5』-ATGATACCTCTCCGCTCTGC-3』(SEQ ID No.26)5』-TATCTTCCTGATGCGATTCC-3』(SEQ ID No.27)所得核苷酸序列在SEQ ID No.28中表示。人們發現來源於Phanerochaete chrysosporium的屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶基因在上述核苷酸序列的範圍內被7個內含子斷開。此外，從所述核苷酸序列估計的胺基酸序列在SEQ ID No.29中表示。
使用毛革蓋菌來源的甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子構造毛革蓋菌來源的纖維二糖脫氫酶基因的表達載體將纖維二糖脫氫酶基因的結構基因區與毛革蓋菌啟動子的下遊連接起來，由此用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子區取代原始的纖維二糖脫氫酶基因，從而獲得纖維二糖脫氫酶基因的表達載體。
更具體而言，用EcoRI和BamHI消化甘油醛-3-磷酸脫氫酶的染色體基因，獲得一個3.8-kbp的DNA片段(片段1)。使用T4 DNA連接酶將片段1與噬菌體載體M13mp18的EcoRI-BamHI位點連接起來。用其轉化大腸桿菌JM109株，從而製備單鏈噬菌體DNA。
隨後，合成SEQ ID No.30中所示的DNA引物，並將它退火成上述單鏈噬菌體DNA。然後，通過引物延伸法僅合成GPD基因的啟動子區，並用限制酶EcoRI(由Takara Shuzo Co.，Ltd.製造)消化它，從而製備一個0.9-kbp的DNA片段(片段2)。
5』-CATGGTGTGTGGTGGATG-3』(SEQ ID No.30)另一方面，為了僅提取編碼纖維二糖脫氫酶的成熟酶的基因區，使用質粒pCHCDH1作為模板，用SEQ ID NOS31和32所示用於延長的引物進行PCR反應，從而獲得具有約3.5kbp大小的DNA片段(片段3)。
5』-AAGTTCAAGAGTCTCCTGT-3』(SEQ ID No.31)5』-GGTACAGTACTTATCTGTAT-3』(SEQ ID No.32)用限制酶EcoRI和SmaI(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化大腸桿菌載體pUC18，將上述兩種類型的DNA片段混合，並使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之後用其轉化大腸桿菌JM109株。將其中已經同時插入上述兩種類型的DNA片段-片段2和3的質粒從氨苄西林-抗性轉化株中分離出來。該質粒被稱為pGPCDH1。
構造具有纖維二糖脫氫酶基因的反義序列的質粒按照與實施例12相同的方法獲得一個0.9-kb的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子區片段2。使用T4 DNA連接酶將所得片段2與pUC18的EcoRI-SmaI位點連接起來，用其轉化大腸桿菌JM109株。將其中已經插入上述片段2的質粒從氨苄西林-抗性轉化株中分離出來。該質粒被稱作pCHGP1。用限制酶NcoI-XbaI消化質粒pCHGP1，從而製備載體部分(片段4)。
此外，使用下述兩個引物(SEQ ID NOS33和34)，在含有來源於毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶1基因的質粒pCHCDH1上進行PCR反應，從而擴增一個大約650-bp的DNA片段，該DNA片段含有來源於毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶基因的第8個外顯子。之後，用限制酶XbaI和NcoI消化擴增產物，得到DNA片段(片段5)。
5』-TCTAGATTTACTGGTACCCCAACAACAATG-3』(SEQ ID No.33)5』-CCATGGGTTGATCGACGGGTTGTCAGACACG-3』(SEQ ID No.34)將上述片段4與上述片段5混合，然後用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之後，用其轉化大腸桿菌JM109株。將其中已經插入上述片段5的質粒從氨苄西林-抗性轉化株中分離出來。該質粒被稱為pGPantiCDH1。用限制酶XbaI和HindIII消化質粒pGPantiCDH1，從而製備載體部分(片段6)。
隨後，使用下述兩個引物(SEQ ID NOS35和36)，在含有來源於毛革蓋菌的錳過氧化物酶基因的質粒pBSMPOG1(FERM P-14933)上進行PCR反應，從而擴增錳過氧化物酶的C-末端非翻譯區。用限制酶XbaI和HindIII消化擴增產物，得到大約1-kb的DNA片段(片段7)。
5』-TCTAGAGTCACCTCCGT-3』(SEQ ID No.35)5-AAGCTTGGGTACTGTG-3』 (SEQ ID No.36)將上述片段6與上述片段7混合，然後用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。將其中已經正向插入上述DNA片段7的質粒從氨苄西林-抗性轉化株中分離出來。該質粒被稱為pGPCDHAM。
構造具有來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因的反義序列的質粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質粒pGPCDHAM，從而製備載體部分的DNA片段(片段8)。隨後，使用下述兩個引物，在實施例3中得到的質粒pCHCBHI26上進行PCR反應，其含有來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因，從而擴增一個大約750-bp的DNA片段。之後，用限制酶NcoI和XbaI消化擴增產物，得到DNA片段(片段9)。
5』-TCTAGAGCCAACCTCGAGGGGTGG-3』(SEQ ID No.37)5』-CCATGGGAACGTCGAGCCGATGGG-3』(SEQ ID No.38)將上述片段8與上述片段9混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之後，用其轉化大腸桿菌JM109株。將其中已經插入上述DNA片段9的質粒從氨苄西林-抗性轉化株中分離出來。該質粒被稱作pGPCBHI26AM。
構造具有來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因的反義序列的質粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質粒pGPCDHAM，從而製備載體部分的DNA片段(片段8)。隨後，使用下述兩個引物，在實施例4中得到的質粒pCHCBHI27上進行PCR反應，其含有來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因，從而擴增一個大約750-bp的DNA片段。之後，用限制酶NcoI和XbaI消化擴增產物，得到DNA片段(片段10)。
5』-TCTAGAGCCAACGTCCTCGGCTGG-3』(SEQ ID No.39)5』-CCATGGGTAGGTCGAGCCGATGGG-3』(SEQ ID No.40)將上述片段8與上述片段10混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之後，用其轉化大腸桿菌JM109株。將其中已經插入上述DNA片段10的質粒從氨苄西林-抗性轉化株中分離出來。該質粒被稱作pGPCBHI27AM。
構造具有來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因的反義序列的質粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質粒pGPCDHAM，從而製備載體部分的DNA片段(片段8)。隨後，使用下述兩個引物，在實施例5中得到的質粒pCHCBHI31上進行PCR反應，其含有來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因，從而擴增一個大約750-bp的DNA片段。之後，用限制酶NcoI和XbaI消化擴增產物，得到DNA片段(片段11)。
5』-TCTAGAGCCAACGTCCTCGGCTGG-3』 (SEQ ID No.41)5』-CCATGGAGCGTAGGTCGAGCCAATG-3』(SEQ ID No.42)將上述片段8與上述片段11混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之後，用其轉化大腸桿菌JM109株。將其中已經插入上述DNA片段11的質粒從氨苄西林-抗性轉化株中分離出來。該質粒被稱作pGPCBHI31AM。
構造具有源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶II基因的反義序列的質粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質粒pGPCDHAM，從而製備載體部分的DNA片段(片段8)。隨後，使用下述兩個引物，在實施例6中得到的質粒pCHCBHII上進行PCR反應，其含有來源於毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因，從而擴增一個大約600-bp的DNA片段。之後，用限制酶NcoI和XbaI消化擴增產物，得到DNA片段(片段12)。
5』-TCTAGAATCTACCTGAGCCCTTAC-3』(SEQ ID No.43)5』-CCATGGCTCACTAGTGGCGAGACC-3』(SEQ ID No.44)將上述片段8與上述片段12混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之後，用其轉化大腸桿菌JM109株。將其中已經插入上述DNA片段12的質粒從氨苄西林-抗性轉化株中分離出來。該質粒被稱作pGPCBHIIAM。
構造具有來源於毛革蓋菌的屬於家族61的內切葡聚糖酶基因的反義序列的質粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質粒pGPCDHAM，從而製備載體部分的DNA片段(片段8)。隨後，使用下述兩個引物，在實施例12中得到的來源於毛革蓋菌的屬於糖酵解酶家族61的內切葡聚糖酶cDNA基因上進行PCR反應，從而擴增一個大約600-bp的DNA片段。之後，用限制酶NcoI和XbaI消化擴增產物，得到DNA片段(片段13)。
5』-TCTAGAGCTCACGGTTTCATTCATG-3』(SEQ ID No.45)5』-CCATGGGGTGTAGAGCCCCGGAATG-3』(SEQ ID No.46)將上述片段8與上述片段13混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之後，用其轉化大腸桿菌JM109株。將其中已經插入上述DNA片段13的質粒從氨苄西林-抗性轉化株中分離出來。該質粒被稱作pGPEG61AM。
構造具有來源於毛革蓋菌的屬於家族12的內切葡聚糖酶基因的反義序列的質粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質粒pGPCDHAM，從而製備載體部分的DNA片段(片段8)。隨後，使用下述兩個引物，在實施例9中得到的來源於毛革蓋菌的屬於糖酵解酶家族12的內切葡聚糖酶cDNA基因上進行PCR反應，從而擴增一個大約700-bp的DNA片段。之後，用限制酶NcoI和XbaI消化擴增產物，得到DNA片段(片段13)。
5』-TCTAGAGCGGGCCCGTACTCGCTC-3』(SEQ ID No.47)5』-CCATGGGTAATGTGATTCCTGTCG-3』(SEQ ID No.48)將上述片段8與上述片段13混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之後，用其轉化大腸桿菌JM109株。將其中已經插入上述DNA片段13的質粒從氨苄西林-抗性轉化株中分離出來。該質粒被稱作pGPEG12AM。
構造具有來源於Phanerochaete chrysosporium的屬於家族5的內切葡聚糖酶基因的反義序列的質粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質粒pGPCDHAM，從而製備載體部分的DNA片段(片段8)。隨後，使用下述兩個引物，在實施例10中得到的來源於Phanerochaete chrysosporium的屬於糖酵解酶家族5的內切葡聚糖酶基因上進行PCR反應，從而擴增一個大約600-bp的DNA片段。之後，用限制酶NcoI和XbaI消化擴增產物，得到DNA片段(片段15)。
5』-TCTAGAATGAAGTACTTCTTGCTC-3』 (SEQ ID No.49)5』-CCATGGCGTTTGGCGTACCGTCTG-3』 (SEQ ID No.50)將上述片段8與上述片段15混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之後，用其轉化大腸桿菌JM109株。將其中已經插入上述DNA片段14的質粒從氨苄西林-抗性轉化株中分離出來。該質粒被稱作pGPPCEG5AM。
構造具有來源於Phanerochaete chrysosporium的屬於家族5的內切葡聚糖酶基因的反義序列的質粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質粒pGPCDHAM，從而製備載體部分的DNA片段(片段8)。隨後，使用下述兩個引物，在實施例11中得到的來源於Phanerochaete chrysosporium的屬於糖酵解酶家族9的內切葡聚糖酶基因上進行PCR反應，從而擴增一個大約500-bp的DNA片段。之後，用限制酶NcoI和XbaI消化擴增產物，得到DNA片段(片段16)。
5』-TCTAGACCCCGGTACAGACGCCGC-3』 (SEQ ID No.51)5』-CCATGGGATGTTAGGAATGATCTG-3』 (SEQ ID No.52)將上述片段8與上述片段16混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之後，用其轉化大腸桿菌JM109株。將其中已經插入上述DNA片段15的質粒從氨苄西林-抗性轉化株中分離出來。該質粒被稱作pGPPCEG9AM。
轉化毛革蓋菌的方法a.單核菌株的培養將大約30個、每個具有約6mm直徑的玻璃珠放在500ml-體積的Erlenmeyer燒瓶中。將100ml SMY培養基(1％蔗糖、1％麥芽汁、和0.4％酵母提取物)分配到上述燒瓶中，然後滅菌。之後，使用軟木塞鑽孔器從含有毛革蓋菌OJI-1078株的瓊脂平板培養基上切下一個具有5mm直徑的瓊脂片。然後將該瓊脂片接種在上述SMY培養基中，接著在28℃下靜止培養7天(預培養)。然而，為了使菌絲斷裂，每天搖動燒瓶1次或2次進行混合。隨後，將200ml SMY培養基分配到1L-體積的Erlenmeyer燒瓶中，再向其中加入旋轉器，接著滅菌。之後，通過用尼龍篩(具有30μm孔徑)過濾收集預培養的菌絲，並將菌絲的總量接種在培養基中，接著在28℃下培養。培養時，每天用攪拌器攪拌培養基2小時，從而使菌絲斷裂。該培養進行4天。
b.原生質體的製備通過用尼龍篩(具有30μm孔徑)過濾收集上述液體培養菌絲，然後用滲透調節溶液(0.5M MgSO4、50ml馬來酸鹽緩衝液(pH5.6))洗滌所收集的菌絲。隨後，將100mg溼細胞體混懸在1ml細胞壁-消化酶溶液中。輕輕搖動該混合物的同時，在28℃下培養3小時，並釋放出原生質體。作為細胞壁-消化酶溶液，可結合使用下列可商業得到的酶製劑。也就是說，將5mg Cellulase ONOZUKA(由Yakult製造的纖維素酶ONOZUKA RS)和10mg Yatalase(由Takara Shuzo Co.，Ltd.製造)溶於1mg上述滲透調節溶液中，並將所得溶液用作酶溶液。
c.原生質體的純化使用尼龍篩(具有30μm孔徑)除去上述酶反應溶液中的菌絲片段。之後，為了提高原生質體的回收率，用上述滲透調節溶液洗滌尼龍篩上存留的菌絲片段和原生質體1次。將所得原生質體混懸液離心(1,000k×g，5分鐘)除去上清液。將殘留物混懸在4ml 1M蔗糖(20mM MOPS緩衝溶液，pH6.3)中。將所得混懸液再次離心，用上述1M蔗糖溶液洗滌所得產物2次。將沉澱物混懸在500μl含有40mM氯化鈣的1M山梨糖醇溶液(20mM MES，pH6.4)中，並將所得混懸液用作原生質體溶液。將該溶液在4℃下保存。
使用血細胞計數器，通過用窺器直接觀察來測定原生質體濃度。所有離心操作都是在室溫下，使用搖擺式轉子以1,000×g進行5分鐘。
d.轉化將實施例12中得到的質粒pGPCDH1(2μg)加入到100μl濃度為106個細胞/100μl的原生質體溶液中。此外，作為選擇性標記，將0.2μg含有來源於毛革蓋菌的鳥氨酸氨基甲醯基轉移酶的質粒pUCR1(日本專利
發明者塚本晃, 仲龜誠司, 甲真理, 杉浦純, 阪口壽子, 古城敦 申請人:王子製紙株式會社