用於生產多肽的信號肽的製作方法

2023-05-15 20:29:06

專利名稱：：用於生產多肽的信號肽的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生產多肽的方法，包括使用相對於該多肽為外源的信號肽，含有編碼該信號肽和該多肽的第一和第二核苷酸序列的核酸構建體和含有所述核酸構建體的表達載體和宿主細胞。
背景技術：
：在真菌宿主細胞，特別是諸如麴黴屬(Aspergillus)的絲狀真菌細胞或諸如酵母屬(Saccharomyces)的酵母細胞中重組生產異源蛋白可提供更合適的載體用於以商品相應量生產該蛋白。重組生產異源性蛋白一般通過構建表達盒實現，其中將編碼該蛋白的DNA置於從適合於該宿主細胞的調控基因切下的啟動子表達控制下。將該表達盒導入宿主細胞中。然後通過在表達盒所含的啟動子正常發揮功能所必需的誘導條件下培養轉化的宿主細胞實現該異源蛋白的生產。改進蛋白質的重組生產一般需要獲得適合於控制蛋白質在宿主細胞中表達的新調控序列。本發明的目的是使用信號肽序列提供在真菌宿主細胞中生產多肽的改進方法。本發明的概述本發明提供了生產分泌多肽的方法，包括(a)在有助於多肽生產的培養基中培養真菌宿主細胞，其中該宿主細胞包含核酸構建體，該核酸構建體包含與編碼該多肽的第二核苷酸序列可操作地相連的編碼信號肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列相對於第二核苷酸序列是外源的，第一核苷酸序列的3′端緊接著第二核苷酸序列的上遊，且第一核苷酸序列選自如下組成的組中(i)編碼具有與SEQIDNO1有至少70％同一性的胺基酸序列的信號肽的核苷酸序列；(ii)與SEQIDNO2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和(iii)在嚴格條件下與SEQIDNO2的核苷酸，或其互補鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴格條件定義為在低於計算的Tm5℃至10℃的0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP，和每ml0.2mg酵母RNA中進行預雜交、雜交和雜交後洗滌，並在低於計算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗滌15分鐘一次，使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘；和(b)從培養基中分離分泌的多肽。另外，本發明提供了含有與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地相連的編碼信號肽的第一核苷酸序列的核酸構建體，其中第一核苷酸序列相對於第二核苷酸序列是外源的，第一核苷酸序列的3′端緊接著第二核苷酸序列的上遊，且第一核苷酸序列選自如下組成的組中(i)編碼具有與SEQIDNO1有至少70％同一性的胺基酸序列的信號肽的核苷酸序列；(ii)與SEQIDNO2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和(iii)在嚴格條件下與SEQIDNO2的核苷酸，或其互補鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴格條件定義為預雜交，雜交，和雜交後洗滌，其是在低於計算的Tm5℃至10℃的0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP，和每ml0.2mg酵母RNA中進行，並在加0.1％SDS的6XSCC中洗滌15分鐘一次和使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘，其是在低於計算的Tm5℃至10℃下進行。本發明還提供了含有所述核酸構建體的表達載體和宿主細胞。本發明的詳細描述定義術語「變異體」當用於與另一多肽或核苷酸序列對照時在本發明的上下文中應理解為與另一多肽相比包含一個或多個胺基酸或核苷酸的取代，缺失，和/或插入的多肽或核苷酸序列(即，它是與其比較的多肽/核苷酸序列的變異體)。具體地說，該改變可以屬於次要性質，例如不會明顯影響多肽活性的保守胺基酸取代或導致保守胺基酸取代的核苷酸序列改變；或者依賴於發生該改變的多肽大小，一般1到大約20個胺基酸的小缺失。保守取代的例子是在鹼性胺基酸(精氨酸，賴氨酸和組氨酸)，酸性胺基酸(穀氨酸和天冬氨酸)，極性胺基酸(穀氨醯胺和天冬醯胺)，疏水胺基酸(亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸)，芳香胺基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，和小胺基酸(甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內。一般不會改變特異性活性的胺基酸取代是本領域已知的且參見，例如，H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，TheProteins，AcademicPress，NewYork。最常見的交換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly及其反向交換。本發明的方法本發明涉及生產分泌多肽的方法，包括(a)在有助於多肽生產的培養基中培養真菌宿主細胞，其中該宿主細胞包含核酸構建體，該核酸構建體包含與編碼該多肽的第二核苷酸序列可操作地相連的編碼信號肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列相對於第二核苷酸序列是外源的，第一核苷酸序列的3′端緊接著第二核苷酸序列的上遊，且第一核苷酸序列選自如下組成的組中(i)編碼具有與SEQIDNO1有至少70％同一性的胺基酸序列的信號肽的核苷酸序列；(ii)與SEQIDNO2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和(iii)在嚴格條件下與SEQIDNO2的核苷酸，或其互補鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴格條件定義為在低於計算的Tm5℃至10℃的0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP，和每ml0.2mg酵母RNA中預雜交、雜交和雜交後洗滌，並在低於計算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗滌15分鐘一次和使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘；和(b)從培養基中分離分泌的多肽。在本發明的方法中，真菌宿主細胞在有助於生產該多肽的培養基，即，在適合於使用本領域已知的方法生產該多肽的營養培養基中培養。例如，可通過在合適的培養基中和在允許表達和/或分離該多肽的條件下進行搖瓶培養，或在實驗室或工業發酵罐中小規模或大規模發酵(包括連續，分批，補料分批，或固態發酵)來培養該細胞。培養可在包含碳和氮源和無機鹽的合適營養培養基中使用本領域已知的方法進行。合適的培養基可從商品供應商獲得或者可根據公開的配方(例如，參見美國典型培養物保藏中心的產品目錄)製備。使用對該多肽具有特異性的本領域已知的方法可檢測該多肽。該檢測方法可包括使用特異性抗體，酶產物的形成，或酶底物的消失。在本發明的方法中，該真菌宿主細胞相對於含有與編碼該多肽的核苷酸序列可操作地相連的天然信號肽序列的真菌細胞在相同生產條件下培養時生產具體地說多至少大約25％，更具體地說多至少大約50％，更具體地說多至少大約75％，更具體地說多至少大約100％，甚至更具體地說多至少大約200％，最具體地說多至少大約300％，且甚至最具體地說多至少大約400％的多肽。所得的分泌多肽可通過本領域已知的方法從培養基中直接回收。例如，該多肽可通過包括，但不限於，離心，過濾，提取，噴霧乾燥，蒸發，或沉澱的常規方法從營養培養基中回收。該多肽可通過本領域已知的各種方法純化，包括，但不限於，色譜法(例如，離子交換，親和，疏水，色譜聚焦，和大小排阻)，電泳方法(例如，製備型等電聚焦)，差別溶解度(例如，硫酸銨沉澱)，SDS-PAGE，或提取(參見，例如，ProteinPurification，J.-C.JansonandLarsRyden，editors，VCHPublishers，NewYork，1989)。信號肽本發明的第一核苷酸序列編碼本發明的信號肽。術語「信號肽」或「信號肽序列」在此定義為通常存在於新合成的分泌型或膜多肽N-末端的肽序列，它指導該多肽通過或者進入該細胞的細胞膜(原核生物的質膜和真核生物的內質網膜)。它通常在隨後被去掉。具體地說，該信號肽能夠指導該多肽進入細胞的分泌途徑。術語「可操作地相連」在此定義為這樣一種結構，即其中調控序列，例如信號肽序列，相對於編碼序列放在合適的位置上，使得該調控序列指導生產由該編碼序列編碼的多肽。術語「編碼序列」在此定義為當放在合適的調控序列控制下時翻譯成多肽的核苷酸序列。編碼序列的邊界一般由位於閱讀框開始(5』端)的起始密碼子和位於閱讀框3』端的終止密碼子確定。編碼序列可包括，但不限於，基因組DNA，cDNA，RNA，半合成，合成，和重組核苷酸序列。本發明的多肽的編碼序列5』端可含有與編碼該多肽的成熟(或前體形式)的核苷酸序列片斷天然相連的編碼信號肽的天然核苷酸序列。在這種情況下本發明的信號肽可取代該天然信號肽。作為選擇，本發明的多肽可沒有天然信號肽。在本文中，術語「天然」試圖理解為天然存在。在本發明的方法中，該信號肽相對於編碼目的多肽的核苷酸序列是外源的，但是該信號肽序列或核苷酸序列相對於該真菌宿主細胞可以是天然的。在本文中，術語「外源」試圖理解為該信號肽相對於該多肽不是天然的，即，它來源於異於該多肽的另一基因。在一個實施方案中，第一核苷酸序列編碼具有與SEQIDNO1有至少70％，具體地說至少大約75％，更具體地說至少大約80％，更具體地說至少大約85％，甚至更具體地說至少大約90％，最具體地說至少大約95％，且甚至最具體地說至少大約97％同一性的胺基酸序列的信號肽，它具有指導多肽進入或通過細胞膜，例如進入細胞的分泌途徑的能力(下文稱為「同源信號肽」)。在一個具體方面中，該同源信號肽具有與SEQIDNO1有5個胺基酸，具體地說4個胺基酸，更具體地說3個胺基酸，甚至更具體地說2個胺基酸，且最具體地說1個胺基酸的差別的胺基酸序列。為達到本發明的目的，兩個胺基酸序列之間的同一性或同一性程度可通過Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS5151-153)使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟體(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)用同一性表(identitytable)和下列多序列對比參數缺口罰分(gappenalty)為10和缺口長度罰分(gaplengthpenalty)為10來確定。逐對序列對比參數為Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口(windows)＝5，且對角線(diagonals)＝5。具體地說，第一核苷酸序列可編碼信號肽，其包含SEQIDNO1的胺基酸序列，或其等位變異體；或其具有指導該多肽進入或通過細胞膜，例如，進入細胞分泌途徑的能力的片斷。在更具體的一個方面中，本發明的第一核苷酸序列編碼包含SEQIDNO1的胺基酸序列的信號肽。在另一具體的方面，第一核苷酸序列編碼由SEQIDNO1的胺基酸序列或其片斷組成的信號肽，其中該信號肽片斷具有指導多肽進入或通過細胞膜，例如，進入細胞分泌途徑的能力。在另一更具體的方面中，本發明的核苷酸序列編碼由SEQIDNO1的胺基酸序列組成的信號肽。本發明還包含這樣的第一核苷酸序列，它編碼具有SEQIDNO1的胺基酸序列的信號肽，且它由於遺傳密碼的簡併性而不同於SEQIDNO2。本發明還涉及編碼具有指導多肽進入或通過細胞膜，例如，進入細胞分泌途徑的能力的SEQIDNO1的片斷的SEQIDNO2的子序列或片斷。SEQIDNO2的子序列是SEQIDNO2包含的核酸序列，除了從5』和/或3』端刪除了一個或多個核苷酸。具體地說，子序列含有至少30個核苷酸，例如至少35個核苷酸或至少40個核苷酸或至少45個核苷酸或至少50個核苷酸或至少52個核苷酸或至少53個核苷酸。SEQIDNO1的片斷是從該胺基酸序列的氨基和/或羧基末端刪除了一個或多個胺基酸的多肽。具體地說，一個片斷含有至少10個胺基酸殘基，例如至少12個胺基酸殘基或至少13個胺基酸殘基或至少14個胺基酸殘基或至少15個胺基酸殘基或至少16個胺基酸殘基或至少17個胺基酸殘基。具體地說，如果第一和第二核苷酸序列在酵母宿主細胞中表達時，該信號肽可含有SEQIDNO1的胺基酸殘基1-16，因為本發明的發明人觀察到在酵母中該信號肽在胺基酸殘基16和17之間被切割(在AA↓LP)，而如果該宿主細胞是絲狀真菌，該信號肽具體可包含SEQIDNO1的18個胺基酸殘基，因為本發明的發明人觀察到在米麴黴(Aspergillusoryzae)中該信號肽的切割發生在SEQIDNO1的胺基酸殘基18後。這表明在酵母和絲狀真菌之間，被識別為信號序列切割的切割位點的序列可能不同。等位基因變異體表示佔據相同染色體基因座的基因的兩種或多種任選形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產生，且可導致群體內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的信號肽中無改變)或者可編碼有胺基酸序列改變的信號肽。信號肽的等位基因變異體是由基因的等位基因變異體編碼的肽。在一個具體方面，第一核苷酸序列是HumicolainsolensDSM1800中所含的角質酶(cutinase)基因的信號肽編碼序列(SEQIDNO1)。在第二個方面，編碼信號肽的本發明的第一核苷酸序列與SEQIDNO2具有至少大約70％的同源性程度，具體地說至少大約75％，更具體地說至少大約80％，更具體地說至少大約85％，甚至更具體地說至少大約90％的同源性，最具體地說至少大約95％的同源性，且甚至最具體地說至少大約97％的同源性，其編碼信號肽；或等位基因變異體和編碼具有指導多肽進入或通過細胞膜，例如，進入細胞分泌途徑的能力的信號肽片斷的SEQIDNO2的子序列。為了達到本發明的目的，兩個核酸序列之間的同源性程度可通過Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80726-730)使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟體(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)用同一性表和下列多序列對比參數缺口罰分為10且缺口長度罰分為10來測定。逐對序列對比參數為Ktuple＝3，缺口罰分＝3，且窗口＝20。在第三個方面，本發明的第一核苷酸序列編碼信號肽，其中所述的第一核苷酸序列在嚴格條件下與SEQIDNO2，或其互補鏈的核苷酸雜交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第2版，紐約冷泉港)。SEQIDNO2的核苷酸序列或其子序列，以及SEQIDNO1的胺基酸序列或其片斷可用於設計核酸探針以便根據本領域熟知的方法從不同屬或種的菌株鑑定和克隆編碼信號肽的DNA。具體地說，該探針可用於按標準Southern印跡方法與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以便鑑定和分離其中的相應基因。該探針可以比完整序列短很多，但可以具體地說長至少15，例如至少25，或更具體地說至少35個核苷酸。DNA和RNA探針都可使用。一般可標記該探針用於檢測相應的基因(例如，用32P，3H，35S，生物素，或抗生物素蛋白)。本發明包含該探針。因此，可篩選從其它生物製備的基因組DNA或cDNA文庫中與上述探針雜交且編碼信號肽的DNA。可通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳，或其它分離技術分離其它生物的基因組或其它DNA。文庫DNA或分離的DNA可轉移到並固定在硝酸纖維素或其它合適的載體材料上。為了鑑定與SEQIDNO2或其子序列同源的克隆或DNA，該載體材料可用於Southern印跡。為了達到本發明的目的，雜交表示該核酸序列在本文定義的嚴格條件下與相應於SEQIDNO2所示的核酸序列，其互補鏈，或其子序列的標記核酸探針雜交。使用X-射線膠片可檢測在這些條件下核酸探針與其雜交的分子。在一個具體的方面中，該核酸探針是編碼SEQIDNO1的信號肽，或其子序列的核苷酸序列。在另一具體的方面，該核酸探針是SEQIDNO2。在另一具體方面，該核酸探針是HumicolainsolensDSM1800所含的角質酶基因的信號肽序列(WO96/13580中的SEQIDNO2)。對於長度大約15個核苷酸到大約60個核苷酸的短探針，嚴格條件定義為按照標準Southern印跡方法，在低於根據Bolton和McCarthy(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA481390)的算法計算的Tm5℃至10℃下，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP和每ml0.2mg酵母RNA中進行預雜交，雜交，和雜交後洗滌。對於長度為大約15個核苷酸到大約60個核苷酸的短探針，該載體材料在低於計算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗滌15分鐘一次並使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘。在第四方面，第一核苷酸序列可編碼包含一個或多個胺基酸的取代，缺失，和/或插入的具有SEQIDNO1的胺基酸序列的信號肽的變異體。該變異體信號肽的胺基酸序列與SEQIDNO1的胺基酸序列區別可在於一個或多個胺基酸殘基的插入或缺失和/或用不同胺基酸殘基取代一個或多個胺基酸殘基。具體地說，胺基酸改變可以屬於次要性質，例如不會明顯影響信號肽活性的保守胺基酸取代；或者一般1到大約5個胺基酸的小缺失。保守取代的例子是在鹼性胺基酸(精氨酸，賴氨酸和組氨酸)，酸性胺基酸(穀氨酸和天冬氨酸)，極性胺基酸(穀氨醯胺和天冬醯胺)，疏水胺基酸(亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸)，芳香胺基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，和小胺基酸(甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內。一般不會改變特異性活性的胺基酸取代是本領域已知的且參見，例如，H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，TheProteins，AcademicPress，NewYork。最常見的交換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly及其反向交換。多肽本發明的第二核苷酸序列編碼本發明編碼的多肽。所述的多肽相對於生產它的真菌宿主細胞可以是天然的或異源的。術語「多肽」本文不是指特定長度的編碼產物，因此，它包含肽，寡肽，和蛋白質。術語「異源多肽」在此定義為不是該真菌細胞天然的多肽，進行了修飾以改變天然序列的天然多肽，或由於通過重組DNA技術改造編碼該多肽的基因而定量改變其表達的天然多肽。真菌細胞可含有一個或多個拷貝的編碼該多肽的核苷酸序列。具體地說，該多肽可以是激素或激素變異體，酶，受體或其部分，抗體或其部分，過敏原或報導分子。在一個具體方面，該多肽可以是來自Dermatophagoidespteronyssinus，Dermatophagoidesfarinae，Dermatophagoidessiboney，Dermatophagoidesmicroceaus，Blomiatropicalis和Euroglyphusmaynei的過敏原，或後來被修飾的一種所述生物的過敏原。更具體地說，所述過敏原可以是Derp1，例如，來自Dermantophagoidespteronyssinus的Derp1(SEQIDNO3)。具體地說，該多肽可以是SEQIDNO3中胺基酸19-320的序列。在一個更具體的實施方案中，該多肽可以是SEQIDNO3的胺基酸19-320的多肽序列的變異體。更具體地說，該變異體可以是S54X或N52X，其中「X」表示任何胺基酸，如所述的破壞Derp1的N-糖基化位點，具體地說該變異體可以是S54N或N52Q。然而，Derp1的其它變異體是可預料得到的。在另一具體實施方案中，該多肽可以是酶，例如，氧化還原酶，轉移酶，水解酶，裂合酶，異構酶，或連接酶。在一個更具體的方面，該多肽可以是氨肽酶，澱粉酶，糖酶，羧肽酶，過氧化氫酶，纖維素酶，纖維二糖水解酶，幾丁質酶，角質酶，環糊精糖基轉移酶，脫氧核糖核酸酶，內切葡聚糖酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖澱粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，轉化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，變位酶mutanase，氧化酶，果膠降解酶，過氧化物酶，磷脂酶，植酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，核糖核酸酶，轉穀氨醯胺酶，木聚糖酶，或β-木糖苷酶。有關纖維素酶的例子包括但不限於來自Mucorcicinellides，例如，M.cicinellidesIFO4554的纖維素酶(SEQIDNO4)。有關蛋白水解酶的例子包括但不限於半胱氨酸蛋白酶，例如，來自白車軸草(TrifoliumrepensL)的半胱氨酸蛋白酶5(SEQIDNO5)，特別是編碼成熟肽的SEQIDNO5的胺基酸109-327，或胰蛋白酶，例如來自尖孢鐮孢(Fusariumoxysporium)的胰蛋白酶(SEQIDNO7)。有關植酸酶的例子包括但不限於來自Peniophoralycii，例如，P.lyciiCBS686.96的植酸酶(SEQIDNO9)。編碼本發明的多肽的第二核苷酸序列可從任何原核生物，真核生物，或其它來源獲得。為了達到本發明的目的，本文與給定來源相聯繫使用的術語「從...獲得」是指該多肽由該來源產生或者由插入了該來源的基因的細胞產生。用於分離或克隆編碼目的多肽的核苷酸序列的技術是本領域熟知的且包括從基因組DNA分離，從cDNA製備，或其組合。通過例如，使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)可實現從該基因組DNA克隆第二核苷酸序列。參見，例如，Innis等，1990，PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplication，AcademicPress，NewYork。克隆方法可包括切出和分離含有編碼該多肽的核苷酸序列的所需核苷酸片斷，將該片斷插入載體分子中，並將重組載體納入突變型真菌細胞中，其中可複製多個拷貝或克隆的該核苷酸序列。第二核苷酸序列可以是基因組，cDNA，RNA，半合成，合成來源，或其任意組合。在本發明的方法中，該多肽也可以是融合或雜合多肽，其中另一多肽融合在該多肽或其片斷的N-末端或C-末端。融合多肽通過將編碼一種多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到編碼本發明的多肽的第二核苷酸序列(或其部分)上來產生。產生融合多肽的技術是本領域已知的，且包括，連接編碼這些多肽的編碼序列，使得它們共閱讀框且該融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的調控下。雜合多肽可包括從至少兩種不同多肽獲得的部分或完整多肽序列的組合，其中一種或多種多肽對於突變型真菌細胞可以是異源的。核酸構建體本發明還涉及含有與編碼本發明的多肽的第二核苷酸序列可操作地相連的編碼本發明的信號肽的第一核苷酸序列的核酸構建體。「核酸構建體」在此定義為單鏈或雙鏈的核苷酸分子，它從天然存在的基因分離或者被修飾成含有以在天然情況下不存在的方式組合和並列的核酸片斷。當核酸構建體含有編碼序列和表達該編碼序列所需的所有調控序列時，術語核酸構建體與術語表達盒同義。編碼多肽的第二核苷酸序列還可以用各種方法進行操作以提供該多肽的表達。在該核苷酸序列插入載體前對其改造可能是期望的或必需的，取決於該表達載體。使用重組DNA方法修飾核苷酸序列的技術是本領域熟知的。在本發明的方法中，該核酸構建體包含一種或多種天然調控序列或者用對於該核酸構建體的第一和/或第二核苷酸序列為外源的一種或多種調控序列取代一種或多種天然調控序列以提高編碼多肽的第二核苷酸序列在宿主細胞中的表達。術語「調控序列」在此定義為包括表達第二核苷酸序列編碼的多肽必需或有利的所有元件。各調控序列相對於編碼該多肽的第二核苷酸序列可以是天然的或外源的。該調控序列包括，但不限於，前導序列，多聚腺苷化序列，前肽序列，本發明的信號肽序列，和轉錄終止子。在最少的情況下，該調控序列包括本發明的信號肽序列，和轉錄和翻譯終止信號。調控序列備有接頭用於導入有利於將該調控序列與編碼該多肽的第二核苷酸序列連接的特定限制性位點。調控序列可以是被宿主細胞識別以表達該核苷酸序列的合適啟動子序列。該啟動子序列含有介導該多肽表達的轉錄調控序列。該啟動子可以是在選定宿主細胞中表現出轉錄活性的任何序列，包括突變的，截短的和雜合的啟動子，且可從與該宿主細胞同源或異源的編碼細胞外或細胞內多肽的基因獲得。用於指導本發明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的例子是從米麴黴TAKA澱粉酶，米赫毛黴(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶，黑麴黴中性α-澱粉酶，黑麴黴酸穩定性α-澱粉酶，黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉酶(glaA)，米赫毛黴脂肪酶，米麴黴鹼性蛋白酶，米麴黴丙糖磷酸異構酶，構巢麴黴乙醯胺酶，Fusariumvenenatum澱粉葡糖苷酶，尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)，Trichodermareesei纖維二糖水解酶I，Trichodermareesei纖維二糖水解酶II，Trichodermareesei內切葡聚糖酶I，Trichodermareesei內切葡聚糖酶II，Trichodermareesei內切葡聚糖酶III，Trichodermareesei內切葡聚糖酶IV，Trichodermareesei內切葡聚糖酶V，Trichodermareesei木聚糖酶I，Trichodermareesei木聚糖酶II和Trichodermareeseiβ-木糖苷酶的基因獲得的啟動子，以及NA2-tpi啟動子(來自黑麴黴中性α-澱粉酶和米麴黴丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；或其突變型，截短型，和雜合型啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子包括但不限於從釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)，釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)，釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)，釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)，釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)，和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因獲得的那些啟動子。用於酵母宿主細胞的其它有用的啟動子參見Romanos等，1992，Yeast8423-488的描述。調控序列可以是被宿主細胞識別以終止轉錄的合適轉錄終止子序列。該終止子序列可操作地連接到編碼該多肽的核苷酸序列的3′端。在選定宿主細胞中起作用的任何終止子都可用於本發明。用於絲狀真菌宿主細胞的合適終止子的例子包括但不限於從米麴黴TAKA澱粉酶，黑麴黴葡糖澱粉酶，構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶，黑麴黴α-葡糖苷酶，和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因獲得的那些終止子。用於酵母宿主細胞的合適終止子的例子包括但不限於從釀酒酵母烯醇化酶，釀酒酵母細胞色素C(CYC1)，和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因獲得的那些終止子。用於酵母宿主細胞的其它有用的終止子參見Romanos等，1992，出處同上的描述。該調控序列也可以是合適的前導序列，即對於宿主細胞翻譯重要的mRNA的非翻譯區。該前導序列一般可操作地連接到編碼多肽的核苷酸序列的5′端。在選定宿主細胞中起作用的任何前導序列都可用於本發明。用於絲狀真菌宿主細胞的合適的前導序列的例子包括但不限於從米麴黴TAKA澱粉酶和構巢麴黴丙糖磷酸異構酶的基因獲得的那些前導序列。用於酵母宿主細胞的合適的前導序列包括但不限於從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)，釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶，釀酒酵母α-因子，和釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因獲得的那些前導序列。該調控序列也可以是多聚腺苷化序列，它與編碼多肽的核苷酸序列的3′端可操作地連接且轉錄時作為給轉錄的mRNA添加多聚腺苷酸殘基的信號被宿主細胞識別。在選定宿主細胞中起作用的任何多聚腺苷化序列都可用於本發明。用於絲狀真菌宿主細胞的合適多聚腺苷化序列的例子包括但不限於從米麴黴TAKA澱粉酶，黑麴黴葡糖澱粉酶，構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶，尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑麴黴α-葡糖苷酶的基因獲得的那些多聚腺苷化序列。用於酵母宿主細胞的有用多聚腺苷化序列包括但不限於Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology155983-5990所述的那些序列。調控序列也可以是編碼位於多肽氨基末端的一個胺基酸序列的前肽編碼區。所得的多肽稱為酶原(proenzyme)或多肽原(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。多肽原一般無活性，而且通過從多肽原催化或自體催化切割前肽，多肽原可以轉變為成熟的活性多肽。前肽編碼區的例子包括但不限於可從DermantophagoidespteronyssinusDerp1的基因，或者從Dermantophagoides獲得的其它基因，尖孢鐮孢胰蛋白酶，釀酒酵母α-因子，米赫毛黴天冬氨酸蛋白酶，和嗜熱毀絲黴(Myceliophthorathermophila)漆酶(WO95/33836)的基因獲得的那些前肽。如果信號肽和前肽區都存在於多肽的氨基末端，則該前肽區緊接著多肽的氨基末端且信號肽區緊接著該前肽區的氨基末端。如果存在前肽，則在一個實施方案中在前肽和成熟多肽之間可存在一個切割位點。術語「切割位點」應理解為被能夠在該位點切割該多肽的蛋白水解酶識別的胺基酸序列。該位點的例子包括kex-位點，特別是kex-II位點。也可能需要添加允許調節與宿主細胞生長相關的多肽表達的調節序列。調節系統的例子是與化學或物理刺激，包括調控化合物的存在反應引起基因表達打開或關閉的那些系統。在酵母中，可使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，可使用TAKAα-澱粉酶啟動子，黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子，和米麴黴葡糖澱粉酶啟動子作為調節序列。調節序列的其它例子是允許基因擴增的那些序列。在真核系統中，它們包括在氨甲蝶呤存在時擴增的二氫葉酸還原酶基因，和重金屬擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼該多肽的核苷酸序列可與該調控序列可操作地相連。表達載體本發明還涉及含有本發明的核酸構建體的重組表達載體。除了包含分別編碼本發明的信號肽和多肽的第一和第二核苷酸序列外，所述的表達載體可具體包含轉錄和翻譯終止信號。上述各種核苷酸和調控序列可連接起來以產生重組表達載體，它可包括一個或多個方便的限制性位點以允許在該位點插入或取代該啟動子和/或編碼該多肽的核苷酸序列。作為選擇，該核酸構建體可插入合適的載體以表達由第二核苷酸序列編碼的多肽。在構建的表達載體中，編碼本發明多肽的第二核苷酸序列位於該載體中以便所述的序列與本發明的信號肽序列和一個或多個合適的表達調控序列可操作地相連。重組表達載體可以是可按常規進行重組DNA操作且可導致該核苷酸序列表達的任何載體(例如，質粒或病毒)。載體的選擇一般依賴於載體與該載體所導入的宿主細胞的相容性。該載體可以是線性或閉合環狀質粒。本發明的載體可具體含有允許轉化細胞容易選擇的一個或多個可選擇的標記。選擇標記是其產物提供殺生物劑或病毒抗性，重金屬抗性，營養缺陷型原養化等的基因。酵母宿主細胞的合適標記包括，但不限於，ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1，和URA3。用於絲狀真菌宿主細胞的選擇標記包括，但不限於，amdS(乙醯胺酶)，argB(鳥氨酸氨甲醯基轉移酶)，bar(膦絲菌素乙醯轉移酶)，hygB(潮黴素磷酸轉移酶)，niaD(硝酸鹽還原酶)，pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶)，sC(硫酸腺苷醯轉移酶)，trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，及其等同物。具體用於麴黴屬細胞的是構巢麴黴或米麴黴的amdS和pyrG基因和吸水鏈黴菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。該載體可以是自主複製型載體，即，作為染色體外實體存在的載體，其複製不依賴於染色體複製，例如，質粒，染色體外因子，微型染色體，或人工染色體。該載體可含有保證自我複製的任何工具。作為選擇，該載體可以是在導入宿主細胞時整合進基因組並與其整合進的染色體一起複製的載體。此外，可使用單個載體或質粒或一起含有需要導入宿主細胞基因組的總DNA的兩個或多個載體或質粒，或轉座子。本發明的載體可具體含有允許該載體穩定整合進宿主細胞基因組或該載體在細胞中不依賴於基因組自主複製的元件。為了整合進宿主細胞基因組，該載體可依靠編碼該多肽的第二核苷酸序列或該載體的任何其它元件來通過同源或非同源重組將該載體穩定整合進基因組的。作為選擇，該載體可含有指導通過同源重組整合進宿主細胞基因組的額外核苷酸序列。該額外核苷酸序列可使得該載體能夠在染色體的精確位置整合進宿主細胞基因組。為了增加在精確位置整合的可能性，該整合元件應具體包含與相應靶序列高度同源的足夠數量的核苷酸，例如100至1,500個鹼基對，優選400到1,500個鹼基對，且最優選800到1,500個鹼基對以提高同源重組的概率。整合元件可以是與宿主細胞基因組中靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非編碼或編碼核苷酸序列。在另一方面，該載體可通過非同源重組整合進宿主細胞基因組。對於自主複製，該載體可進一步包含使得該載體在所述宿主細胞中自主複製的複製起點。複製起點可以是在細胞中起作用的介導自主複製的任何質粒複製因子。術語「複製起點」或「質粒複製因子」本文定義為使得質粒或載體能夠在體內複製的核苷酸序列。用於酵母宿主細胞的複製起點的例子是2微米複製起點，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的組合，和ARS4與CEN6的組合。複製起點可以是具有突變使其在宿主細胞中起作用的能力具有溫度敏感性的複製起點(參見，例如，Ehrlich，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA751433)。用於絲狀真菌宿主細胞的複製起點的例子是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene9861-67；Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分離和含有該基因的質粒或載體的構建可根據WO00/24883公開的方法完成。可將超過1拷貝的編碼多肽的核苷酸序列插入宿主細胞中以增加該基因產物的產量。核苷酸序列拷貝數的增加可以這樣實現將至少一個額外拷貝的序列整合進宿主細胞基因組；或者通過將該核苷酸序列與可擴增的選擇標記基因包含在一起，通過在合適的選擇劑存下下培養細胞，可以選擇含有擴增拷貝的選擇標記基因，從而也就含有增加拷貝的該核苷酸序列的細胞，。用於連接上述元件以構建本發明的重組表達載體的方法是本領域的技術人員所熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，出處同上)。宿主細胞本發明涉及在真菌宿主細胞中生產多肽的方法和含有本發明的核酸構建體的重組宿主細胞。將含有與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地相連的編碼本發明的信號肽的第一核苷酸序列的載體導入真菌宿主細胞使得該載體如前所述作為染色體整合體或者作為自我複製型染色體外載體維持。術語「宿主細胞」包含由於複製期間發生的突變與親本細胞不同的親本細胞的任何後代。宿主細胞的選擇在很大程度上依賴於編碼該多肽的基因及其來源。宿主細胞可以是用於本發明方法的任何真菌細胞。本文使用的「真菌」包括子囊菌門(Acomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(由Hawksworth等定義，參見，AinsworthandBisby′sDictionaryofTheFungi，第8版，1995，CABInternational，UniversityPress，Cambridge，UK)以及卵菌門(Oomycota)(參見Hawksworth等，1995，出處同上，第171頁)或所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，出處同上)。在一個具體方面，該真菌宿主細胞是酵母細胞。本文使用的「酵母」包括包括產子囊(ascosporogenous)酵母(內孢黴目(Endomycetales))、產擔孢子(basidiosporogenous)酵母和屬於不完全真菌(FungiImperfecti)的酵母(芽生菌綱Blastomycetes)。由於酵母的分類在今後可能改變，為了本發明的目的，酵母將定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，andDavenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所述。在一個更具體的方面，酵母宿主細胞是假絲酵母屬(Candida)，漢遜氏酵母屬(Hansenula)，克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)，畢赤氏酵母屬(Pichia)，酵母屬(Saccharomyces)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，或Yarrowia屬細胞。在一個最具體的方面，酵母宿主細胞是卡爾斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母例如S.cerevisiaeYNG318、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道拉斯酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾第酵母(Saccharomycesnorbensis)、卵形酵母(Saccharomycesoviformis)、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)或Yarrowialipolytica細胞。在另一具體方面，該真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。「絲狀真菌」包括真菌門(Eumycota)和卵菌門亞門(定義參見Hawksworth等，1995，出處同上)的所有絲狀類型。絲狀真菌的特徵在於菌絲壁由幾丁質，纖維素，葡聚糖，殼聚糖，甘露聚糖，和其它複合多糖組成。無性生長是通過菌絲伸長且碳代謝是專性需氧的。相反，諸如釀酒酵母的酵母無性生長是通過單細胞菌體出芽，且碳代謝可以是發酵性的。在一個更具體的方面，絲狀真菌宿主細胞是，但不限於是，支頂孢屬(Acremonium)，麴黴屬，鐮孢屬(Fusarium)，腐質黴屬(Humicola)，毛黴屬(Mucor)，毀絲黴屬(Myceliophthora)，脈孢菌屬(Neurospora)，青黴屬，Thielavia，Tolypocladium，或木黴屬(Trichoderma)。在甚至更具體的一個方面，該絲狀真菌宿主細胞是泡盛麴黴、煙麴黴(Aspergillusfumigatus)、臭麴黴(Aspergillusfoetidus)、日本麴黴(Aspergillusjaponicus)、構巢麴黴(Aspergillusnidulans)、黑麴黴或米麴黴細胞。在一個更具體的方面，絲狀真菌宿主細胞是杆孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、Fusariumcerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢(Fusariumculmorum)、禾穀鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusariumgraminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporium)、合歡木鐮孢(Fusariumnegundi)、尖孢鐮孢、多枝鐮孢(Fusariumreticulatum)、玫瑰色鐮孢(Fusariumroseum)、接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)、膚色鐮孢(Fusariumsarcochroum)、擬枝孢鐮孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusariumsulphureum)、Fusariumtorulosum、Fusariumtrichothecioides或Fusariumvenenatum細胞。在另一個更具體的方面，絲狀真菌宿主細胞是Humicolainsolens、Humicolalanuginosa、Magnaporthegrisea、米赫毛黴、嗜熱毀絲黴、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、產紫青黴(Penicilliumpurpurogenum)、Thielaviaterrestris、Trichodermaharzianum、康寧木黴(Trichodermakoningii)、Trichodermalongibrachiatum、Trichodermareesei或綠色木黴(Trichodermaviride)細胞。在一個最具體的方面，該Fusariumvenenatum細胞是FusariumvenenatumA3/5，它最初作為FusariumgraminearumATCC20334保藏，且最近由Yoder和Christianson，1998，FungalGeneticsandBiology2362-80和O′Donnell等，1998，FungalGeneticsandBiology2357-67重新分類為Fusariumvenenatum；以及Fusariumvenenatum的分類學等同物，不管它們目前已知為何種名。在另一具體方面，該Fusariumvenenatum細胞是如WO97/26330中公開的FusariumvenenatumA3/5或FusariumvenenatumATCC20334的形態學突變體。在另一最具體的方面，該木黴屬細胞是TrichodermareeseiATCC56765，TrichodermareeseiATCC13631，TrichodermareeseiCBS526.94，TrichodermareeseiCBS529.94，TrichodermalongibrachiatumCBS528.94，TrichodermalongibrachiatumATCC2106，TrichodermalongibrachiatumCBS592.94，綠色木黴NRRL3652，綠色木黴CBS517.94，或綠色木黴NIBHFERM/BP447。真菌細胞可以通過包含原生質體形成，原生質體轉化和細胞壁再生的方法轉化，方式本身是已知的。用於麴黴屬宿主細胞轉化的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA811470-1474中描述。用於轉化Trichodermareesei宿主細胞的合適方法在Penttila等，1987，Gene61155-164，和Gruber等，1990，CurrGenet.18(1)71-6中描述。用於轉化鐮孢菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78147-156和WO96/00787描述。酵母可使用Becker和Guarente，InAbelson，J.N.andSimon，M.I.，editors，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology，MethodsinEnzymology，Volume194，第182-187頁，AcademicPress，Inc.，NewYork；Ito等，1983，JournalofBacteriology153163；和Hinnen等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA751920所述的方法轉化。材料和方法菌株和質粒菌株大腸桿菌DH12S(可從GibcoBRL獲得)用於酵母質粒拯救。釀酒酵母YNG318MATaDpep4[cir+]ura3-52，leu2-D2，his4-539在J.Biol.Chem.272(15)，9720-9727，1997)中描述。質粒所有酵母表達載體都是從WO00/10038所述的pJC039構建的，在TPI啟動子控制下的釀酒酵母和大腸桿菌穿梭載體。基因Derp1來自DermatophagoidespteronyssinusNCBI登錄號P08176，胺基酸序列在SEQIDNO3中顯示。來自白車軸草(TrifoliumrepensL)的半胱氨酸蛋白酶基因是以EMBLAY192363登錄的序列。α-因子(酵母接合所需的信息素)基因是來自Invitrogen的商業上可獲得的pPICZαA載體中的序列。來自尖孢鐮孢的胰蛋白酶基因是以EMBLS63827登錄的序列，其cDNA序列在SEQIDNO6中顯示。來自Peniophoralycii菌株CBS686.96的植酸酶基因是以EMBLPLY310696登錄的序列且其cDNA序列在SEQIDNO8中顯示。引物對於卷枝毛黴(Mucorcircinellides)纖維素酶的表達對於cDNA克隆MCE-BC1F(44mer)5』-CAACTGGTGATCACCACCATGAAGTTCACCGTTGCTATTACTTC-3』MCE-NruR(39mer)5』-TCTCGAGCTCGCGATTACTTTCTTTCGCAACCTGAGCGAG-3』對於酵母載體構建M61F(50mer)5』-CCAGCTTCCGCAAACAAAGTCGCCAACATGAAGTTCACCGTTGCTATTAC-3』M61CutisigF(50mer)5』-CGCCAGCCTTGTTGCTGCTCTCCCCGCCGCTTCTTGCAGCTCTGTCTATG-3』C-termR61R(49mer)5』-TAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTACTTTCTTTCGCAACCTGAGCG-3』對於白車軸草半胱氨酸蛋白酶的表達α-信號-MunI(49mer)5』-ATAAACGACGGGACCCGGGGATCCAATTGATGAGATTCCCATCAATTTT-3』α-信號-CysProR(42mer)5』-GCCCACGATGGAGAAATCGCGAGCTTCAGCTTCTCTTTTCTC-3』α-信號-CysProF(42mer)5』-GAAAAAAGAGAAGCTGAAGCTCGCGATTTCTCCATCGTGGGC-3』Spe-CysProR(50mer)5』-ACTAATTACATGATGCGGCCCACTAGTTCATTTCTTCTTAGTAGGATAAG-3』Cuti-Sig-CysPro(50mer)5』-GCACCGCCAGCCTTGTTGCTGCTCTCCCCCGCGATTTCTCCATCGTGGGC-3』CysProC-term(50mer)5』-TAATTACATGATGCGGCCCGCGGCCGCTCATTTCTTCTTAGTAGGATAAG-3』對於鐮孢胰蛋白酶的表達酵母-F(43mer)5』-ACGACGGTACCCGGGGATCAAGCTTATGGTCAAGTTCGCTTCC-3』酵母-R(43mer)5』-AACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTAAGCATAGGTGTC-3』cuti-pre(45mer)5』-CGTTCCTGAACTTGTTGCCCGGGTTGGTGGCACTTCTGCCAGCGC-3』TP2-KexF(32mer)5』-GTTCCTGAACTTGTTCGGCGGGTTGGTGGCAC-3』TP2-KexR(32mer)5』-GTGCCACCAACCCGCCGAACAAGTTCAGGAAC-3』Cuti-preF(29mer)5』-GTTGCTGCTCTCCCCGTTGGTGGCACTTC-3』Cuti-preR(29mer)5』-GAAGTGCCACCAACGGGGAGAGCAGCAAC-3』CUTIpre-TPproF(42mer)5』-TCCTCAGGAGATCCCCAACATTGTTGGTGGCACTTCTGCCAG-3』CUTIpre-TPproR(40mer)5』-GTTGGGGATCTCCTGAGGAGCGGGGAGAGCAGCAACAAGG-3』對於隔孢伏革菌(Peniophora)植酸酶的表達PP1F(50mer)5』-AAACGACGGTACCCGGGGATCAAGCTTATGGTTTCTTCGGCATTCGCACC-3』PPR(50mer)5』-ACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGACTATTCCGACGGAACAAAGCCGC-3』PP2F(50mer)5』-CCGCCAGCCTTGTTGCTGCTCTCCCCCAGCTACCTATCCCCGCACAAAAC-3』培養基和底物RS-2540g/L大豆粉，40g/L葡萄糖，10g/LKH2PO4，0.25g/LMgSO4，0.01g/LFeSO4，2.5g/LNH4NO3；pH6YPD20g/L葡萄糖，20g/L蛋白腖和10g/L酵母提取物10X基礎溶液66.8g/l酵母氮鹼基無(w/o)胺基酸(DIFCO)，100g/l琥珀酸鹽和60g/lNaOH。SC-葡萄糖(或SC-培養基)100ml/l20％葡萄糖(即，2％的終濃度＝2g/100ml)，4ml/l5％蘇氨酸，10ml/l1％色氨酸，25ml/l20％酪蛋白胺基酸和100ml/l10X基礎溶液。該溶液使用0.20微米孔徑的濾膜滅菌。瓊脂和H2O(大約761ml)一起高壓滅菌，並將單獨滅菌的SC-葡萄糖溶液加入瓊脂溶液中。PEG/LiAc溶液50ml40％PEG4000(高壓滅菌)和1ml5M醋酸鋰(高壓滅菌)。方法酵母轉化該方法在實施例2-5中使用。為了轉化酵母，使用體內重組機制，其中如果載體序列和PCR片斷都具有相同的側翼區，則酵母可能通過該機制體內重組載體序列和PCR片斷以產生表達載體。通過將0.5微升載體(EcoRI-NotI消化)與1微升PCR片斷混合製備DNA混合物。釀酒酵母YNG318感受態細胞在冰上融解。將100微升該細胞與該DNA混合物和10微升載體DNA(Clontech)在12ml聚丙烯試管(Falcon2059)中混合。向其中加入0.6mlPEG/LiAc溶液並輕輕混合，然後在30℃和200rpm下溫育30分鐘。隨後在42℃溫育30分鐘(熱休克)，之後轉移進eppendorf管並離心5秒。去掉上清並分散在3mlYPD中。然後將該細胞懸液以200rpm在30℃下溫育45分鐘，之後傾倒在SC-葡萄糖平板上。PCR反應除非另有說明，在下列條件下進行PCR反應PCR反應包含38.9微升H2O，5微升10×反應緩衝液，1微升KlenTaqLA(Clontech)，4微升10mMdNTPs，0.3微升×2100pmol/微升的引物和0.5微升模板DNA且在下列條件下進行30個循環的98℃下10秒和68℃下90秒，和最後在68℃下10分鐘。夾心ELISA免疫平板(NuncMaxisorb；Nunc-Nalgene)在4℃下用合適劑量的多克隆兔抗Derp1抗體包被過夜。然後用含0.05％Tween20的0.15M磷酸鹽緩衝液(PBS)(PBST)徹底洗滌平板，並用含2％脫脂奶粉的PBS在室溫下封閉剩下的結合位點1小時。以合適劑量或劑量範圍加入樣品，它可以是純化的，半純化的重組1型蟎多肽變異體過敏原或含有目的蛋白的粗製培養液。然後用0.15MPBST徹底洗滌平板，之後通過用生物素標記的單克隆抗Derp1抗體(INDOOR)在室溫下溫育1小時檢測該過敏原。然後在0.15MPBST中再次洗滌平板，之後與鏈黴抗生物素蛋白辣根過氧化物酶複合物(KierkegaardPerry)在室溫下結合1小時。重複洗滌步驟，然後平板通過加入3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺過氧化氫(TMBPlus，Kem-En-Tec)顯色，之後通過加入0.2MH2SO4終止反應。在450nm下的光密度(OD)反映了與免疫球蛋白結合的過敏原，然後可檢測且也可通過與從ELISA中包含的已知濃度劑量範圍的天然Derp1(可從Indoorbiotechnologies，NA-DP1獲得)獲得的數據進行比較來測定結合的過敏原的量。其它方法通過電穿孔(BIO-RADGenePulser)進行大腸桿菌轉化以拯救酵母質粒。DNA質粒用Qiagen質粒試劑盒製備。DNA片斷通過Qiagen凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收。PCR用PTC-200DNAEngine進行。ABIPRISMTM310遺傳分析儀用於所有DNA序列的測定。酵母總DNA通過在Nucleicacidsresearchvol.20，No.14(1992)3790中所述的Robzyk和Kassir’s方法提取。酶測定法半胱氨酸蛋白酶測定法96孔微量滴定板測定法向各孔中加入下列成份10微升0.5M醋酸鈉緩衝液(pH5)，10微升2MNaCl(含有700微升巰基乙醇/100ml)，45微升D.W.(蒸餾水)和10微升酶樣品。然後平板在室溫下溫育5-10分鐘(用於肽酶的成熟)，之後加入25微升40μM的Z-Phe-Arg-MCA(0.1％DMSO)。最後，在螢光計中測量460nm下MCA(4-甲基-香豆酸醯-7-醯胺)的發射。胰蛋白酶測定法(鐮孢胰蛋白酶的PNA測定法)底物將50mgNα-苯甲醯基-DL-精氨酸-對-N-硝醯苯胺(Nitroanilide)(BAPNA，SigmaB-4875)溶於1mlDMSO且保存在-20℃。該溶液在即將使用前在測定緩衝液中稀釋100倍。測定緩衝液50mM硼酸鹽-NaOH(pH10.5)+2mMCaCl2方法將20微升樣品和200微升測定緩衝液在96-孔微量滴定盤中混合併在405nm下測量DeltaOD/min5分鐘。植酸酶測定法將10微升稀釋的酶樣品(在0.1M乙酸鈉，0.01％Tween20，pH5.5中稀釋)加入250微升含5mM植酸鈉(Sigma)的0.1M乙酸鈉，0.01％Tween20，pH5.5(溶解植酸鈉後調節的pH；預熱底物)中並在37℃下溫育30分鐘。通過加入250微升10％TCA終止反應並通過加入500微升將7.3gFeSO4溶於100ml鉬酸鹽試劑(2.5g(NH4)6Mo7O24.4H2O溶於8mlH2SO4中稀釋至250ml)所得的溶液來測量游離磷酸鹽。在96孔微量滴定板中測量200微升樣品在750nm下的吸光度。包含底物和酶空白對照。也包含磷酸鹽標準曲線(0-2mM磷酸鹽)。1U等於在給定條件下釋放1微摩爾磷酸鹽/分鐘的酶量。實施例實施例1在釀酒酵母中表達Derp1來自Dermantophagoidespteronyssinus的Derp1半胱氨酸蛋白酶(其胺基酸序列在SEQIDNO3中描述)編碼基因位於載體pSteD212中，該載體來自酵母表達載體pYES2.0(Invitrogen，Kofod等，1994J.Biol.Chem.26929182-29189和Christgau等，1994，Biochem.Mol.Biol.Int.33917-925)。該質粒在大腸桿菌和釀酒酵母中都複製。在釀酒酵母中從該質粒表達Derp1。重組體Derp1以Derp1前肽表達且具有破壞成熟序列內唯一N-糖基化基序的突變S54N或N52Q。為了在酵母中分泌，通過將兩個不同的信號肽導入編碼pro-Derp1基因的上遊檢測了它們的表達效率。通過克隆DNA片斷製備含有信號肽的表達構建體(Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual，第二版，冷泉港，1989)。一個信號肽是具有胺基酸序列MKIVLAIASLLALSAVYA的天然存在的DermantophagoidespteronyssinusDerp1信號肽且另一信號肽來自Humiculainsolens角質酶並具有胺基酸序列MKFFTTILSTASLVAALP(SEQIDNO1)。具有塵蟎(dustmite)Derp1信號肽的酵母菌株和構建體稱為pre-pro-Derp1且具有角質酶信號肽的酵母菌株和構建體稱為cuti-pro-Derp1。將構建體轉化進釀酒酵母。為了篩選表達Derp1的酵母轉化子，將轉化溶液塗布在SC-瓊脂板上用於在30℃形成菌落3天。將菌落接種在50ml無菌塑料管中，每管含有10mLSC培養基。試管在含有100mlSC培養基的500ml有擋板的錐形瓶中30℃，250rpm發酵4天。發酵培養液用於夾心ELISA實驗以測定表達蛋白的濃度。通過上面方法部分所述的夾心ELISA測定pre-proDerp1S54N和pre-proDerp1N52Q轉化子中Derp1的表達水平為相同的水平±8％。可推斷具有pre-pro-Derp1的兩個菌株的表達水平不依賴於使用兩個突變S54N和N52Q中的哪一個。在另一實驗中，4.5Lpre-pro-Derp1(N52Q)和cuti-pro-Derp1(S54N)的培養液發酵4天，發酵期間每天取樣並通過上述夾心ELISA測量Derp1的量以追蹤表達水平。cuti-pro-Derp1和pre-pro-Derp1表達產量之間的比率顯示如下。發酵的每天中cuti-pro-Derp1比pre-pro-Derp1多表達6-10倍的Derp1，表明pro-Derp1前面的角質酶信號肽與使用天然塵蟎Derp1信號肽比較增加了pro-Derp1蛋白的表達水平。實施例2在釀酒酵母中表達卷枝毛黴的纖維素酶卷枝毛黴IFO4554在含有RS-25+0.5％乳糖培養基的搖瓶中30℃下培養1天。收集菌絲體並用於mRNA製備，隨後將該mRNA逆轉錄成cDNA。使用MCE-BC1F和MCE-NruR引物對和下列PCR條件通過PCR從該cDNA擴增大約1kb的片斷94℃下2分鐘；35個循環的94℃下1分鐘，45℃下1分鐘和72℃下2.5分鐘；最後在72℃下8分鐘。將擴增的片斷克隆進T-載體(Novagene)。用引物對M61F和C-末端R61R，和M61CutisigF和C-末端R61R再擴增T-載體中的片斷(毛黴纖維素酶基因)，其中前一引物對用於含原始信號序列(毛黴纖維素酶基因的信號序列)的構建體，且後一引物對用於構建含有H.insolens角質酶信號序列(SEQIDNO2)和毛黴纖維素酶基因的核酸序列。通過將所得的PCR片斷與用HindIII和XbaI，和PvuII與XbaI分別消化的pJC039載體一起導入釀酒酵母YNG318中轉化酵母。所得的轉化子在含有YPD培養基的24孔平板中在30℃和180rpm下培養3天。將培養物上清上樣到含有0.2％CMC(羧甲基纖維素)，pH8.5的瓊脂板的孔中。在下表中列出了圍繞含有酵母細胞培養上清的孔的暈環大小，該酵母細胞表達含H.insolens角質酶信號肽或含毛黴纖維素酶基因信號肽的毛黴纖維素酶。由於該纖維素酶能夠降解CMC從而產生暈環，因此暈環的大小相關於放入特定孔中的培養上清中存在的纖維素酶的量。因此，大暈環表明纖維素酶的含量高而小暈環表明纖維素酶的含量低。該結果表明用H.insolens角質酶基因的信號肽序列表達時毛黴纖維素酶在酵母中的表達水平比用其自身信號肽序列(毛黴纖維素酶基因)表達時高得多。實施例3在釀酒酵母中表達白車軸草半胱氨酸蛋白酶為了構建含有α-因子信號肽和白車軸草半胱氨酸蛋白酶的表達載體，用引物對α-信號-MunI和α-信號-CysProR再次擴增編碼α-因子信號肽的DNA片斷。用引物對，α-信號-CysProF和Spe-CysProR並使用EMBLAY192363序列作為模板再次擴增編碼白車軸草半胱氨酸蛋白酶前體成熟區的基因。通過將這兩個PCR片斷與用HindIII和XbaI消化的pJC039載體混合在一起並導入釀酒酵母YNG318中轉化酵母。為了構建包含H.insolens角質酶信號肽和白車軸草半胱氨酸蛋白酶的表達載體，用引物對Cuti-Sig-CysPro和CysProC-term再次擴增編碼白車軸草半胱氨酸蛋白酶前體成熟區的基因。通過將獲得的PCR片斷與用HindIII和XbaI消化的pJC039載體混合併導入釀酒酵母YNG318中轉化酵母。獲得的轉化子在含1mlYPD的24孔平板中27℃下培養3天，然後按方法部分所述檢測上清的半胱氨酸蛋白酶活性。半胱氨酸蛋白酶活性的測量值在下表中顯示。結果表明當用H.insolens角質酶信號肽表達時白車軸草半胱氨酸蛋白酶在酵母中的表達水平比用α-因子信號肽高10倍。實施例4在釀酒酵母中表達鐮孢胰蛋白酶用引物對酵母-F和酵母-R，以及cuti-pre和酵母-R使用EMBLS63827序列作為模板再次擴增鐮孢胰蛋白酶基因，即SEQIDNO6所示的cDNA序列。酵母-F/酵母-R引物對用於構建包含編碼胰蛋白酶基因信號肽、前肽區(pro-region)和成熟部分的核酸序列的序列，而cuti-pre/酵母-R引物對用於構建包含H.insolens角質酶信號肽和前肽區和鐮孢成熟胰蛋白酶基因的核酸序列。將所得的PCR片斷與用HindIII和XbaI，以及PvuII和XbaI消化的pJC039載體一起導入釀酒酵母YNG318中轉化酵母。獲得的轉化子(pTM-TP1和pTM-TP2)在含有YPD培養基的24孔平板中在30℃，180rpm下培養3天。pTM-TP1鐮孢胰蛋白酶信號+鐮孢胰蛋白酶前肽+成熟胰蛋白酶pTM-TP2H.insolens角質酶信號+H.insolens角質酶前肽+成熟胰蛋白酶按上文方法部分所述測量胰蛋白酶活性。即使加入NeutraseTM(作為成熟酶)在兩種培養物上清中都沒有觀察到活性。然而，用pTM-TP2通過Western印跡檢測到胰蛋白酶的前體形式(角質酶前肽+成熟胰蛋白酶)。因此，製備下列構建體pTM-TP2-KexH.insolens角質酶信號肽+H.insolens角質酶前肽區+KexII位點+成熟鐮孢胰蛋白酶pTM-TP2w/oproH.insolens角質酶信號肽+成熟鐮孢胰蛋白酶pTM-TP2TPproH.insolens角質酶信號肽+鐮孢胰蛋白酶前肽區+鐮孢成熟胰蛋白酶各引物對，TP2-KexF和R，Cuti-preF和R以及CUTIpre-TPproF和R，分別通過將它們與用EagI消化的pTM-TP2載體混合併將該混合物導入釀酒酵母YNG318中用於製備pTM-TP2-Kex，pTM-TP2w/opro和pTM-TP2Tppro。獲得的轉化子在含有YPD培養基的24孔平板中在30℃，180rpm下培養3天。其中「-」是指在Western印跡中檢測不到活性或無結合帶，「+」是指可檢測到胰蛋白酶活性，「前體形式」是指可檢測到胰蛋白酶的前體形式，「N.T.」是指「沒有檢測」且對於pTM-TP2w/opro是指可檢測到比成熟酶更大的蛋白質，然而該構建體設計成不包含前肽區，因此它不是前體形式。當向上清中加入Neutrase時(終濃度0.5AU/ml)用pTM-TP2TPpro載體檢測到胰蛋白酶活性。結果表明鐮孢胰蛋白酶自身信號肽在酵母中不能有效工作以表達胰蛋白酶，而H.insolens角質酶信號肽則可以。鐮孢胰蛋白酶的前肽區(也稱為前肽序列)(7個胺基酸)似乎對於該胰蛋白酶的正確摺疊和活化是必需的。實施例5在釀酒酵母中表達隔孢伏革菌植酸酶用引物對(PP1F和PPR，PP2F和PPR)使用EMBLPLY310696序列作為模板擴增隔孢伏革菌的植酸酶基因，即，SEQIDNO8所示的cDNA序列。PP1F/PPR引物對用於構建編碼隔孢伏革菌植酸酶基因信號肽和隔孢伏革菌植酸酶成熟蛋白的核酸序列，而PP2F/PPR引物對用於構建編碼H.insolens角質酶基因信號肽和成熟隔孢伏革菌植酸酶蛋白的核酸序列。通過將所得的PCR片斷與用HindIII和XbaI，以及PvuII和XbaI消化的pJC039載體一起導入釀酒酵母YNG318中轉化酵母。獲得的轉化子在含有YPD培養基的24孔平板和500ml搖瓶中在30℃，180rpm下培養3天。pTMPP1構建體包含隔孢伏革菌植酸酶的原有信號肽序列，而pTMPP2構建體包含H.insolens角質酶信號肽序列。按方法部分所述測量在24孔平板或搖瓶中培養的包含pTMPP1或pTMPP2構建體的轉化子培養物上清中的植酸酶活性。結果如下所示。結果表明包含pTMPP2構建體的轉化子比包含pTMPP1構建體的轉化子表達更高的植酸酶活性，表明H.insolens信號肽與植酸酶自身信號肽相比增加在酵母中的植酸酶表達。實施例6在米麴黴中表達隔孢伏革菌的植酸酶使用實施例5所述的包含具有其自身信號肽序列的植酸酶基因和具有H.insolens角質酶信號肽序列的植酸酶基因的構建體來構建麴黴屬的表達載體並按Lassen等，(2001)，AppliedandEnvironmentalMicorbiology，67，4701-4707中所述轉化麴黴。對於每個構建體，分離49個菌株，純化並通過在搖瓶中培養所述轉化子按上文方法部分所述測量植酸酶的產量。當比較來自兩組構建體的表達最高水平植酸酶的菌株時，發現包含具有角質酶信號肽的構建體的菌株比包含植酸酶信號肽的菌株表達的植酸酶多大約1.4倍。同樣，當比較每組中表達最大量植酸酶的5個菌株的植酸酶平均表達量時，包含具有角質酶信號肽的構建體的菌株比包含具有植酸酶信號肽的構建體的菌株表達的植酸酶多大約1.3倍。序列表110諾維信公司(NovozymesA/S)120用於生產多肽的信號肽130106561609170PatentInversion3.2210121118212PRT213Humicolainsolens4001MetLysPhePheThrThrIleLeuSerThrAlaSerLeuValAlaAla151015LeuPro210221154212DNA213Humicolainsolens4002atgaagttcttcaccaccatcctcagcaccgccagccttgttgctgctctcccc542103211320212PRT213Dermatophagoidespteronyssinus220221SIGNAL222(1)..(18)220221PROPEP222(19)..(98)220221mat_peptide222(99)..(320)4003MetLysIleValLeuAlaIleAlaSerLeuLeuAlaLeuSerAlaVal-95-90-85TyrAlaArgProSerSerIleLysThrPheGluGluTyrLysLysAla-80-75-70PheAsnLysSerTyrAlaThrPheGluAspGluGluAlaAlaArgLys-65-60-55AsnPheLeuGluSerValLysTyrValGlnSerAsnGlyGlyAlaIle-50-45-40-35AsnHisLeuSerAspLeuSerLeuAspGluPheLysAsnArgPheLeu-30-25-20MetSerAlaGluAlaPheGluHisLeuLysThrGlnPheAspLeuAsn-15-10-5AlaGluThrAsnAlaCysSerIleAsnGlyAsnAlaProAlaGluIle-11510AspLeuArgGlnMetArgThrValThrProIleArgMetGlnGlyGly15202530CysGlySerCysTrpAlaPheSerGlyValAlaAlaThrGluSerAla354045TyrLeuAlaTyrArgAsnGlnSerLeuAspLeuAlaGluGlnGluLeu505560ValAspCysAlaSerGlnHisGlyCysHisGlyAspThrIleProArg657075GlyIleGluTyrIleGlnHisAsnGlyValValGlnGluSerTyrTyr808590ArgTyrValAlaArgGluGlnSerCysArgArgProAsnAlaGlnArg95100105110PheGlyIleSerAsnTyrCysGlnIleTyrProProAsnValAsnLys115120125IleArgGluAlaLeuAlaGlnThrHisSerAlaIleAlaValIleIle130135140GlyIleLysAspLeuAspAlaPheArgHisTyrAspGlyArgThrIle145150155IleGlnArgAspAsnGlyTyrGlnProAsnTyrHisAlaValAsnIle160165170ValGlyTyrSerAsnAlaGlnGlyValAspTyrTrpIleValArgAsn175180185190SerTrpAspThrAsnTrpGlyAspAsnGlyTyrGlyTyrPheAlaAla195200205AsnIleAspLeuMetMetIleGluGluTyrProTyrValValIleLeu2102152202104211316212PRT213卷枝毛黴(Mucorcircinellides)220221mat_peptide222(1)..(316)4004AlaSerCysSerSerValTyrGlyGlnCysGlyGlyIleGlyTrpSer151015GlyProThrCysCysGlnSerGlySerThrCysValAlaGlnGluGly202530AsnLysTyrTyrSerGlnCysLeuProGlySerHisSerAsnAsnAla354045GlyAsnAlaSerSerThrLysLysThrSerThrLysSerSerThrThr505560ThrAlaLysAlaThrAlaThrValThrThrLysThrValThrLysThr65707580ThrThrLysThrThrThrLysThrSerThrThrAlaA1aAlaSerThr859095SerThrSerSerSerAlaGlyTyrLysValIleSerGlyGlyLysSer100105110GlySerGlySerThrThrArgTyrTrpAspCysCysLysAlaSerCys115120125SetTrpProGlyLysAlaSerValThrGlyProValAspThrCysAla130135140SerAsnGlyIleSerLeuLeuAspAlaAsnAlaGlnSerGlyCysAsn145150155160GlyGlyAsnGlyPheMetCysAsnAsnAsnGlnProTrpAlaValAsn165170175AspGluLeuAlaTyrGlyPheAlaAlaAlaSerIleAlaGlySerAsn180185190GluAlaGlyTrpCysCysGlyCysTyrGluLeuThrPheThrSetGly195200205AlaAlaSerGlyLysLysMetValValGlnValThrAsnThrGlyGly210215220AspLeuGlySerAsnHisPheAspLeuGlnMetProGlyGlyGlyVal225230235240GlyIlePheAsnGlyCysAlaAlaGlnTrpGlyAlaProAsnAspGly245250255TrpGlyAlaArgTyrGlyGlyValSerSerValSerAspCysAlaSer260265270LeuProSerAlaLeuGlnAlaGlyCysLysTrpArgPheAsnTrpPhe275280285LysAsnSerAspAsnProThrMetThrPheLysGluValThrCysPro290295300AlaGluLeuThrThrArgSerGlyCysGluArgLys3053103152105211327212PRT213白車軸草(TrifoliumrepensL)220221mat_peptide222(109)..(327)4005ArgAspPheSerIleValGlyTyrSerSerGluAspLeuLysSerMet-105-100-95AspLysLeuIleGluLeuPheGluSerTrpMetSerArgHisGlyLys-90-85-80IleTyrGluThrIleGluGluLysLeuLeuArgPheGluValPheLys-75-70-65AspAsnLeuLysHisIleAspAspArgAsnLysValValSerAsnTyr-60-55-50-45TrpLeuGlyLeuAsnGluPheAlaAspLeuSerHisGlnGluPheLys-40-35-30AsnLysTyrLeuGlyLeuLysValAspLeuSerGlnArgArgGluSer-25-20-15SerAsnGluGluGluPheThrTyrArgAspValAspLeuProLysSer-10-5-11ValAspTrpArgLysLysGlyAlaValThrProValLysAsnGlnGly5101520GlnCysGlySerCysTrpAlaPheSerThrValAlaAlaValGluGly253035IleAsnGlnIleValThrGlyAsnLeuThrSerLeuSerGluGlnGlu404550LeuIleAspCysAspThrThrTyrAsnAsnGlyCysAsnGlyGlyLeu556065MetAspTyrAlaPheSerPheIleValGlnAsnGlyGlyLeuHisLys707580GluAspAspTyrProTyrIleMetGluGluSerThrCysGluMetLys859095100LysGluGluThrGlnValValThrIleAsnGlyTyrHisAspValPro105110115GlnAsnAsnGluGlnSerLeuLeuLysAlaLeuAlaAsnGlnProLeu120125130SerValAlaIleGluAlaSerSerArgAspPheGlnPheTyrSerGly135140145GlyValPheAspGlyHisCysGlySerAspLeuAspHisGlyValSer150155160AlaValGlyTyrGlyThrSerLysAsnLeuAspTyrIleIleValLys165170175180AsnSerTrpGlyAlaLysTrpGlyGluLysGlyPheIleArgMetLys185190195ArgAsnIleGlyLysProGluGlyIleCysGlyLeuTyrLysMetAla200205210SerTyrProThrLysLysLys2152106211998212DNA213尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)220221CDS222(58)..(804)4006atcatcaaccactcttcactcttcaactctcctctcttggatatctatctcttcacc57atggtcaagttcgcttccgtcgttgcacttgttgctcccctggctgct105MetValLysPheAlaSerValValAlaLeuValAlaProLeuAlaAla151015gccgctcctcaggagatccccaacattgttggtggcacttctgccagc153AlaAlaProGlnGluIleProAsnIleValGlyGlyThrSerAlaSer202530gctggcgactttcccttcatcgtgagcattagccgcaacggtggcccc201AlaGlyAspPheProPheIleValSerIleSerArgAsnGlyGlyPro354045tggtgtggaggttctctcctcaacgccaacaccgtcttgactgctgcc249TrpCysGlyGlySerLeuLeuAsnAlaAsnThrValLeuThrAlaAla505560cactgcgtttccggatacgctcagagcggtttccagattcgtgctggc297HisCysValSerGlyTyrAlaGlnSerGlyPheGlnIleArgAlaGly65707580agtctgtctcgcacttctggtggtattacctcctcgctttcctccgtc345SerLeuSerArgThrSerGlyGlyIleThrSerSerLeuSerSerVal859095agagttcaccctagctacagcggaaacaacaacgatcttgctattctg393ArgValHisProSerTyrSerGlyAsnAsnAsnAspLeuAlaIleLeu100105110aagctctctacttccatcccctccggcggaaacatcggctatgctcgc441LysLeuSerThrSerIleProSerGlyGlyAsnIleGlyTyrAlaArg115120125ctggctgcttccggctctgaccctgtcgctggatcttctgccactgtt489LeuAlaAlaSerGlySerAspProValAlaGlySerSerAlaThrVal130135140gctggctggggcgctacctctgagggcggcagctctactcccgtcaac537AlaGlyTrpGlyAlaThrSerGluGlyGlySerSerThrProValAsn145150155160cttctgaaggttactgtccctatcgtctctcgtgctacctgccgagct585LeuLeuLysValThrValProIleValSerArgAlaThrCysArgAla165170175cagtacggcacctccgccatcaccaaccagatgttctgtgctggtgtt633GlnTyrGlyThrSerAlaIleThrAsnGlnMetPheCysAlaGlyVal180185190tcttccggtggcaaggactcttgccagggtgacagcggcggccccatc681SerSerGlyGlyLysAspSerCysGlnGlyAspSerGlyGlyProIle195200205gtcgacagctccaacactcttatcggtgctgtctcttggggtaacgga729ValAspSerSerAsnThrLeuIleGlyAlaValSerTrpGlyAsnGly210215220tgtgcccgacccaactactctggtgtctatgccagcgttggtgctctc777CysAlaArgProAsnTyrSerGlyValTyrAlaSerValGlyAlaLeu225230235240cgctctttcattgacacctatgcttaaataccttgttggaagcgtcg824ArgSerPheIleAspThrTyrAla245agatgttccttgaatattctctagcttgagtcttggatacgaaacctgtttgagaaatag884gtttcaacgagttaagaagatatgagttgatttcagttggatcttagtcctggttgctcg944taatagagcaatctagatagcccaaattgaatatgaaatttgatgaaaatattc9982107211248212PRT213尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)4007MetValLysPheAlaSerValValAlaLeuValAlaProLeuAlaAla151015AlaAlaProGlnGluIleProAsnIleValGlyGlyThrSerAlaSer202530AlaGlyAspPheProPheIleValSerIleSerArgAsnGlyGlyPro354045TrpCysGlyGlySerLeuLeuAsnAlaAsnThrValLeuThrAlaAla505560HisCysValSerGlyTyrAlaGlnSerGlyPheGlnIleArgAlaGly65707580SerLeuSerArgThrSerGlyGlyIleThrSerSerLeuSerSerVal859095ArgValHisProSerTyrSerGlyAsnAsnAsnAspLeuAlaIleLeu100105110LysLeuSerThrSerIleProSerGlyGlyAsnIleGlyTyrAlaArg115120125LeuAlaAlaSerGlySerAspProValAlaGlySerSerAlaThrVal130135140AlaGlyTrpGlyAlaThrSerGluGlyGlySerSerThrProValAsn145150155160LeuLeuLysValThrValProIleValSerArgAlaThrCysArgAla165170175GlnTyrGlyThrSerAlaIleThrAsnGlnMetPheCysAlaGlyVal180185190SerSerGlyGlyLysAspSerCysGlnGlyAspSerGlyGlyProIle195200205ValAspSerSerAsnThrLeuIleGlyAlaValSerTrpGlyAsnGly210215220CysAlaArgProAsnTyrSerGlyValTyrAlaSerValGlyAlaLeu225230235240ArgSerPheIleAspThrTyrAla24521082111568212DNA213peniophoralycii220221CDS222(111)..(1427)220221sig_peptide222(111)..(197)220221mat_peptide222(198)..(1427)4008catcttctgctctgacctccatctcgctgagcggccgacgagaacctaggggctctaagt60ccacgtactatcgccgcgcctgtgaaggccccataccagcccttatcgatatggtt116MetValtcttcggcattcgcaccttccatcctacttagcttgatgtcgagtctt164SerSerAlaPheAlaProSerIleLeuLeuSerLeuMetSerSerLeu-25-20-15gctttgagcacgcagttcagctttgttgcggcgcagctacctatcccc212AlaLeuSerThrGlnPheSerPheValAlaAlaGlnLeuProIlePro-10-5-115gcacaaaacacaagtaattgggggccttacgatcccttctttcccgtc260AlaGlnAsnThrSerAsnTrpGlyProTyrAspProPhePheProVal101520gaaccgtatgcagctccgccggaagggtgcacagtgacacaggtcaac308GluProTyrAlaAlaProProGluGlyCysThrValThrGlnValAsn253035ctgattcagaggcacggcgcgcgttggcccacatccggcgcgcggtcg356LeuIleGlnArgHisGlyAlaArgTrpProThrSerGlyAlaArgSer404550cggcaggtcgccgccgtagcgaagatacaaatggcgcgaccattcacg404ArgGlnValAlaAlaValAlaLysIleGlnMetAlaArgProPheThr556065gatcccaagtatgagttcctcaacgacttcgtgtacaagttcggcgtc452AspProLysTyrGluPheLeuAsnAspPheValTyrLysPheGlyVal70758085gccgatctgctaccgttcggggctaaccaatcgcaccaaaccggcacc500AlaAspLeuLeuProPheGlyAlaAsnGlnSerHisGlnThrGlyThr9095100gatatgtatacgcgctacagtacactatttgagggcggggatgtaccc548AspMetTyrThrAr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1，特別是SEQIDNO3中胺基酸19-320或其變異體。12.根據任一前面權利要求的方法，其中該真菌宿主細胞是絲狀真菌宿主細胞，例如麴黴屬細胞，例如米麴黴。13.根據權利要求1-11中任一項的方法，其中該真菌宿主細胞是酵母細胞，例如酵母屬細胞，例如，釀酒酵母。14.核酸構建體，包含與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地相連的編碼信號肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列相對於第二核苷酸序列是外源的，且第一核苷酸序列的3′端緊接著第二核苷酸序列的上遊，且第一核苷酸序列選自如下組成的組中(i)編碼具有與SEQIDNO1有至少70％同一性的胺基酸序列的信號肽的核苷酸序列；(ii)與SEQIDNO2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和(iii)在嚴格條件下與SEQIDNO2的核苷酸，或其互補鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴格條件定義為在低於計算的Tm5℃至10℃的0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP，和每ml0.2mg酵母RNA中預雜交、雜交和雜交後洗滌，並在低於計算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗滌15分鐘一次並使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘。15.根據權利要求14的核酸構建體，其中第一核苷酸序列編碼包含SEQIDNO1的胺基酸序列的信號肽。16.根據權利要求15的核酸構建體，其中第一核苷酸序列編碼由SEQIDNO1的胺基酸序列組成的信號肽，或其保留指導該多肽進入或通過細胞膜例如進入細胞分泌途徑的能力的肽片斷。17.根據權利要求14的核酸構建體，其中第一核苷酸序列由SEQIDNO2，或其編碼保留指導該多肽進入或通過細胞膜例如進入細胞分泌途徑的能力的信號肽的子序列組成。18.含有權利要求14-17中任一項的核酸構建體的重組表達載體。19.含有權利要求14-17任一項的核酸構建體或權利要求18的表達載體的重組宿主細胞。20.信號肽用於生產多肽的用途，其中該信號肽由第一核苷酸序列編碼且多肽由相對於第一核苷酸序列是外源的第二核苷酸序列編碼，且第一核苷酸序列的3′端緊接著第二核苷酸序列的上遊，且其中第一核苷酸序列選自如下組成的組中(i)編碼具有與SEQIDNO1有至少70％同一性的胺基酸序列的信號肽的核苷酸序列；(ii)與SEQIDNO2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和(iii)在嚴格條件下與SEQIDNO2的核苷酸，或其互補鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴格條件定義為在低於計算的Tm5℃至10℃的0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP，和每ml0.2mg酵母RNA中預雜交、雜交和雜交後洗滌，並在低於計算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗滌15分鐘一次並使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘。全文摘要本發明涉及包括使用信號肽生產多肽的方法，涉及含有編碼信號肽的第一核苷酸序列和相對於第一核苷酸序列是外源的編碼多肽的第二核苷酸序列。另外，還涉及含有所述核酸構建體的表達載體和宿主細胞。文檔編號C12N15/81GK1969041SQ200580019572公開日2007年5月23日申請日期2005年6月14日優先權日2004年6月14日發明者松井知子,亨麗埃特·德拉伯格,斯特芬·丹尼爾森申請人:諾維信公司