血管成熟化、正常化或穩定化劑以及皺紋防止和/或改善劑的製作方法

2023-05-15 04:43:16 4

專利名稱：血管成熟化、正常化或穩定化劑以及皺紋防止和/或改善劑的製作方法
技術領域：
本發明提供包含來源於樟(Cinnamomum)屬植物、特別是肉桂(Cinnamomum cassia Blume)種植物的提取物的血管成熟化、正常化或穩定化劑、Tie2(含Ig和EGF同源結構域 的酪氨酸激酶，Tyrosine Kinase with Ig and EGF Homology Domain 2)活化劑(Tie2 磷 酸化劑)以及皺紋防止和/或改善劑。
背景技術：
在血管中，來自血管內皮細胞的外腔面的總稱為血管壁細胞的血管平滑肌細胞和 /或周細胞介由細胞外基質或直接與血管內皮細胞粘著。根據血管直徑大小不同，內皮細 胞與壁細胞的粘著比率也不同，在大血管系統中，1層內皮細胞附著有多層壁細胞，在中、小 血管中，1個內皮細胞往往附著1個壁細胞，此外，在直徑更細的血管中，1個壁細胞與多個 內皮細胞粘著。因此，壁細胞對血管內皮細胞的附著對於血管在結構上的「成熟化」過程是 重要的。此外，通過血管內皮細胞彼此粘著，形成了使得血管內環境因子(細胞和體液因 子)不容易漏出到血管外的內皮細胞間的粘著斑，這對於功能性血管的「成熟化」過程是重 要的。而且，根據組織的氧和/或營養成分需要，特別是在它們不足時，血管通過擴大管腔 進行調節，以便增加血流，並將氧、養分充分輸送到組織中。即，「血管成熟化」的定義如下 通過血管內皮細胞彼此形成粘著斑來控制滲透性，通過血管內皮細胞與壁細胞的附著而使 結構穩定化，將血管腔控制為大中小。此外，在各種病態下，構建了血管結構紊亂的血管，內皮細胞彼此的粘著被抑制、 和/或形成了壁細胞與內皮細胞的粘著缺損的不成熟的血管。由於這會導致血管滲透性無 秩序地增強，因此組織內與血管內的體液因子和/或細胞的運輸變得異常。如果滲透性增 強，則會發生組織浮腫，並造成組織功能不全，而且由於炎症細胞的浸潤無秩序地發生而會 導致炎症。此外，由於壁細胞會抑制由現存血管芽生出血管，因此由沒有壁細胞的血管過量 地芽生出血管，而誘導出無秩序的血管芽生，從而導致病態惡化。這樣的現象可在以糖尿病 性視網膜病變和/或腫瘤、炎症為代表的病態中觀察到。即，「血管正常化」的定義如下通 過提高內皮細胞彼此的粘著，促進壁細胞與內皮細胞的附著，將血管滲透性被破壞了的血 管和/或導致血管無秩序增生那樣的異常血管變成正常狀態。此外，上述那樣的異常血管 可由於如下原因觸發糖尿病、高血脂症、高血壓等造成的血流內外環境因子的變化對內皮 細胞和/或壁細胞產生損傷(細胞死亡等)；或者癌症和/或炎症造成血管新生促進因子 過度產生。「血管穩定化」的定義如下當發生上述的病態時，抑制對現存血管的損傷並抑制 內皮細胞彼此解離、抑制內皮細胞與壁細胞解離。此外，該穩定化還包括抑制內皮細胞的細 胞死亡的機制。血管新生是指由現存血管形成新血管網的現象，其與腫瘤、慢性類風溼性關節 炎、糖尿病性視網膜病變、高血脂症、高血壓等以血管病變為主體的疾病密切相關。以 VEGF(vascular endothelial growth factor 血管內皮細胞生長因子)的分子克隆為開
3端，作為特異性地在血管形成中發揮作用的因子，已經相繼鑑別出了 VEGF家族和促血管生 成素(angiopoietir^Ang)家族的分子。VEGF及其受體參與從被稱為脈管形成的從血管初 生到後來的血管新生的非常廣範圍的血管形成。另一方面，Ang在脈管形成後，在伴有血管 內皮細胞的芽生、分枝、嵌入、萎縮等細胞現象的管腔形成中發揮作用。Ang介由在血管內 皮細胞中表達的受體型酪氨酸激酶Tie (含Ig和EGF同源結構域的酪氨酸激酶，tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain)_2來控制血管內皮細胞與周皮細胞(周細胞) 和/或血管平滑肌細胞等血管壁細胞的粘著，在血管結構的穩定化中發揮作用(實驗醫學 Vol. 20，No. 8 (2002) pp. 52-57 非專利文獻 1)。迄今為止，已知Ang-1 4這4個異構體，Ang_l、Ang-2在人、小鼠中均存在，而 Ang-3在小鼠中存在，Ang-4在人中存在。從壁細胞分泌出的Ang-1、Ang_4刺激Tie_2， 引起細胞內酪氨酸激酶結構域的自身磷酸化，隨著整聯蛋白的活化、粘著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的活化、PI3K/Akt (phosphatidylinositol-3-kinase (磷脂醯肌 醇-3-激酶)，PI3K ；serine-threonine kinase (絲氨酸-蘇氨酸激酶):Akt)的活化，誘 導內皮細胞與壁細胞粘著。在正氧狀態下，內皮細胞通過壁細胞正常分泌的Ang-1、Ang-4 來維持內皮細胞-壁細胞之間的粘著，但是如果局部產生低氧狀態，則作為Ang-l、Ang-4的 拮抗物的Ang-2、Ang-3的產生會提高，暫時抑制Tie2活化，抑制內皮細胞與附著於該內皮 細胞的壁細胞粘著。而且，由於壁細胞的解離，內皮細胞增殖並開始芽生式血管新生，從而 形成新血管網。Tie2活化通過誘導內皮細胞與壁細胞粘著，有助於血管結構穩定化，而且 可促進內皮細胞彼此粘著並控制血管滲透性。此外，已知Tie2活化可抑制內皮細胞的細胞 死亡(Cho CH, Kammerer RA, Lee HJ, Yasunaga K, Kim KT, Choi HH, Kim ff, Kim SH, Park SK, Lee GM, Koh GY. Designed angiopoietin-1variant, COMP—Angl, protects against radiation-induced endothelial cell apoptosis (設計白勺i^ifl管生成素 $異體 COMP-Angl，保護細胞不受輻射誘導的內皮細胞凋亡).Proc Natl Acad Sci U S A. 2004Apr 13 ；101 (15) =5553-8.非專利文獻2)，因此針對細胞內外的各種破壞血管結構的環境因 子，可以誘導Tie2活化，抑制血管的不穩定化，從而使血管穩定化和正常化。此外，在血管 再生醫療中，可以對由血管內皮細胞構建而得的血管，通過誘導Tie2活化來誘導內皮細胞 與壁細胞粘著，從而使血管成熟化。此外，在腫瘤和/或糖尿病性視網膜病變等中觀察到 的、由於壁細胞不粘著於內皮細胞而導致無秩序的血管增生那樣的疾病中，通過Tie2活化 可以使壁細胞粘著於內皮細胞，使血管正常化。此外，根據文獻(Thurston G，Suri C, Smith K,McClain J, Sato TN,Yancopoulos GD,McDonald DM. Leakage-resistant blood vessels in mice transgenically overexpressing angiopoietin_l (轉基因過度表達促血管生 成素-1的小鼠中的抗滲漏血管).Science. 1999Dec 24 ；286 (5449) :2511_4.非專利文獻 3)，已經報告了 Tie2活化可擴大血管腔，在血管狹窄化或血管擴大化被抑制而導致的缺血 性疾病中，可以通過Tie2活化來擴大血管腔，從而改善病態。此外，最近發現了具有作為Ang的結構上的特徵的捲曲螺旋(coiled-coiled)結 構域和纖維蛋白原樣(fibrinogen-like)結構域的多個分子。這些分子均不顯示與Tie_l 受體、Tie-2受體的結合能力，因此被認為是與現存Ang家族不同的分子群，被命名為促血 管生成素樣因子(Angiopoietin -like protein, Angptl),才艮告了 Angptl—1、Angptl—2、 Angptl-3、Angptl-4、Angptl-5、Angptl-6、Angptl-7。所有 Angptl 都是目前未鑑定出受體的孤兒配體，對它們也可期待顯示多種作用。 已知在除了血管內皮細胞以外的細胞中，Tie2活化誘導細胞的靜止狀態。根 據迄今為止的報告，報告了造血幹細胞上的Tie2活化誘導造血幹細胞靜止(Arai F， Hirao A, Ohmura M, Sato H, Matsuoka S, Takubo K, I to K, Koh GY, Suda T. Tie2/ angiopoietin-lsignaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche (Tie2/促血管生成素-1信號調節造血幹細胞在骨髓龕中靜 止).Cell.2004Jul 23 ；118(2) 149-61.非專利文獻4)。即，通過誘導Tie2活化，可以 維持造血幹細胞長期在體外生存。此外，根據迄今為止的報告，可知Tie2活化通過活化 整聯蛋白等粘著因子來誘導細胞與細胞外基質等粘著(Takakura N, Huang XL, Naruse T, Hamaguchi I, Dumont DJ, Yancopoulos GD, Suda T. Critical role of the TIE2 endothelial cell receptor in the development of definitive hematopoiesis (TIE2 內皮細胞受體在永久造血中的關鍵作用).Immunity. 1998Nov ;9 (5) =677-86.非專利文獻 5)。認為通過這樣誘導細胞粘著，可以利用Tie2活化而在生物體內外誘導造血幹細胞的 貼壁依賴性生存維持。此外，根據近年來的報告，暗示Tie2在存在於癌組織中的被認為惡 性度最高、與癌症復發相關的癌幹細胞中表達(Lee OH, Xu J, Fueyo J, Fuller GN，Aldape KD, Alonso MM, Piao Y, Liu TJ, Lang FF, Bekele BN, Gomez-Manzano C. Expression of the receptor tyrosine kinase Tie2 in neoplastic glial cells is associated with integrin betal-dependent adhesion to the extracellular matrix(受體酷M酸—Bl Tie2在腫瘤性膠質細胞中的表達同整聯蛋白與細胞外基質的0-1依賴性粘著相關).Mol Cancer Res. 2006 Dec ；4(12) =915-26.非專利文獻6)。正如Tie2活化可以使造血幹細胞 的細胞周期進入靜止狀態那樣，通過活化在癌幹細胞中表達的Tie2，也可以抑制癌幹細胞 的增殖。

發明內容
本發明的課題是提供新的血管成熟化、正常化、穩定化劑，以及Tie2活化(磷酸 化)劑。本發明者詳細研究了受到紫外線B照射後的皮膚組織中的行為。由於紫外線B的 照射而顯著地引起了表皮肥厚和皮膚血管形成，並引起了皺紋形成。發現在這樣的受到了 光老化的皮膚組織中Ang-1的表達顯著降低，Ang-2的表達相對於Ang_l增加。此外，由皮 膚組織切片觀察到了由於紫外線照射而壁細胞從血管內皮細胞剝離的狀態。這些認識暗示 了 通過紫外線照射可誘導內皮細胞與壁細胞的粘著被抑制、Tie2磷酸化被抑制即Tie2活 化被抑制的狀態。並且，由採用強制表達Tie2的Baf3造血細胞和人臍帶靜脈內皮細胞株 HUVEC、使各種生藥提取物發揮作用而進行研究的實驗發現，來源於樟(Cirmamomum)屬植 物的提取物具有活化Tie2的作用。此外，在由於紫外線B的照射而引起了光老化的小鼠皮 膚上塗布桂枝提取物，結果是通過塗布該提取物而具體地表現出改善作用。因此，發現了該 提取物通過Tie2磷酸化來改善、促進內皮細胞-壁細胞之間的粘著，並形成穩定的血管結 構，進而恢復UVB誘導性的皮膚損傷和皺紋形成，從而完成了本發明。因此，本申請包含下述發明(1) 一種血管成熟化、正常化或穩定化劑，包含來源於樟屬植物的提取物。
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(2)根據(1)所述的血管成熟化、正常化或穩定化劑，所述提取物來源於肉桂種植 物。(3)根據(2)所述的血管成熟化、正常化或穩定化劑，所述提取物來源於桂枝或桂皮。(4)根據⑴ (3)的任一項所述的血管成熟化、正常化或穩定化劑，所述提取物 是水提取物。(5) 一種Tie2活化(磷酸化)劑，包含來源於樟屬植物的提取物。(6)根據(5)所述的Tie2活化(磷酸化)劑，所述提取物來源於肉桂種植物。(7)根據(6)所述的Tie2活化(磷酸化)劑，所述提取物來源於桂枝或桂皮。(8)根據(5) (7)的任一項所述的Tie2活化(磷酸化)劑，所述提取物是水提 取物。(9) 一種皺紋防止和/或改善劑，其配合有(1) (4)的任一項所述的血管成熟 化、正常化或穩定化劑。(10) 一種皺紋防止和/或改善劑，其配合有(5) (8)的任一項所述的Tie2活化 (磷酸化)齊U。


圖1顯示Baf3細胞中由桂枝提取物和Angl產生的Tie2磷酸化的結果。圖2顯示由桂枝提取物和桂皮提取物產生的Tie2磷酸化的結果。圖3顯示HUVEC細胞中由桂枝提取物和Angl產生的Tie2磷酸化的結果。圖4顯示管腔形成的染色圖像。圖5以管腔形成的長度為指標顯示桂皮提取物的血管新生抑制作用。圖6以管腔形成的面積為指標顯示桂皮提取物的血管新生抑制作用。
具體實施例方式樟屬是樟目(Lauraceae)、樟科(Lauraceae)的植物，存在300以上種，已知例如 肉桂(Cinnamomum cassia Blume)、樟(C. camphora)、圓葉肉桂(C. daphnoides)、柴肉桂 (C. doederleinii)、天竺桂(C. japonicum)、圓葉藪肉桂(C. pseudo-pedunculatum)、日本 肉桂(C. sieboldii)、錫蘭肉桂(C. verum)、錫蘭肉桂(C. zeylanicum)。作為本發明中的血 管成熟化、正常化或穩定化劑、Tie2活化劑(磷酸化劑)和/或血管新生抑制劑，優選使用 來源於肉桂(Cinnamomum cassia Blume)，特別是肉桂嫩枝的桂枝(肉桂枝)或桂皮(肉桂 皮)的提取物。已知來源於作為肉桂的樹皮的桂皮的提取物作為例如生髮劑的有效成分是 有用的(特開平10-265350號公報)，但是完全不知道該提取物具有血管成熟化、正常化、穩 定化和/或Tie2活化(磷酸化)活性、血管新生抑制活性等。上述提取物可以通過常規方法來獲得，例如可以將作為其來源的植物與提取溶劑 一起在常溫或加熱下浸漬或加熱回流，然後進行過濾、濃縮而獲得。作為提取溶劑，只要是 通常提取中使用的溶劑就可以任意使用，可列舉例如，水性溶劑，例如水、生理鹽水、磷酸緩 衝液、硼酸緩衝液，或有機溶劑，例如乙醇、丙二醇、1，3_ 丁二醇、甘油等醇類，含水醇類、氯 仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯、己烷等，這些溶劑可以分別單獨使用或組合使用。優選使用水作為溶劑。用上述溶劑提取得到的提取物可以直接使用，或使用通過例如冷凍 乾燥等使其濃縮後的提取物，還可以根據需要使用採用吸附法、例如離子交換樹脂除去雜 質後的提取物，和/或用多孔聚合物(例如7、"一』 ^卜XAD-2)的柱進行吸附、然後用 所需溶劑溶出、再濃縮後的提取物。Tie2活化是指可以通過使Tie2磷酸化而將其轉化成活性體(磷酸化Tie2)的能 力。作為Tie2活化劑，已知促血管生成素1等作為活化Tie2的物質。本發明的血管成熟化、正常化或穩定化劑和/或Tie2活化(磷酸化)劑可以作為 對預防、改善血管的結構變化所致的各種疾病和老化有效的藥品或化妝品來利用。本發明 的Tie2磷酸化劑通過誘導血管的正常化、穩定化而在各種炎症性疾病和/或免疫疾病、成 人病等疾病中作為能夠改善伴隨血管新生和/或血管損傷的全身的病變部位的藥品來利 用，所述疾病例如，各種傳染病、癌症、類風溼性關節炎、痛風、高血壓、糖尿病、動脈硬化症、 特應性皮炎等。此外，可以通過抑制血管滲透性，而作為改善下述症狀的藥品或化妝品來利 用，所述症狀有包括皮膚的臟器、器官、各種組織內的浮腫，例如炎症性疾病和/或免疫疾 病、成人病引起的血管浮腫，和/或紫外線暴露和/或蟲叮咬、變態反應等引起的血管滲透 性增強所導致的浮腫和/或發癢等。Tie2磷酸化劑還可以作為能夠抑制由各種原因誘導 的內皮細胞的細胞死亡、並抑制血管不穩定化的藥品或化妝品來利用，所述細胞死亡例如， 炎症性疾病和/或免疫疾病、成人病等例如各種傳染病、癌症、類風溼性關節炎、痛風、高血 壓、糖尿病、動脈硬化症、或放射線損傷、各種藥劑和/或紫外線引起的內皮細胞的細胞死 亡。Tie2磷酸化劑可以通過血管成熟化和/或血管腔擴大化，來促進外傷、褥瘡等創傷治 愈，使血管再生醫療中的血管成熟化，作為缺血性疾病、例如腦梗塞和/或心肌梗塞的改善 劑，從而在藥品中利用，此外還可以利用血流改善效果而作為針對腰痛症、凍傷、脫髮症等 的內服和外用藥品來利用。在增大腦血流方面，也可以應用於痴呆症。針對脫髮症，也可以 作為化妝品使用。此外，對於癌症，可以作為誘導癌細胞靜止的治療藥使用，對於幹細胞，可 以作為其在生物體內外的維持藥使用。光老化一般是指作為反覆曝露於日光的結果而觀察到的皮膚的外觀和功能的變 化。作為日光的構成要素的紫外線(UV)，特別是其中的UV (稱為UVB，波長為290-320nm)主 要引起光老化。引起光老化所需的UVB的曝露量現在還未知。然而，反覆曝露於引起紅斑 和/或曬斑的水平的UVB，通常與光老化相關。在臨床上，光老化可以作為肌膚粗糙、皺紋形 成、斑著色、蒼白化、鬆弛形成、毛細管擴張症發作、黑痣產生、紫癜病發作、容易受傷、萎縮、 纖維化病的色素去除區域產生、前期惡性腫瘤和惡性腫瘤的發作等來特定。光老化通常在 臉、耳、頭、頸和手等經常曝露於日光的皮膚上發生。在皮膚的老化中，對皮膚病和/或暴露 於紫外線所引起的光老化是主要原因，本Tie2磷酸化劑可以通過抑制造成光老化的血管 疾病來用於改善光老化。本發明的血管成熟化、正常化或穩定化劑或者Tie2磷酸化劑可以根據其使用目 的來適當決定用量、用法、劑型。例如，本發明的血管新生抑制劑或Tie2磷酸化劑的給藥形 態可以為口服、非口服、外用等。作為劑型，可以列舉例如，片劑、粉劑、膠囊劑、顆粒劑、浸 膏劑、糖漿劑等口服給藥劑，或注射劑、點滴劑或栓劑等非口服給藥劑，軟膏、乳膏、乳液、洗 劑、面膜、y 」 )、浴用劑等外用劑。在本發明的血管成熟化、正常化或穩定化劑或者Tie2活化(磷酸化)劑中，用於抑制血管新生的、來源於樟屬植物的提取物的配合量可以根據用途來適當決定，一般在抑 製劑總量中作為乾燥物為0. 0001 20. 0質量％，優選為0. 0001 10. 0質量％。此外，在本發明的血管成熟化、正常化或穩定化劑或者Tie2活化(磷酸化)劑中， 除了上述來源於樟屬植物的提取物以外，可以根據需要適當配合例如，通常在食品和/或 藥品中使用的賦形劑、防潮劑、防腐劑、增強劑、增稠劑、乳化劑、抗氧化劑、甜味料、酸味料、 調味料、著色料、香料等，通常在化妝品等中使用的美白劑、保溼劑、油性成分、紫外線吸收 劑、表面活性劑、增稠劑、醇類、粉末成分、著色劑、水性成分、水、各種皮膚營養劑等。此外，在使用本發明的血管成熟化、正常化或穩定化劑或者Tie2活化(磷酸化) 劑作為皮膚外用劑時，也可以適當配合在皮膚外用劑中常用的助劑，例如乙二胺四乙酸二 鈉、乙二胺四乙酸三鈉、檸檬酸鈉、多磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡糖酸等金屬螯合劑，咖啡因、單 寧、維拉帕米(Verapamil)、凝血酸(Tranexamic Acid)及其衍生物、甘草提取物、光甘草定 (Glabridin)、木瓜果實的熱水提取物、各種生藥、乙酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其鹽等 藥劑，維生素C、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等美白劑，葡萄糖、果糖、甘 露糖、蔗糖、海藻糖等糖類，視黃酸、視黃醇、視黃醇乙酸酯、視黃醇棕櫚酸酯等維生素A類寸。實施例接下來，根據實施例更詳細地說明本發明。另外，本發明不限於此。配合量以質
量％表示。桂枝熱水提取乾燥殘餘成分的調製在400. 7g桂枝(肉桂:Cinnamomum cassia Blume的枝部分)中加入2L水，加熱 提取3小時，過濾。在所得的殘渣中加入2L水，重複同樣的操作，再進行2次加熱提取。將 所得的濾液冷凍乾燥，從而獲得39. 7g熱水提取乾燥殘餘成分。將該樣品作為桂枝熱水提 取物。桂枝提取物HP-20柱處理將上述獲得的熱水提取物10g進樣到義^ ^ > HP_20(三菱化學制)柱中，用 含水乙醇體系使其溶出，獲得50%乙醇溶出流分作為目標溶出流分。桂皮熱水提取乾燥殘餘成分的調製在20. 12g桂皮(肉桂:Cinnamomum cassia Blume的樹皮部分)中加入200ml水， 加熱提取3小時，過濾，在所得的殘渣中加入200ml水，重複同樣的操作，再進行2次加熱提 取。將所得的濾液冷凍乾燥，從而獲得1.35g的熱水提取物乾燥殘餘成分。將該樣品作為 桂皮熱水提取物。Tie2磷酸化評價方法將強制表達野生型(WT) Tie2的Baf3造血細胞在RPMI1640培養基中、在 IL-3 (BI0S0URCE,PMC0034)U0% FCS存在下進行孵育。在細胞刺激的前一天，在除去了 FCS 的狀態下，採用6孔板以2X 106個細胞/l. 5mL/孔來接種並孵育一晚。將上述熱水提取幹 燥殘餘成分的DMS0溶液、作為陽性對照的促血管生成素-1 (R&D system, 923-AN)或作為陰 性對照的DMS0分別添加至孔中使得各自的最終濃度為100ppm、0. 5ppm、lOOOppm，孵育10 分鐘，然後將細胞在冰上冷卻，用冷PBS洗滌。在包含蛋白酶抑制劑(LeUpeptin(亮抑酶 肽)、Aprotinin(抑肽酶)、P印statin (抑胃肽)、PMSF、Na3V04)的RIPA緩衝液中，對細胞進行超聲波破碎。加入樣品緩衝液(0. 2M Tris-HCl(pH6. 8)，4% SDS，20%甘油，5mM EDTA， 0. 01% BPB)，在以下條件下進行SDS-PAGE(7. 5%聚丙烯醯胺凝膠，12孔，NPU-7. 5L，了卜一 (株))凝膠7. 5%丙烯醯胺凝膠(NPU-7. 5L T卜一株式會社制)電泳條件40mA (75分鐘，凝膠2片)Tie2 抗體sc_324(Santa Cruz Biotechnology 制)磷酸化Tie2 抗體#4221 (Cell Signaling 制)接下來，通過蛋白質印跡法(Western blotting，20V，4°C，過夜)向PVDF膜進行 轉印。通過5%脫脂奶粉/TBST進行封閉(1小時)，然後加入Tie-2(Santa Cruz,sc-324) 或磷酸化Tie2(Cell Signaling，#4221)，在4°C下放置過夜。接著，加入山羊抗兔Ig』 s HRP(BI0S0URCE ALI3404)，在室溫下放置1小時。通過化學發光檢測(ECL)來檢測蛋白質 條帶。圖1顯示桂枝熱水提取物的Tie2磷酸化的評價結果。觀察到桂枝提取物與Ang-1 同樣地引起Tie2磷酸化。因此，桂枝熱水提取物顯示Tie2磷酸化效果，暗示其有助於血管 成熟化、正常化、穩定化，其結果可以抑制血管新生。圖2顯示桂枝熱水提取物和桂皮熱水 提取物兩者的Tie2磷酸化的評價結果。觀察到與桂枝熱水提取物同樣地，桂皮熱水提取物 也引起Tie2的磷酸化。2)採用正常人臍帶靜脈血管內皮細胞(HUVEC)，同樣地評價Tie2磷酸化評價。在 細胞刺激前3小時，將培養基由Humedia換成RPMI1640，接下來與Baf3細胞同樣地進行評 價。其結果示於圖3。與Baf3的結果相同，桂枝熱水提取物與Ang-1同樣地引起Tie2磷酸 化。另外，在添加了作為陰性對照的DMS0體系中，未觀察到顯著的Tie2磷酸化(圖中未示 出)。皺紋防止和/或改善效果試驗光老化皺紋改善試驗採用Hr-1 (Skh-1)無毛小鼠(星野實驗動物；6周齡 10周齡)，將Schwarz等人 的方法(Haratake A. et al.，J. Invest. Dermatol.，108，769-775，1997)部分改變,依據反 復照射 UVB 的方法(Naganuma M. et al. , J. Dermatol. Sci.，25，29-35，2001，Schwartz E.， J. Invest.，Dermatol.，91，158-161，1988)來形成皺紋。即，對個體背部照射UVB (光源東 芝二 >々卜U 7々制東芝FL-20SE螢光燈)，每周3次，照射10周。開始後的照射量為36mJ/ cm2/次，第2周以後逐漸增加，第10周為216mJ/Cm2/次。總照射量為4. 6J/cm2。紫外劑量 採用以UV輻射計(UVR-305/365D(II)，株式會社卜」 二 >制)測定得到的值。停止紫外線照 射，拍攝背部照片，利用將Bissett等人的方法(Bissett DL. et al.，Photochemistry and Photobiology 46,367-378,1987)部分改變而得的方法，依據下述所示判定基準對皺紋的 產生程度進行評分，僅使用形成了評分為7以上的皺紋的個體，塗布實施例1(配合桂枝提 取物、即上述熱水提取物乾燥殘餘成分)或實施例2 (配合桂枝提取物的HP-20柱50%乙醇 溶出流分)。皺紋的評分操作由3名測定者分別進行，通過協商來決定評分。另外，在評價時，遵守動物愛護管理法及其相關條例，基於獲得公司內部動物實驗 審議會承認的計劃來實施。實施例1的組合物；
9
(成分)桂枝提取物化妝品用乙醇純化水實施例2的組合物；(成分)桂枝提取物的HP-20柱50%乙醇溶出流分化妝品用乙醇純化水
1. 0 30. 0
1. 0 30. 0
配合量(質量％)
配合量(質量％)評分判定基準0 未觀察到皺紋。1 與評分2相比，皺紋更淺、更短或數量更少。2 觀察到淺皺紋。3 與評分2相比，皺紋更深或更長。且與評分4相比，皺紋更淺、更短或數量更少。4 整體觀察到淺皺紋。5 與評分4相比，皺紋更深或更長。且與評分6相比，皺紋更淺或更短。6 觀察到深且長的皺紋。7 與評分6相比，深且長的皺紋增加。且與評分8相比，皺紋更淺或更短。8 整體觀察到深且長的皺紋。將評分為7以上的無毛小鼠分成2組，每組5隻，且使兩組的評分相同，在各組個 體的整個背部皮膚上分別按照100 i!l、l天1次、一周5次、連續6周的方式塗布顯示上述 組成的實施例1和實施例2處方。塗布結束後，拍攝背部的照片，根據上述所示的判定基準，在隱藏動物組名的狀態 下由3名測定者分別對皺紋的程度進行評分，通過協商來決定評分。此外，用在實施例1的組合物中除去了桂枝提取物的比較例1進行同樣的試驗。比較例1的組合物；(成分)配合量(質量％)化妝品用乙醇30.0純化水殘餘皺紋的改善度如下求出。即，按照「皺紋的改善度」=「樣品溶液塗布前的評分」"「塗布樣品溶液6周後的評分」的式子來計算。在下述表中作為各組的平均值顯示按照上述式得到的皺紋改善度(皺紋改善變 化量)。[表 1]
權利要求
一種血管成熟化、正常化或穩定化劑，包含來源於樟屬植物的提取物。
2.根據權利要求1所述的血管成熟化、正常化或穩定化劑，所述提取物來源於肉桂種 植物。
3.根據權利要求2所述的血管成熟化、正常化或穩定化劑，所述提取物來源於桂枝或桂皮。
4.根據權利要求1 3的任一項所述的血管成熟化、正常化或穩定化劑，所述提取物是 水提取物。
5.一種Tie2活化劑，包含來源於樟屬植物的提取物。
6.根據權利要求5所述的Tie2活化劑，所述提取物來源於肉桂種植物。
7.根據權利要求6所述的Tie2活化劑，所述提取物來源於桂枝或桂皮。
8.根據權利要求5 7的任一項所述的Tie2活化劑，所述提取物是水提取物。
9.一種皺紋防止和/或改善劑，其配合有權利要求1 4的任一項所述的血管成熟化、 正常化或穩定化劑。
10.一種皺紋防止和/或改善劑，其配合有權利要求5 8的任一項所述的Tie2活化劑。
全文摘要
本發明提供包含來源於樟(Cinnamomum)屬植物的提取物的血管成熟化、正常化或穩定化劑，或Tie2活化劑。
文檔編號A61Q19/08GK101980716SQ20098011175
公開日2011年2月23日 申請日期2009年3月31日 優先權日2008年3月31日
發明者大田正弘, 小林孝次, 常長誠, 草苅健, 高倉伸幸 申請人:株式會社資生堂