PD‑1H激動劑或拮抗劑的應用的製作方法

2023-05-15 04:49:41

本發明涉及一種用於調節受試者中誘導型調節性t細胞數量水平的方法。本發明還涉及一種用於治療受試者中t細胞免疫介導的疾病的方法。本發明還涉及pd-1h激動劑或拮抗劑在製備用於調節受試者的誘導型調節性t細胞數量水平的藥物組合物中的應用。本發明還涉及pd-1h激動劑或拮抗劑在製備用於治療受試者中t細胞免疫介導的疾病的藥物組合物中的應用。

背景技術：

調節性t細胞(treg)是cd4+t細胞的一個亞群，其具有從維持自身耐受性到調節免疫反應程度的廣泛功能。treg不是終末分化的細胞，並且可以在炎症期間被轉化為其他cd4+t細胞亞群(包括th1和th17)。研究表明，轉錄因子foxp3在功能性定向調節性t細胞譜系的建立中起重要作用。foxp3+treg細胞可以通過tgf-β分為胸腺衍生的天然treg細胞(ntreg)和誘導型treg細胞(itreg)，tgf-β調節itreg細胞的分化和胸腺衍生的ntreg穩定。在外周，itreg細胞的分化主要是由微環境驅動的。例如，炎性細胞因子ifn-γ和il-4抑制tgf-β誘導的itreg細胞，而il-6在tgf-β存在下引導th17細胞分化。因此，treg細胞的可塑性可決定正在進行的免疫反應的方向並控制炎症，如在幾種小鼠模型(包括結腸炎模型、急性移植物抗宿主病(gvhd)模型和哮喘模型)中所顯示的。

pd-1h(也稱為gi24、dies1、b7-h5、vista和dd1)是具有免疫調節功能的細胞表面免疫球蛋白超家族分子，其還在調節成骨細胞、脂肪細胞和胚胎幹細胞的分化以及細胞凋亡中扮演多種作用。pd-1h在造血細胞(如t細胞、nk細胞、單核細胞、nk細胞和dc)上組成型表達(b細胞除外)。不同於ctla-4敲除(ko)小鼠(其快速發展淋巴增殖性表型和致命的全身性自身免疫性疾病)，pd-1h缺乏症具有更加溫和的表型：pd-1hko幼鼠具有正常數量的t細胞、nk細胞、b細胞、巨噬細胞和單核細胞，而更老的小鼠經歷自發的t細胞活化，當小鼠老齡化時，觀察到記憶細胞水平增加和脾臟增大。此外，如加速的cona誘導的急性肝炎和gvhd中所示，pd-1h缺陷型小鼠對急性炎症和對抗原的免疫應答更敏感。pd-1h已在幾個體外和體內研究中被證明分別作為配體或受體在專職抗原呈遞細胞(apc)和t細胞中起作用。與這些發現一致的是，pd-1h激動型單克隆抗體已被證明是各種類型的對抗原的免疫應答的免疫抑制劑，而拮抗性mab顯示為免疫刺激劑。雖然pd-1h的反受體尚未被鑑定，但最近的一項研究表明，pd-1h/dd1α可以通過血友病性相互作用(hemophilicinteraction)介導其作用。

早期研究表明，pd-1h在treg上組成型表達，其後幾項研究表明其在treg功能調節中的作用。pd-1hig融合蛋白在體外能夠在tgf-β存在下促進小鼠和人cd4+t細胞中的foxp3+itreg的誘導。在b16-ova腫瘤模型中，pd-1hmab的給藥降低了腫瘤抗原特異性itreg細胞的分化。該結果被解釋為通過該mab阻斷pd-1h與其推定的反受體之間的相互作用。然而，一個不同的pd-1h激動型mab(mh5a)被證明可以在體外促進tgf-β誘導的treg細胞，並且輸注mh5a可抑制小鼠模型中gvhd的進展，並且伴隨著itreg的擴增。雖然這些數據表明pd-1h在treg誘導和功能中的可能作用，但尚未闡明pd-1h是否對treg細胞具有直接作用。更重要的是，pd-1h對treg細胞調節作用的機制尚不清楚。

技術實現要素：

在本發明中，發明人發現小鼠中pd-1h的遺傳消融阻斷了初始t細胞向foxp3+誘導型treg細胞(itreg)的分化，淋巴器官中itreg明顯減少。pd-1h的這種效應對於itreg是高度特異性的，因為在腸相關組織中的天然產生的itreg和tgf-β體外誘導的itreg都降低，而天然treg(ntreg)的生成保持正常。然而，itreg和ntreg的抑制功能不受pd-1h缺失的影響。除了生成量降低，pd-1h缺陷型itreg還可以在炎症環境中迅速轉化為cd4+t輔助細胞1或t輔助細胞17。這些結果表明，通過促進其分化並防止其轉化為其他cd4+t細胞亞群，pd-1h可維持itreg細胞數量水平。這些發現可能對操縱treg來控制炎症具有重要意義。

在本發明的一個方面，本發明提供了一種用於調節受試者中誘導型調節性t細胞的細胞水平方法。該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑。

在本發明的另一方面，本發明提供了pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑在製備用於調節受試者中誘導型調節性t細胞的細胞水平的藥物組合物中的用途。

在本發明的另一方面，本發明提供了治療受試者中t細胞免疫介導的疾病的方法。該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑。

在本發明的另一方面，本發明提供了pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑在製備用於治療受試者中的t細胞免疫介導的疾病的藥物組合物中的用途。

在本發明的一些實施方案中，pd-1h激動劑的施用導致受試者中誘導型調節性t細胞水平升高。在本發明的一些實施方案中，pd-1h拮抗劑的施用導致受試者中誘導型調節性t細胞的水平降低。在本發明的一些實施方案中，所述施用是靜脈內給藥。在本發明的一些實施方案中，pd-1h激動劑是抗pd-1h的激動型單克隆抗體。在本發明的一些實施方案中，pd-1h拮抗劑選自靶向pd-1h編碼多核苷酸的dsrna、sirna和shrna的反義寡聚體。在本發明的一些實施方案中，所述受試者是人。在本發明的一些實施方案中，t細胞免疫介導的疾病包括炎症、自身免疫疾病和癌症。

本發明證明pd-1h在炎性環境中抑制itreg細胞轉化為th1和th17細胞，至少部分是由於其在維持foxp3表達和itreg表型中的作用導致的。這些發現對調節treg生長和功能具有重要意義。同時，如先前所示，pd-1h抑制初始t細胞的激活以限制t細胞介導的免疫應答的啟動，它促進免疫應答期間itreg的生長和轉化。除了調節早期t細胞活化外，pd-1h似乎通過調節treg水平參與t細胞耐受性的調節。因此，pd-1h途徑可能作為一種新的靶標而被用來在炎症、自身免疫疾病和癌症中控制和操縱的t細胞介導的免疫。

附圖說明

圖1.pd-1h在foxp3+itreg細胞的新生成中的作用。(a)從wtot-ii或pd-1hkoot-ii小鼠純化的初始t細胞首先用5μmcfse標記，隨後以2×106/小鼠i.v.轉移至b6小鼠。24小時後，在飲用水中餵食1.5％ova，餵養5天。通過流式細胞儀在代表性小鼠中分析門控cd4+cfse+vβ5.1/5.2tcr+上的foxp3頻率。(b，c)實驗概要，每個符號代表單個小鼠(n＝5)。所顯示的數據代表3個獨立實驗。

圖2.pd-1h對itreg的轉化和功能的影響。(a)腸道相關淋巴器官中itreg的天然發育中的pd-1h缺失。通過在流式細胞術中用特異性抗體來表徵細胞表面cd25和細胞內foxp3表達，從而測定腸繫膜淋巴結(mln)、payer氏集合淋巴結(pp)和固有層(lp)中cd25+foxp3+treg細胞的百分比。pd-1hko小鼠及其同窩wt仔鼠(每組n＝5)用於分析。左圖表示來自每組的配對單個小鼠，右圖是一個代表性實驗的總結(每組中n＝5)。(b)腸道相關淋巴器官中cd25+foxp3+treg的絕對數。(c)itreg的體外誘導。在存在或不存在5ng/mltgf-β的情況下，用抗-cd3/cd28刺激來自wt和pd-1hko小鼠的cd4+cd25-cd62lhi初始t細胞3-5天。通過細胞內染色測定cd25+foxp3+細胞的頻率。(d，e)itreg抑制功能的體外評價。如上所述，誘導來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的初始cd4+t細胞成為foxp3(gfp+)itreg細胞。從b6小鼠中純化初始cd8+t細胞或cd4+t細胞，用cfse標記並與分選的gfp+itreg細胞在存在抗cd3的情況下以指定的treg/teff細胞比率共培養。通過與沒有添加itreg細胞的孔進行比較來確定包含itreg細胞時csfe的減少量。所顯示的數據代表至少3次獨立實驗。僅teff：沒有抗cd3刺激的t細胞；對照：具有抗cd3的teff細胞，不含有itreg細胞。(f)通過在流式細胞儀上門控cd4+foxp3(gfp+)來測定來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的itreg上的cd25、gitr、lag-3、ctla-4、icos和pd-1的表達。

圖3.細胞因子環境對pd-1h介導itreg細胞轉化缺陷的影響。(a)在沒有pd-1h的情況下誘導itreg細胞的細胞因子譜。如上所述，將初始t細胞在體外誘導為itreg，並在第4天收集培養上清液，通過小鼠th1/th2/th17cba試劑盒測定細胞因子水平。(b)在培養開始時向培養物中加入ifn-γ和il4的中和mab以從wt或pd-1hko初始t細胞體外誘導itreg細胞。培養3-5天後評價cd25+foxp3+細胞。呈現的結果來自一對小鼠。(c)來自(b)的數據的柱狀圖，數據來自一組5隻小鼠。所顯示的數據代表至少3次獨立實驗。

圖4.pd-1h對eae模型中itreg細胞穩定性的影響。(a)來自wt或ko的cd45.2+foxp3(gfp+)itreg細胞在體外誘導後通過細胞分選獲得。將1×106個wt或pd-1hkofoxp3(gfp+)itreg細胞i.v.轉移到cd45.1b6小鼠(n＝4或5每組)中，再用mog35-55肽免疫。對照小鼠用pbs接種。監測eae疾病進展和嚴重程度作為臨床評分(見方法部分)。*p<0.05，(雙向abova檢驗)。顯示的數據代表3次具有相似的結果和疾病表型的實驗中的1個。(b，c)在eae誘導的第13天，門控脾臟和引流ln(dln)細胞中的cd45.2+cd4+，並分析foxp3(gfp+)itreg細胞。(d)計數來自eae小鼠的脾臟和dln中的cd45.2+foxp3+的絕對數量。(e)使用pma/離子黴素/bfa離體將第13天的eae小鼠脾臟和dln細胞再次刺激4小時。門控cd4+cd45.2+gfp+細胞，用細胞內染色分析ifn-γ+或il-17+表達。顯示的數據來自代表性的一對小鼠。(f)在4隻或5隻小鼠組中顯示的(e)中的數據的圖表。所顯示的數據代表至少3次獨立實驗。

圖5.pd-1h促進itreg細胞的定型。(a)在第13天分析來自eae模型中各組的所轉移的itreg細胞(cd45.2+cd4+門控)。用具有特異性mab的pstat3或pstat5對脾臟細胞和dln細胞進行細胞內染色。(b)與a相同，但轉移的itreg細胞上stat3和stat5的磷酸化以繪圖值顯示。(c)通過亞硫酸氫鹽測序確定cns2區域的dna甲基化狀態。每條線代表一個克隆(一個dna鏈)；空心圓，非甲基化引物；實心圓，甲基化引物。

圖6.pd-1h影響itreg細胞的從頭分化。(a)將wt和koot-iit細胞(cd25-t細胞)分別轉移到宿主小鼠中。轉移的ot-iit細胞在轉移前用cfse標記。該圖顯示了cfse的稀釋和foxp3誘導。(b)wt(cd45.1/cd45.2)初始ot-iit細胞和ko(cd45.2)ot-ii初始t細胞以1:1的比例混合併共轉移到宿主小鼠(cd45.1)。用1.5％ova口服飼養宿主小鼠後，分析mln和pp，並通過細胞內染色測定foxp3的頻率。(c)計數所示器官中的foxp3+t細胞的絕對數量。

圖7.pd-1h調節淋巴細胞環境中itreg細胞的分化。(a)將來自wt小鼠(cd45.2)和pd-1hko小鼠(cd45.1)的初始cd4+cd62lhit細胞以1:1的比例混合，將總共2百萬個細胞轉移到rag1ko小鼠(n＝4)並在20天後測定foxp3上調。該圖顯示轉移前後wt和kocd4+t細胞比例的變化。通過細胞內染色測定foxp3+細胞的頻率。(b)計數來自rag1ko小鼠的所示器官中的cd25+foxp3+t細胞的絕對數量。(c)分析轉移的初始cd4+t細胞的細胞因子的產生。在pma/離子黴素/bfa存在下，將來自所示器官的細胞體外活化4小時，然後通過細胞內染色進行分析。所顯示的數據代表2次獨立的實驗。

圖8.pd-1h對ntreg細胞的產生和抑制功能起著重要作用。(a)使用foxp3的細胞內染色和cd25的細胞表面染色，通過流式細胞術測定脾臟和ln中cd25+foxp3+ntreg的百分比。使用來自wt和pd-1hko小鼠的六周齡同窩出生小鼠(n＝5)。計數脾臟和ln中foxp3+cd25+t細胞的絕對數量。(b)通過流式細胞儀上門控cd4+foxp3(gfp+)測定來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的ntreg上的cd25、gitr、lag-3、ctla-4、icos和pd-1的表達。(c)對來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的foxp3(gfp+)ntreg進行分選，並在存在絲裂黴素c處理的脾細胞及抗cd3抗體的情況下以不同的treg/teff比率與cfse標記的cd8+teff細胞共培養3天。通過流式細胞術測定cfse稀釋度。所顯示的數據代表至少3次獨立實驗。

圖9.pd-1h決定了骨髓嵌合小鼠中treg細胞的水平。(a)將來自cd45.1wt小鼠和cd45.2小鼠的總數為1000萬各混合骨髓細胞轉移到亞致死性輻射處理的小鼠(cd45.1/cd45.2)中。重構後10周分析小鼠。顯示wt和kot細胞的門控策略。(b)通過細胞內染色測定所示器官中的foxp3頻率。(c)脾臟中的foxp3頻率，並顯示foxp3+細胞和foxp3-細胞的絕對數量。所顯示的數據是兩個獨立實驗的其中一個。

圖10.pd-1h激動型mab輕微促進itreg細胞的分化。(a)從wtfoxp3(gfp)小鼠中分離初始t細胞，隨後在tgf-β存在下用對照小鼠igg或mam82用預包被的抗cd3刺激4天。通過流式細胞術分析cd25+foxp3(gfp+)itreg細胞。(b)顯示不同時間點誘導的itreg細胞。顯示的結果來自3個單獨的實驗。所顯示的數據代表至少3次獨立實驗。

圖11.在eae模型中用wt或pd-1hkoitreg細胞轉染後，受試者中cd4+th1和th17細胞的分析。(a)來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的初始t細胞如上所述在體外分化成itreg細胞。將ifn-γ和il-4中和mab加入到培養物中以促進itreg的產生。分離foxp3(gfp+)細胞，通過facs評估純度。(b，c)在轉移itreg細胞的eae模型中的受試者cd45.1+cd4+t細胞通過pma/離子黴素/bfa離體再刺激。通過門控cd45.2-cd4+t細胞，通過細胞內染色測定受試者cd4+t細胞的ifn-γ+或il-17+細胞。來自代表性的一對小鼠的數據顯示在(b)中，顯示的數據的曲線圖來自4或5隻小鼠的組(c)。所顯示的數據代表至少3次獨立實驗。

圖12.pd-1h缺乏的itreg細胞不能保留其抑制功能和foxp3表達。(a)單獨或與來自wt或ko小鼠的cd45.2+foxp3(gfp+)itreg細胞一起轉移cd25-cd45rbhicd45.1t細胞後不同時間的rag1ko宿主小鼠的重量(每組n＝5)(見方法)。轉移後受體小鼠的體重變化被標準化至其在轉移前的初始體重。*p<0.05，(雙向abova檢驗)。(b)誘導結腸炎後(第10周，n＝5)，rag1ko宿主小鼠的結腸組織h&e染色(標尺：100μm)和臨床評分(c)。(d，e，f)分析來自rag1ko宿主小鼠的脾臟和dln中cd45.2treg細胞中foxp3+t細胞的百分比，並根據比例和活細胞計數foxp3+cd45.2t細胞的絕對數量。(g)流式細胞術分析來自rag1ko小鼠的所示器官中cd45.2treg細胞中ifn-γ和il-17的表達。用pma/離子黴素/bfa在體外刺激脾細胞和dln細胞4小時，並染色以測定細胞內的細胞因子。(h)(g)中的數據總結，每個點代表一隻小鼠。(i)流式細胞術分析來自rag1ko宿主小鼠的所示器官中的teff細胞(cd45.1)中ifn-γ和il-17的表達。用pma/離子黴素/bfa在體外刺激脾細胞和dln細胞4小時，並染色以測定細胞內的細胞因子。顯示的數據代表2個獨立實驗中的其中一個。

具體實施方式

定義

在本發明中，術語「治療」是指療法上的以及預防性的措施，其阻止或減緩對象發生不期望的生理學改變或病症，例如哮喘發作或癌症進展。有利或期望的臨床效果包括，但不限於，症狀的緩解、疾病程度的降低、疾病狀態的穩定化(即不惡化)、疾病進展的延遲或減緩、疾病狀態的減輕或緩和以及疾病的部分或全部治癒，不論上述效果是否可檢測到。「治療」也可指與不治療相比生存期延長。需要治療的對象包括已患有該疾病或病症的對象，以及有可能患有該疾病或病症的對象，或要預防該疾病或病症的對象。

「對象」或「患者」、「個體」是指任何期望進行診斷、預後或治療的對象，特別是哺乳動物對象。哺乳動物包括人、家畜、農畜、動物園動物、競技動物或寵物，例如狗、貓、幾內亞豬、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。本文所稱的對象優選是人。

本文所用的術語「有治療需要的患者」或「有治療需要的對象」包括因施用本發明用於例如檢測、診斷和/或治療用途的多肽或其組合物而受益的對象，如哺乳動物對象。

本文所用的術語「激動劑」是指任何能夠增加pd-1h的水平和/或活性的試劑。例如，術語「激動劑」是指使能夠使pd-1h的表達和/或活性增加至少10％或更多(例如10％或更多、50％或更多、100％或更多、200％或更多、500％或更多、1000％或更多)的試劑。pd-1h的激動劑的非限制性例子可包括pd-1h多肽或其激動劑片段以及編碼pd-1h多肽的核酸。

如本文所用，術語「拮抗劑」是指降低pd-1h的水平和/或活性的任何試劑。拮抗劑是與特定蛋白(例如配體)競爭結合另一種蛋白質(例如受體)的化合物。這種結合通常誘導被競爭性拮抗劑阻斷的特異性生物反應或作用。拮抗劑具有親和力但對其同源結合蛋白沒有功效，並且結合將破壞相互作用並抑制這種同源蛋白的功能。拮抗劑通過結合至任何同源蛋白(或在適用情況下受體)上的活性(正位體＝正確的位置)位點或變構(＝其他位置)位點來調節其作用，或者它們可能在通常不涉及的獨特結合位點相互作用。

本發明使用反義低聚物和類似物質用於調節編碼pd-1h的核酸分子的功能或作用。這通過提供與編碼pd-1h的一種或多種核酸分子特異性雜交的寡核苷酸來實現。如本文所用，術語「靶核酸」和「編碼pd-1h的核酸分子」被用於方便地包括編碼pd-1h的dna、從該dna轉錄的rna(包括前mrna和mrna或其部分)，以及衍生自這些rna的cdna。本發明的低聚物與其靶核酸的雜交通常稱為「反義」。因此，被認為包括在本發明的一些優選實施方案中的優選機理在本文中稱為「反義抑制」。這種反義抑制通常基於寡核苷酸鏈或鏈段的基於氫鍵的雜交，使得至少一個鏈或鏈段被切割、降解或以其它方式不可操作。在這方面，目前優選靶向特異性核酸分子及其用於這種反義抑制的功能。在一些實施方案中，反義寡聚物選自dna寡核苷酸、rna寡核苷酸(例如microrna)和嵌合寡核苷酸。例如，反義寡聚物選自dsrna、sirna和shrna。

本發明的一個方面提供一種調節對象的誘導型調節性t細胞的細胞水平的方法，包括向有此需要的對象施用治療有效量的pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑或包含pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑的藥物組合物。本發明還提供上述pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑在調節對象的誘導型調節性t細胞的細胞水平的方法中的應用。

在一些實施方式中，該pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑或其藥物組合物以腸胃外方式給藥，例如靜脈內、肌內、經皮或皮內給藥。

在某些實施方案中，pd-1h激動劑的施用導致受試者中誘導型調節性t細胞水平的增加，例如itreg細胞的擴增。在某些實施方案中，施用pd-1h拮抗劑導致受試者中誘導型調節性t細胞水平降低。在一些實施方案中，itreg細胞的水平降低伴隨著th1和/或th17細胞的產生增加。

在某些實施方案中，本發明提供了用於治療或減輕t細胞免疫介導的疾病的方法。該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑或包含pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑的藥物組合物。本文使用的術語「t細胞免疫介導的疾病」是指與t細胞免疫相關的疾病或病症，包括炎症、自身免疫性疾病和癌症。

組合物

本發明的一個方面提供了包含治療有效量的pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑和藥學上可接受的載體的藥物組合物。藥物組合物可用於調節受試者中誘導型調節性t細胞的水平。pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑可以在合適的藥學上可接受的載體或賦形劑中製備。

本文使用的術語「載體」包括任何或所有的溶劑、分散介質、載體、包衣、稀釋劑、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑、吸附延緩劑、緩衝液、載體溶液、懸浮液、膠體等。這些用於藥物活性成分的介質和試劑的使用在本領域是已知的。除非已知任何常規介質或試劑不能與該活性成分配伍，否則本發明預期可在組合物中使用任何上述載體。

「藥學上可接受的」是指當施用至人體時不會產生過敏反應或類似的不期望的反應的分子和成分。本領域已知如何製備包含作為活性組分的蛋白的水性組合物。通常，這些組合物被製備成注射劑，例如液態溶液或懸浮液；也可以製備成適於在注射之前配製成溶液或懸浮液的固體形式。

實施例

材料和方法

小鼠：8周齡的c57bl/6(b6)小鼠購自中山大學動物供應中心。b6背景的pd-1h-ko小鼠已有報導。轉基因品系cd45.1、ot-ii、foxp3(gfp)、rag1ko均購自thejacksonlaboratory。pd-1hko和野生型(對照小鼠)的同窩小鼠由pd-1h雜合子產生並保持在相同的條件下。將foxp3(gfp)小鼠和ot-ii小鼠分別與pd-1hko小鼠回交，產生pd-1h缺陷型foxp3(gfp)報導小鼠和pd-1h缺陷型ot-ii小鼠。將小鼠保持在特定的無病原體設施中，所有動物實驗均按照「國家衛生研究院實驗動物護理和使用指南」進行，經中山大學科學調查委員會批准(廣東，中國)。

抗體、試劑盒和流式細胞術分析：對於小鼠pd-1h的細胞表面染色，使用mh5a(倉鼠抗小鼠pd-1h)，之後使用抗倉鼠igg-pe(ebioscience)；倉鼠igg(ebioscience)被用作同種型對照。pd-1h激動劑mab克隆mam82(小鼠抗小鼠igg1)已有描述。所有其他螢光標記的抗體包括cd4、cd25、cd44、cd69、foxp3、tcrvβ5.1/5.2、p-stat3、p-stat5、ctla-4、lag-3、gitr、iocs、cd45.1和cd45.2從ebioscience和bdpharmingen購買。對於中和試驗，從r&dsystem購買抗-ifn-γ(克隆xmg1.2)、抗il-4(克隆11b11)，抗il-6(克隆mp5-20f3)中和抗體。根據bd的cytofix/cytoperm試劑盒手冊進行foxp3和其他細胞內細胞因子的細胞內染色。使用小鼠th1/th2/th17cba試劑盒(bdbioscience)進行細胞因子分析。小鼠pan-t分離試劑盒、cd8+t細胞分離試劑盒、cd4+t細胞分離試劑盒、cd25微珠試劑盒和初始cd4+t細胞分離試劑盒購自miltenyibiotec(cambridge，ma)。使用bdfacsverse(bdbiosciences)進行流式細胞術分析，並使用flowjo軟體(treestar)分析數據。

細胞分選和純化：收集脾臟和ln的單細胞懸浮液，使用初始cd4+t細胞分離試劑盒(miltenyibiotec)分離初始的cd4+cd25-cd44locd62hit細胞。對於foxp3(gfp)敲入小鼠，在使用cd4+t細胞分離試劑盒純化後，通過facsaria(bdbiosciences)對cd4+cd25-foxp3(gfp)t細胞和cd4+cd25+foxp3(gfp+)t細胞進行分選。在所示的實驗中，使用cd4+t細胞分離試劑盒首先富集cd4+t細胞，然後使用cd25微珠試劑盒(miltenyibiotec)去除cd25+t細胞，得到cd4+cd25-t細胞。使用該方法分選的細胞的純度通常大於95％。

itreg細胞的體外轉化：使用結合至平板的抗cd3(克隆2c11，2μg/ml，ebioscience)和可溶性抗cd28(1μg/ml)在存在或不存在重組tgf-β(5ng/ml，r&dsystems)和il-2(5ng/ml，peprotech)的情況下在體外刺激分選的cd4+cd25-foxp3(gfp-)t細胞3-5天。然後通過流式細胞儀基於gfp的表達或foxp3的細胞內染色分析foxp3+treg細胞的轉化。在所示實驗中，在用抗cd3(1μg/ml)包被平板之後，將細胞在包被pd-1h激動劑mam82(10μg/ml)的平板中培養。對於細胞因子中和實驗，在培養開始時向孔中加入10μg/ml的il-4、il-6和ifn-γ的mab。在所示時間點收集培養的上清液進行細胞因子分析。

treg細胞的抑制試驗：按之前文獻所述方法進行treg細胞抑制功能試驗。簡言之，首先用1μmcfse(lifetechnologies)標記初始cd8+t細胞(在一些實驗中使用cd4+初始t細胞)，隨後在存在作為飼養細胞的1×105絲裂黴素c處理的同基因脾細胞的情況下以1×105共同培養細胞。在u底96孔板中以指定的比例向培養物加入或不加入treg細胞並培養72小時，隨後加入抗小鼠cd3(1μg/ml)以進行刺激。通過cfse稀釋法測定t細胞的增殖。在一些實驗中，向培養物中加入可溶性小鼠對照igg或pd-1h激動劑mam82(10μg/ml)。在這些情況下，飼養細胞是pd-1hko脾細胞。

口服耐受小鼠模型：根據公開的方案進行foxp3+itreg細胞的全新生成。簡言之，如前所述，從ot-ii小鼠(或pd-1hkoot-ii小鼠)中分離初始cd4+cd25-t細胞，並在過繼轉移前用5μmcfse標記。向wtb6小鼠靜脈內注射2×106個細胞。24小時後，將籠中飲用水連續5天替換為1.5％ova溶液(v級；sigma-aldrich)。在第6天，收集腸繫膜ln和pp，通過流式細胞術利用foxp3的細胞內染色測定tcr特異性foxp3+treg細胞。

骨髓嵌合體：將來自wt(cd45.1)和pd-1hko小鼠(cd45.2)的脛骨和股骨的骨髓以1:1的比例混合，並將總共1×107個細胞轉移到亞致死性輻射處理的(6gy)同源wt小鼠(cd45.1/cd45.2)。重構10周後分析所示器官。通過細胞內染色測定foxp3+細胞的頻率。

eae疾病模型：按文獻方法進行實驗性自身免疫性腦脊髓炎(eae)模型。簡言之，將7-8周齡雌性小鼠s.c.免疫在完全弗氏佐劑(difco)中的200μgmog35-55(lifetechnologies)。在免疫後第0天和第2天，給小鼠腹腔注射在500μlpbs中的400ng百日咳毒素(listbiologicallabs)。對於過繼轉移，在第0天，進行免疫前，靜脈注射1×106個wtfoxp3(gfp+)itreg細胞或pd-1hkofoxp3(gfp+)itreg細胞。wt小鼠靜脈注射相同體積的pbs(鹽水)作為對照。每天觀察小鼠，以0-5的等級確定臨床評分(盲法)：0＝健康；1＝拖尾；2＝拖尾和後肢無力；3＝後肢癱瘓；4＝所有後肢癱瘓和前肢無力；5＝垂死狀態。對於從eae小鼠獲得的細胞的間接體內分析，收集每組的脾和dln，並且用pma/離子黴素/bdgolgiplug再次刺激細胞懸浮液4小時。使用細胞內染色評估ifn-γ和il-17的水平，並通過facs(bdcytofix/cytoperm試劑盒)分析。

慢性結腸炎的t細胞轉移模型：簡言之，如上所述製備和分選來自wt和pd-1hko小鼠的foxp3+itreg細胞。通過腹膜內，將同源cd4+cd45rbhit細胞(cd45.1,4×105)和或不和2x105itreg細胞(cd45.2)一起共注射到rag1ko小鼠。每周稱重一次小鼠，10周後，收集結腸組織，用h&e進行組織染色。收集脾臟和mln細胞，並使用pma/離子黴素/bfa離體活化4小時，然後分析細胞因子產量。

dna甲基化分析：分離foxp3(gfp+)itreg細胞，用dneasyblood&tissuekit(qiagen)純化基因組dna。使用ezdna甲基化-金試劑盒(zymo研究)進行dna的亞硫酸氫鹽轉化。使用文獻報導的引物組擴增foxp3增強子的cns2區，並將t/a克隆到pmd18-t載體(clonetech)中。對每組10個插入的質粒進行純化和測序，並通過biqanalyzer2.0分析甲基化結果。

圖表和統計分析：圖形和數據分析是使用graphpad軟體生成。進行非配對studentt檢驗的統計學分析，p值小於0.05被認為是顯著的。圖中的誤差條表示標準誤差(se)。對於疾病進展，使用雙因素方差分析(*p97％foxp3+，圖11a)進行分選。濃度為1×106/小鼠的foxp3(gfp+)cd45.2+itreg細胞被靜脈內轉移到cd45.1+b6免疫前小鼠中，其中轉移的wtitreg的數目不足以阻止eae進展。然後用髓磷脂鹼性蛋白質免疫小鼠以誘導eae。在這種情況下，與對照相比，wtitreg細胞的轉移稍微延遲了疾病的發病。然而，pd-1hkoitreg細胞的轉移導致更嚴重的疾病(如臨床評分所示)，儘管在疾病高峰期沒有發現顯著差異(圖4a)。有趣的是，eae小鼠脊髓的h&e染色顯示kotreg轉移的小鼠和wttreg轉移的小鼠之間的淋巴細胞浸潤具有微小差異(數據未顯示)。然後我們分析了在疾病進展期間轉移的treg細胞中foxp3表達的穩定性。與wt小鼠的itreg相比，koitreg的foxp3頻率(gfp+)在脾臟和dln中都降低了50％以上(圖4b和4c)。此外，dln中kofoxp3+細胞的絕對數量與dln中的wtfoxp3+細胞相比顯著減少，儘管脾臟中foxp3+t細胞的數量相當(圖4c)。因此，我們的研究結果表明了pd-1h在維持itreg表型和功能方面的作用。

在treg向其他cd4+t細胞亞群的可轉換性方面，我們的研究結果表明了itreg向包括th1和th17在內的效應性t細胞亞群的轉化(在eae中被認為是致病性的)。為了驗證這種可能性，用pma/離子黴素在第13天刺激來自宿主小鼠的脾臟和dln細胞4小時，使用細胞內染色檢查cd45.2+cd4+門控細胞的gfp(foxp3表達的指標)、ifn-γ和il-17。與用wtitreg細胞轉移的小鼠相比，用pd-1hkoitreg細胞轉移的小鼠的脾臟和dln中觀察到轉化的th1樣細胞(ifn-γ+foxp3-)的比例適度增加(圖4e)。然而，在這兩組小鼠中，轉化的th1樣細胞ifn-γ+細胞的絕對數量沒有顯著差異(圖4e)，表明itreg向th1的轉化非常少。然而，大部分pd-1hkoitreg細胞(脾臟中16.7％、dln中6.1％)轉化為il-17+細胞，並且從wtitreg細胞到il-17+細胞的轉化非常少(在脾臟和dln中均少於2％)(圖4e和4f)。使用相同的策略，我們分析了受試者cd4+t細胞(門控cd45.1+)，其顯示與wt或pd-1hkoitreg細胞轉移的兩組小鼠中ifn-γ+和il-17+細胞的相當水平(圖11b和11c)。這些結果表明，pd-1h的損失促進了itreg在炎性環境中轉化為th17樣細胞。因此，pd-1hkoitreg細胞部分促進eae進展的作用(圖4a)可能是炎症環境中itreg轉化為th17的結果。

發明人還評估了pd-1hkotreg對慢性結腸炎t細胞轉移模型的影響。如上所述製備wt和kofoxp3(gfp+)treg(cd45.2)，分別與同種cd45.1teff(cd45rbhicd25-cd4+)混合，並且隨後轉移到rag1ko小鼠中。在這個實驗中，即使單獨轉移cd45rbhiteff，我們也沒有觀察到疾病進展期間明顯的體重減輕(圖12a)。然而，共轉移pd-1hkotreg/teff導致大量白細胞浸潤和結腸嚴重的組織損傷(通過h&e染色看出)，而wttreg/teff的共轉移顯示結腸組織沒有明顯的損傷(圖12b和12c)。為了確定pd-1hkotreg細胞減弱的抑制能力是否與foxp3表達的損失相關，我們評估了宿主rag1ko小鼠的脾臟和mln中的foxp3表達。與treg功能損失一致，與wttreg相比(脾臟17％，mln中為54％)，pd-1hkotreg中foxp3表達下調(脾臟11％，mln39％)(圖12d和12e)。然而，在pd-1hkotreg與wttreg共轉移小鼠之間，foxp3+t細胞的絕對數量沒有顯著差異(圖12f)。此外，用pd-1hkotreg轉移的小鼠(脾臟為30.7％，mln為14.9％)比用wttreg(脾臟為7％，mln為3.95％)轉移的小鼠具有顯著更多的ifn-γ+細胞(圖12g)。最後，pd-1hkotreg(脾臟為13.3％，mln為9.8％)轉移後比wttreg(脾臟3.64％，mln為4.44％)轉移後出現更多的il-17+t細胞(圖12g和12h)。在pd-1hkotreg/teff轉移和在wttreg/teff轉移之間未觀察到ifn-γ+和il-17+teff(cd45.1)在脾臟和mln中的差異(圖12i)。我們的研究結果表明，treg缺乏pd-1h導致treg快速轉化為其他可能促進炎症的效應cd4細胞。因此，pd-1h對於維持treg細胞在炎症下的抑制功能和foxp3的表達是必需的。

在pd-1hkoitreg細胞中stat3活性和foxp3增強子甲基化增加

stat5激活驅動treg譜系定型，而stat3抑制foxp3表達並促進th17細胞反應。為了檢查pd-1h的損失是否形成了treg細胞中的stat通路，我們分析了eae模型中stat-5和stat-3的激活。pd-1hkoitreg細胞(高達47％的p-stat3)在eae小鼠的脾和dln中比wtitreg細胞表達顯著更高水平的磷酸化stat-3(p-stat3)。然而，在wt和pd-1hkoitreg細胞中發現相當的p-stat5水平(圖5a和5b)，暗示stat3(而不是stat5)在pd-1h功能中的作用。

以前的研究表明，foxp3增強子的cns2(保守的非編碼dna序列2)區域的dna甲基化狀態對維持foxp3表達特別重要。我們在本發明中確定了pd-1hkoitreg細胞中cns2區域的甲基化。如圖5c所示，體外誘導的wtitreg顯示cns2區域的幾乎一半被去甲基化(平均為40.8％)。然而，pd-1hkoitreg細胞的去甲基化顯著減少(平均17.5％)，foxp3增強子cns2區域的超甲基化平均為82.5％。這一觀察結果解釋了pd-1hkoitreg細胞在foxp3表達方面的不穩定性。總之，我們的數據表明，pd-1h缺乏對treg的分化和表型穩定性具有顯著影響。

本發明的結果表明，pd-1h是一種關鍵的細胞表面信號分子，通過兩種不同的機制控制誘導性treg的細胞數量水平。第一，從初始t細胞產生itreg需要pd-1h。這種作用主要是通過抑制炎性細胞因子(如ifn-γ、il-4和il-17)介導的。結果，響應環境刺激的itreg的數量減少。儘管pd-1h不影響itreg在每個細胞水平的抑制功能，但itreg水平的減少可能最終會影響免疫反應期間treg的整體抑制功能。第二，pd-1h信號傳導阻止在炎症環境中將itreg轉化為th1和th17。這種作用可能是由於pd-1h對itreg細胞上的foxp3表達的直接調節作用導致的。通過促進itreg的產生和防止itreg轉化為th1和th17，pd-1h有助於在炎症期間保持恆定的itreg水平。據我們所知，這是描述pd-1h的調解機制和控制調節性t細胞的機制的第一次全面研究。

雖然pd-1h的共抑制功能已經在早期研究中得到證實，但這種作用所依賴的機制尚未闡明。wang及其同事表明，在tgf-β存在下，pd-1hig部分促進了itreg細胞的分化，這種作用可以在小鼠和人類cd4+t細胞中發現。此外，pd-1h的單克隆抗體降低腫瘤抗原特異性itreg細胞在體內的分化。在這些研究中，pd-1h被認為是一種配體，它與treg上的一個尚未鑑別的抑制性受體結合，以調節這種作用。我們使用pd-1h缺陷小鼠和pd-1h激動劑mab的結果顯示pd-1h作為t細胞上的共抑制受體。還應注意，pd-1h在抑制免疫應答中的作用可能更複雜，並且可以通過多於一種單一機制起作用。我們最近的研究表明，pd-1h介導的對同種異體抗原的t細胞耐受性的抑制是由兩種不同的機制介導的：早期阻止細胞增殖和晚期誘導treg以維持移植物耐受性。在本發明中，我們揭示了pd-1h在控制treg細胞數量水平中的關鍵作用，這可能有助於誘導t細胞反應的長期耐受

pd-1h對treg的影響是一個高度選擇性的事件。雖然pd-1h對於從初始t細胞產生itreg是必不可少的，但ntreg和itreg的抑制功能不受影響。特別是pd-1h對於通過自身抗原選擇的、胸腺來源的ntreg細胞的產生和抑制功能不是必需的(圖8)。這個結果可能部分解釋了為什麼在年幼pd-1hko小鼠中沒有觀察到自發性自身免疫疾病或淋巴組織增生症狀。然而，在初始小鼠中自發產生的itreg細胞明顯受到影響(圖2a)，這在先前在tgf-β和視黃酸存在下在活化的cd4+t細胞中觀察到過，並且該群體主要積聚在腸和皮膚中黏膜。

儘管發現foxp3+itreg細胞的頻率在腸內降低，特別是在pd-1hko小鼠的lp中，但lp中foxp3+itreg的絕對數量沒有變化(圖2a)。這可能部分解釋了為什麼pd-1hko小鼠不會在腸道中發展自發性致病性疾病。我們還在pd-1hko小鼠驗證了這個結論，該小鼠與foxp3(gfp)小鼠(gfp表達在foxp3啟動子控制下)交配而產生pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠(數據未顯示)。使用口服耐受模型進一步證實了這些發現，如前所述，該模型用於在體內從體內產生全新itreg細胞。與pd-1hko小鼠的腸道中的發現一致，pd-1h缺乏導致在mln和pp中抗原特異性foxp3+itreg細胞的全新生成受損(圖1a和1b)。此外，初始cd4+t細胞在tgf-β存在下體外轉化為itreg細胞進一步證明pd-1h缺乏可減少itreg細胞的分化(圖2c)。最後，與wtitreg細胞相比，itreg細胞的pd-1h缺乏表現出相似的抑制功能，儘管treg/teff比值較高時可以發現微小的差異(圖2d和2e)。此外，我們發現在淋巴細胞環境中，cd4+t細胞上pd-1h的損失導致平衡增殖後外周器官中foxp3+treg數量的減少，同時產生大量的促炎細胞，這進一步阻礙了treg的體內分化(圖7)。在骨髓嵌合小鼠中也發現了類似的發現，造血來源的細胞上的pd-1h的損失導致骨髓細胞(如嗜中性粒細胞、巨噬細胞)(數據未顯示)的更高的恢復，因此促炎細胞因子的產生可能阻礙外周treg細胞的數量水平(圖9)。因此，我們的研究結果支持pd-1h在產生itreg方面的高度選擇性作用。

treg不是終末分化的，並且itreg可以通過特異性細胞因子或炎症環境轉化成th1或th17亞類。treg細胞的這種可塑性使得在慢性炎症期間難以研發出治療策略。本發明表明，pd-1h對於treg譜系的標誌物foxp3的穩定性是必需的，並保持了treg的表型。pd-1h的損失導致各種體外和體內系統和模型中itreg的快速降低。我們的研究表明，在缺乏pd-1h的情況下，itreg細胞易於在炎症狀態下重編程成為th17細胞，這可能解釋了pd-1hkoitreg的轉移不是抑制而是促進eae疾病的觀察結果。在這個模型中，itreg主要轉化為th17，很少轉化為th1。pd-1h也可能影響itreg向th1的轉化，因為在不存在pd-1h的情況下，在cd4+t細胞中檢測到高水平的ifn-γ。有意思的是，我們的研究結果表明il-4水平也顯著增加，這些數據暗示pd-1h在控制th2中的可能作用。pd-1h在itreg向其他t細胞亞群的調節和轉化中的作用尚待闡明。

總之，本發明支持pd-1h在炎性環境中抑制itreg細胞轉化為th1和th17細胞，至少部分是由於其在維持foxp3表達和itreg表型中的作用。這些發現對調節treg生長和功能具有重要意義。同時，如先前所示，pd-1h抑制初始t細胞的激活以限制t細胞介導的免疫應答的啟動，它促進免疫應答期間itreg的生長和轉化。除了調節早期t細胞活化外，pd-1h似乎通過調節treg細胞數量水平參與t細胞耐受性的調節。因此，pd-1h途徑可能一種是在炎症、自身免疫疾病和癌症中控制和操縱t細胞介導的免疫方面有希望的靶標。

本發明雖然已針對具體實施方式做詳細的描述，但應當理解的是，本領域技術人員可在所公開的實施例的基礎上對本發明做出修改和改進而不違背本發明的精神，而這些改進和修改仍屬於本發明的範圍。