抗sars冠狀病毒細胞疫苗及應用的製作方法

2023-05-15 18:10:56

專利名稱：抗sars冠狀病毒細胞疫苗及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及預防和治療由SARS冠狀病毒引起的非典型性肺炎疫苗的領域，尤其涉及表達SARS冠狀病毒S及5個特異性蛋白的細胞疫苗。還涉及該疫苗在抗SARS冠狀病毒中的用途。
背景技術：
嚴重急性呼吸症候群(SARS)作為新興的烈性傳染病在國內蔓延，有效的預防、治療SARS是目前國家最重要的任務，而目前尚未發現十分有效的治療藥物，因此，有效的預防和治療SARS已迫在眉睫。
在預防以及治療方面，疫苗製備是最具前景的方法之一，該方法包括如下幾種技術減毒或滅活病毒體、基因工程重組疫苗、多肽疫苗和DNA疫苗等。治療性疫苗除了誘導機體產生特異性抗體之外，還能促進T細胞對病毒的殺滅作用。因此在SARS相關冠病毒序列明確之後，可以針對性選取各方案設計預防性疫苗和治療性疫苗。
國內外對SARS病毒疫苗研製所採用的方法大致分為減毒或滅活活疫苗、基因工程蛋白質或多肽疫苗和DNA疫苗。雖然減毒或滅活活疫苗的製備是經典的製備疫苗的方法，但由於其所需條件高，周期長，而且有毒力恢復的潛在可能性，具有非常大的危險性；基因工程蛋白質或多肽疫苗是將SARS冠狀病毒的部分抗原基因在酵母、大腸桿菌等細胞內表達，得到的蛋白質經過純化後作為疫苗。但由於得不到正確的翻譯後加工和半衰期短的缺點，使用該蛋白質製成的疫苗抗原性往往較差，不能使機體產生良好的保護性免疫反應；而DNA疫苗製備簡單，周期短，隨著SARS病毒基因組全序列的公布，使製備DNA疫苗成為可能，上海對外宣稱的不久將問世的SARS疫苗就是DNA疫苗，雖然DNA疫苗有很多的優點，但其安全性仍然是公認的隱患，尤其對有高度變異傾向的SARS病毒，其安全性更值得考慮。
本發明的細胞疫苗是通過分子生物學的方法，將SARS冠狀病毒基因組中S及5個特有的cDNA序列克隆到真核表達載體上，將製備好的含不同cDNA序列的重組真核表達載體在體外分別感染靶細胞，將感染後的靶細胞培養2～3天，以便讓靶細胞表達SARS冠狀病毒所特有的各相應蛋白，並通過這些靶細胞的內源性(MHCI)及外源性(MHCII)抗原遞呈途徑對SARS冠狀病毒所特有的各相應蛋白進行處理，使其能夠被T細胞直接識別，並遞呈到細胞膜表面。再滅活細胞並保持其完全的抗原性。與其他方法比較，抗SARS細胞疫苗同時具備快速、安全、有效誘導宿主免疫保護反應的優點。
所述5個特有的cDNA序列均來源於Genebank中，ACCESSIONAY278489GI31416290，具有唯一性和權威性。其中a.原始序列信息見Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290其編碼的蛋白為BGI-PUP1蛋白idAAP51228.1，cDNA片段為1 atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt61 gacaatgctt ctcctgcaag tactgttcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca121 ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc181 aaaataattg cgctcaataa aagatggcag ctagcccttt ataagggctt ccagttcatt241 tgcaatttac tgctgctatt tgttaccatc tattcacatc ttttgcttgt cgctgcaggt301 atggaggcgc aatttttgta cctctatgcc ttgatatatt ttctacaatg catcaacgca361 tgtagaatta ttatgagatg ttggctttgt tggaagtgca aatccaagaa cccattactt
421 tatgatgcca actactttgt ttgctggcac acacataact atgactactg tataccatat481 aacagtgtca cagatacaat tgtcgttact gaaggtgacg gcatttcaac accaaaactc541 aaagaagact accaaattgg tggttattct gaggataggc actcaggtgt taaagactat601 gtcgttgtac atggctattt caccgaagtt tactaccagc ttgagtctac acaaattact661 acagacactg gtattgaaaa tgctacattc ttcatcttta acaagcttgt taaagaccca721 ccgaatgtgc aaatacacac aatcgacggc tcttcaggag ttgctaatcc agcaatggat781 ccaatttatg atgagccgac gacgactact agcgtgcctt tgtaab.原始序列信息見Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290其編碼的蛋白為BGI-PUP2蛋白idAAP51229.1，cDNA片段為1 atgatgccaa ctactttgtt tgctggcaca cacataacta tgactactgt ataccatata61 acagtgtcac agatacaatt gtcgttactg aaggtgacgg catttcaaca ccaaaactca121 aagaagacta ccaaattggt ggttattctg aggataggca ctcaggtgtt aaagactatg181 tcgttgtaca tggctatttc accgaagttt actaccagct tgagtctaca caaattacta241 cagacactgg tattgaaaat gctacattct tcatctttaa caagcttgtt aaagacccac301 cgaatgtgca aatacacaca atcgacggct cttcaggagt tgctaatcca gcaatggatc361 caatttatga tgagccgacg acgactacta gcgtgccttt gtaagcacaa gaaagtgagt421 acgaacttat gtactcattc gtttcggaag aaacaggtac gttaac.原始序列信息見Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290其編碼的蛋白為BGI-PUP3蛋白idAAP51232.1，cDNA片段為1 atgtttcatc ttgttgactt ccaggttaca atagcagaga tattgattat cattatgagg61 actttcagga ttgctatttg gaatcttgac gttataataa gttcaatagt gagacaatta121 tttaagcctc taactaagaa gaattattcg gagttagatg atgaagaacc tatggagtta181 gattatccat aad.原始序列信息見Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290，其編碼的蛋白為BGI-PUP4蛋白idAAP51233.1，cDNA片段為
1 atgaaaatta ttctcttcct gacattgatt gtatttacat cttgcgagct atatcactat61 caggagtgtg ttagaggtac gactgtacta ctaaaagaac cttgcccatc aggaacatac121 gagggcaatt caccatttca ccctcttgct gacaataaat ttgcactaac ttgcactagc181 acacactttg cttttgcttg tgctgacggt actcgacata cctatcagct gcgtgcaaga241 tcagtttcac caaaactttt catcagacaa gaggaggttc aacaagagct ctactcgcca301 ctttttctca ttgttgctgc tctagtattt ttaatacttt gcttcaccat taagagaaag361 acagaatgae.原始序列信息見Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290其編碼的蛋白為BGI-PUP7蛋白idAAP51235.1，cDNA片段為1 atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga cccacagatt61 caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag cgccgacccc121 aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat ggcaaggagg181 aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt ccagatgacc241 aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc aaaatga發明內容本發明的目的在於提供一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，該疫苗安全穩定，能夠方便地運輸儲存，可同時引起人體對SARS冠狀病毒體液免疫和細胞免疫。
本發明的另一個目的在於提供一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗在預防和治療非典型性肺炎中的應用。
本發明中的細胞疫苗是通過分子生物學的方法，將SARS冠狀病毒基因組中S及5個特有的cDNA序列克隆到真核表達載體上，將製備好的含不同cDNA序列的重組真核表達載體在體外分別感染異種抗原遞呈靶細胞，將感染後的靶細胞培養2～3天，以便讓異種抗原遞呈靶細胞表達SARS冠狀病毒所特有的各相應蛋白，並通過這些靶細胞的內源性(MHCI)及外源性(MHCII)抗原遞呈途徑對SARS冠狀病毒所特有的各相應蛋白進行處理，使其能夠被T細胞直接識別，並遞呈到細胞膜表面。再滅活細胞並保持其完全的抗原性。
與其他方法比較，抗SARS細胞疫苗同時具備快速、安全、有效誘導宿主免疫保護反應的優點。
本發明提供的技術方案實施步驟為1.根據SARS冠狀病毒的基因組序列分析結果，找到SARS基因組中所特有的5個cDNA序列，它們是冠狀病毒所特有的，可能也是SARS發病機制和傳染能力異於其他冠狀病毒的物質基礎之一。因此，首先進行全基因合成這些cDNA序列。
根據其他冠狀病毒的研究結果，位於病毒表面的輻條樣蛋白(S蛋白)是病毒的主要中和性抗原，核衣殼蛋白(N蛋白)和膜蛋白(M蛋白)也可以誘導免疫效應，因此S蛋白及M、N蛋白均可應用於抗SARS冠狀病毒疫苗研究。因此，也可使用編碼SARS冠狀病毒S蛋白及M、N蛋白的cDNA製備本發明的抗SARS冠狀病毒細胞疫苗。
2.構建SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的真核表達載體。
a、用腺病毒表達載體b、使用逆轉錄病毒載體c、使用真核表達質粒3.將構建好的SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的真核表達載體導入異種抗原遞呈靶細胞中，使異種抗原遞呈靶細胞表達相應SARS冠狀病毒蛋白。
a、導入方式
i.病毒載體通過感染方式使靶細胞表達相應SARS冠狀病毒蛋白。
ii.真核表達質粒通過電轉或脂質體轉染靶細胞，使其表達相應SARS冠狀病毒蛋白。
b、靶細胞的選擇B細胞具有強大的抗原處理遞呈功能和能大規模培養，是抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗理想的靶細胞。
4.滅活表達相應SARS冠狀病毒蛋白的靶細胞，並保持其抗原性。
i.物理方法 通過γ射線滅活固定靶細胞。
ii.化學方法 通過多聚甲醛或福馬林液固定滅活靶細胞。
5.將d步所得到的滅活靶細胞充分洗滌去除其他抗原成分後，加入到合適的製劑中，如生理鹽水，調節細胞濃度，範圍為105～107細胞/ml，即可得到抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗。
與其他方法製備的抗SARS冠狀病毒疫苗相比，本發明中的細胞疫苗具有以下優點①簡單快速隨著SARS病毒基因組全序列的公布，以及SARS冠狀病毒基因組中5個特有的cDNA序列的確認，使製備相應細胞疫苗成為可能，而細胞疫苗的製備所需的全過程不超過1個月，因此，在目前這種緊迫的環境下，細胞疫苗有其優勢；而目前認為SARS冠狀病毒是一類容易產生變異的病毒，快速有效的針對變異病毒製備疫苗也是細胞疫苗的優勢之一；在對SARS冠狀病毒了解不多的前提下，將其基因組中5個特有的cDNA序列製備細胞疫苗而不必分析是其中那一段是引起免疫反應的主要因素，這樣減少了篩選過程，加速了疫苗的製備過程。
②更加安全在對SARS冠狀病毒了解不多的前提下，疫苗的安全性是極其重要的。細胞疫苗的製備只需要知道病毒基因組，而不必直接接觸病毒，減少了由實驗室途徑傳播病毒的危險性；通過甲醛滅活後，細胞疫苗不帶有活性蛋白和活性核酸物質，以及不帶有全長的病毒基因組，從而極大地避免促使病毒變異、病毒回復的危險，增加了細胞疫苗的可靠性；③更加有效B細胞是專業的抗原遞呈細胞，有強大的抗原處理遞呈能力，重組腺病毒載體在B細胞內大量表達SARS冠狀病毒所特有的各相應蛋白，由於T細胞不能夠識別這些蛋白，必須通過B細胞的內源性(MHCI)及外源性(MHCII)抗原遞呈途徑對這些蛋白進行處理並表達在膜上，才能使其能夠被T細胞識別，這樣，經甲醛滅活細胞並保持完全的抗原性細胞疫苗不但可以誘導機體產生特異性抗體，還能促進T細胞對細胞內病毒的殺滅作用。因此，該細胞疫苗不但作為預防性疫苗有效，還可作為治療性疫苗。
由於B細胞是專業的抗原遞呈細胞，其本身高表達的免疫共刺激分子能夠加強機體對疫苗的免疫反應，使疫苗更加有效。


本發明由如下附圖附圖1為細胞疫苗直接刺激T淋巴細胞增值的比較柱狀圖；附圖2為免疫後小鼠T淋巴細胞對表達PUP1-5基因片段的正常血管內皮細胞殺傷活性(％)柱狀圖；
附圖3為流式細胞儀檢測抗體結果圖。
具體實施例1.全基因合成SARS基因組中所特有的5個cDNA序列，它們是冠狀病毒所特有的，可能也是SARS發病機制和傳染能力異於其他冠狀病毒的物質基礎之一。
a.1 atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt61 gacaatgctt ctcctgcaag tactgttcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca121 ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc181 aaaataattg cgctcaataa aagatggcag ctagcccttt ataagggctt ccagttcatt241 tgcaatttac tgctgctatt tgttaccatc tattcacatc ttttgcttgt cgctgcaggt301 atggaggcgc aatttttgta cctctatgcc ttgatatatt ttctacaatg catcaacgca361 tgtagaatta ttatgagatg ttggctttgt tggaagtgca aatccaagaa cccattactt421 tatgatgcca actactttgt ttgctggcac acacataact atgactactg tataccatat481 aacagtgtca cagatacaat tgtcgttact gaaggtgacg gcatttcaac accaaaactc541 aaagaagact accaaattgg tggttattct gaggataggc actcaggtgt taaagactat601 gtcgttgtac atggctattt caccgaagtt tactaccagc ttgagtctac acaaattact661 acagacactg gtattgaaaa tgctacattc ttcatcttta acaagcttgt taaagaccca721 ccgaatgtgc aaatacacac aatcgacggc tcttcaggag ttgctaatcc agcaatggat781 ccaatttatg atgagccgac gacgactact agcgtgcctt tgtaab.1 atgatgccaa ctactttgtt tgctggcaca cacataacta tgactactgt ataccatata61 acagtgtcac agatacaatt gtcgttactg aaggtgacgg catttcaaca ccaaaactca
121 aagaagacta ccaaattggt ggttattctg aggataggca ctcaggtgtt aaagactatg181 tcgttgtaca tggctatttc accgaagttt actaccagct tgagtctaca caaattacta241 cagacactgg tattgaaaat gctacattct tcatctttaa caagcttgtt aaagacccac301 cgaatgtgca aatacacaca atcgacggct cttcaggagt tgctaatcca gcaatggatc361 caatttatga tgagccgacg acgactacta gcgtgccttt gtaagcacaa gaaagtgagt421 acgaacttat gtactcattc gtttcggaag aaacaggtac gttaac.1 atgtttcatc ttgttgactt ccaggttaca atagcagaga tattgattat cattatgagg61 actttcagga ttgctatttg gaatcttgac gttataataa gttcaatagt gagacaatta121 tttaagcctc taactaagaa gaattattcg gagttagatg atgaagaacc tatggagtta181 gattatccat aad.1 atgaaaatta ttctcttcct gacattgatt gtatttacat cttgcgagct atatcactat61 caggagtgtg ttagaggtac gactgtacta ctaaaagaac cttgcccatc aggaacatac121 gagggcaatt caccatttca ccctcttgct gacaataaat ttgcactaac ttgcactagc181 acacactttg cttttgcttg tgctgacggt actcgacata cctatcagct gcgtgcaaga241 tcagtttcac caaaactttt catcagacaa gaggaggttc aacaagagct ctactcgcca301 ctttttctca ttgttgctgc tctagtattt ttaatacttt gcttcaccat taagagaaag361 acagaatgae.1 atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga cccacagatt61 caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag cgccgacccc
121 aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat ggcaaggagg181 aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt ccagatgacc241 aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc aaaatga根據其他冠狀病毒的研究結果，位於病毒表面的輻條樣蛋白(S蛋白)是病毒的主要中和性抗原，核衣殼蛋白(N蛋白)和膜蛋白(M蛋白)也可以誘導免疫效應，因此S蛋白及M、N蛋白均可應用於抗SARS冠狀病毒疫苗研究。因此，編碼SARS冠狀病毒S蛋白及M、N蛋白的cDNA製備也可應用於本發明的抗SARS冠狀病毒細胞疫苗。
全基因合成SARS基因組cDNA序列整合於pUC18質粒的SmaI位點上。
2.構建SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的真核表達載體。
本發明中的真核表達載體主要作用是能夠使上述步驟1目標基因穩定地導入靶細胞中並穩定表達蛋白。本發明的抗SARS冠狀病毒細胞疫苗可以使用腺病毒表達載體、逆轉錄病毒載體、和一般的真核表達質粒來製備。
(1)、使用腺病毒表達載體含有目標基因的pUC18質粒和腺病毒穿梭質粒pShuttle-CMV經Kpn I及Xho I雙酶切，0.8％瓊脂糖電泳膠回收穫得約9.2kb的載體DNA和相應長度的目標基因。目的基因與載體DNA在16℃下經DNA快速連接酶連接17h，連接產物轉化新鮮感受態大腸桿菌DH5α，接種卡那黴素LB平板培養16h，挑取陽性克隆擴增培養，用小量質粒提取試劑盒按說明書提取並純化pAdTrack-sCD40LIg質粒，獲得重組穿梭質粒。
分別對重組穿梭質粒酶切鑑定正確後，將正確重組的穿梭質粒用Pme I酶切線性化，轉化含腺病毒骨架質粒的感受態pAdEasy-1-BJ5183細菌。卡那黴素選擇培養基和PCR篩選陽性克隆，擴增培養，提純質粒。用Pac I酶切重組質粒，0.5％瓊脂糖凝膠電泳鑑定，酶切後產生約30kb和4.5kb左右的兩條帶。鑑定成功的重組子轉化超感受態XL10-Gold菌，篩選陽性克隆並提取純化，得到重組腺病毒基因組質粒。
重組腺病毒基因組質粒轉染293細胞重組腺病毒基因組質粒用Pac I酶切線性化，回收約30kb的大片段8μg，以無抗生素無血清的L-DMEM稀釋為250μL；取LipofectamineTM2000脂質體10μL，無抗生素無血清的L-DMEM稀釋為250μL，室溫下放置5min後同前回收稀釋的DNA混合，室溫下放置20min，加入6孔培養板中的293包裝細胞，輕輕混勻，37℃，5％CO2培養箱中孵育，13天後便可觀察到細胞病變效應(cytopathiceffectCPE)。收集完全病變培養孔中的細胞及培養液，-20℃和37℃反覆凍融3次，上清加入293細胞中繼續感染。收集病變的293細胞及培養液，按上述方法反覆凍融3次，離心，上清加入1mg蛋白酶K、2mL1％SDS、10mmol/L EDTA和20mmol/LTris-HCl消化2h。離心取上清，酚氯仿抽提，無水乙醇沉澱，獲得病毒的DNA，以此為模板進行PCR鑑定。
鑑定正確後獲得含有SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的腺病毒表達載體(2)使用逆轉錄病毒表達載體分別提取酶切含有目標基因的pUC18質粒和pLXSN表達載體質粒DNA，經XhoI、StuI雙酶切後，瓊脂糖凝膠電泳分別回收5.7Kb pLXSN載體片段和相應長度的目標基因片段，以載體∶插入片段為1∶3的摩爾比按DNA快速連接試劑盒說明連接，轉化冷凍保存的JM109感受態菌，挑選陽性轉化克隆，擴增，提取質粒，XhoI、StuI雙酶切鑑定重組子。
PA317細胞培養於含10％NCS的DMEM培養基中，37℃，5％CO2培養，胰酶/EDTA消化傳代。取生長狀態良好、增殖活躍的PA317細胞胰酶/EDTA常規消化，計數，以1×105細胞/孔接種6孔塑料培養板，37℃，5％CO2培養24h後(約70％匯合)，無血清DMEM洗3次去除殘餘血清，然後加入無血清DMEM，37℃，5％CO2 20min；另取DNA/脂質體比例為1ug/1μl的DOSPER和pLXSN-CTLA4Ig-IRES2-EGFP DNA加入HBS中，以100μl/孔的量製備DNA-DOSPER混合液，室溫放置15min，緩慢滴加至細胞中，培養6h，DMEM徹底洗去DOSPER，繼續培養24h後，常規消化傳代，以不同稀釋比例接種於9cm培養皿或培養瓶中，加入G418(500ug/ml)，隔天換液，洗去死細胞，12-14天後待抗性克隆長出，在顯微鏡下標記出生長良好的G418抗性克隆，以克隆環蘸取少許凡士林分隔細胞克隆，向克隆環中加入消化液消化細胞，轉入24孔板內培養，然後轉入培養瓶中擴增。
分別收穫轉基因PA317細胞和對照細胞，按107/ml加入異硫氰酸胍變性液，勻漿，轉移至15ml離心管中，加入1∶10體積10mol/L乙酸鈉溶液，充分混勻，再加1.2倍體積的飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)溶液，顛倒充分混合，振蕩10sec，於冰上靜置15min，離心12000rpm/10min(4℃)取上清入另一離心管，加入等體積的異丙醇，混勻，於-20℃放置1hr以上，離心12000rpm/20min(4℃)沉澱RNA，加入原體積的1/10變性液，旋轉搖動充分溶解，加入等體積的異丙醇，混勻，-20℃放置1hr以上，離心12000rpm/20min(4℃)所得RNA沉澱用75％冷乙醇洗滌兩次(注意勿打散沉澱物)，同上離心，真空抽乾，溶於適量無RNase的去離子水中，紫外分光光度計測RNA含量和純度。
RNA濃度(ug/μl)＝OD260×核酸稀釋倍數×40/1000RNA純度OD260/OD280不小於1.8-2.0，低於此值則重新抽提，-20℃短期保存。反轉錄合成DNA反應條件；25℃×10min→42℃×60min→99℃×5min→4℃×5min以反轉錄產物為模板進行PCR鑑定。
鑑定正確後獲得含有SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的逆轉錄病毒表達載體(3)一般的真核表達質粒分別提取酶切含有目標基因的pUC18質粒和真核表達載體質粒pDNA3.1，經EcoRI、BamHI雙酶切後，瓊脂糖凝膠電泳分別回收pDNA3.1載體片段和相應長度的目標基因片段後，以載體∶插入片段為1∶3的摩爾比按DNA快速連接試劑盒說明連接，轉化冷凍保存的JM109感受態菌，挑選陽性轉化克隆，擴增，提取質粒，EcoRI、BamHI雙酶切鑑定重組子。
鑑定正確後獲得含有SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的真核表達載體3.將構建好的SARS冠狀病毒所特有的cDNA序列的真核表達載體導入豬B細胞中，使豬B細胞表達相應SARS冠狀病毒蛋白。
(1)、一般的真核表達質粒提取含有目標基因的真核表達載體質粒pDNA3.1並經酶切鑑定、DNA濃度和純度鑑定後備用。將豬B細胞於10％熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養基培養。在DOTAP轉染前1天傳代於6孔板中，接種密度為1.5×105/ml。
①脂質體轉染方法取6μg含有目標基因的真核表達載體質粒pDNA3.1入無菌EP管①中，HBS液稀釋至60μl(DNA濃度為0.1μg/μl)；取36μl DOTAP液入另一EP管②中，HBS液稀釋至120μl；將①和②輕柔混合後室溫孵育15min；然後與6ml培養基混合備用。離心去除所有培養基，每孔中加入1ml轉染液進行轉染，6h後更換培養基繼續培養。
②NucleofectorTM轉染方法離心收集豬B細胞，細胞數為106，選擇針對B細胞的轉染液100μl重懸細胞，加入2μg含有目標基因的真核表達載體質粒pDNA3.1混合後移入Amaxa特製小杯；然後將小杯放入NucleofectorTM轉染儀中，選擇B細胞轉染程序電轉3s，取出小杯用500μl培養基衝洗後移入6孔板的一孔中培養。
通過RT-PCR鑑定目的基因在豬B細胞中的表達。
(2)、腺病毒表達載體步驟2所述重組腺病毒經293細胞大量擴增和氯化銫梯度離心濃縮純化後，病毒滴度可達到1010-1011pfu，通過空斑形成實驗檢測確切的病毒滴度後，以MOI 50的濃度感染豬B細胞，感染率大於80％。繼續培養3天後，可通過RT-PCR鑑定目的基因在豬B細胞中的表達。
(3)、逆轉錄病毒表達載體步驟2所述重組腺病毒經PA317細胞大量擴增，將多聚賴氨酸加入過濾後的病毒上清後離心2h以濃縮病毒，病毒滴度可達到106-107pfu，通過空斑形成實驗檢測確切的病毒滴度後，將豬B細胞接種於培養瓶，加入濃縮病毒100μl、polybrene(聚凝胺)1.6μl，培養3h後續加培養液，繼續培養24h後加入G418培養液選擇培養，3天後純化豬B細胞，可通過RT-PCR鑑定目的基因在豬B細胞中的表達。
4.滅活表達相應SARS冠狀病毒蛋白的異種抗原遞呈靶細胞(豬B細胞)，並保持其抗原性。
(1)、物理方法大量收集步驟3獲得的表達相應SARS冠狀病毒蛋白的豬B細胞，用磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌3次，細胞沉澱通過6000radγ射線滅活固定表達相應SARS冠狀病毒蛋白的豬B細胞。用0.9％的生理鹽水製備細胞懸液，濃度為2×106/ml。既製備出抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗。
ii.化學方法大量收集步驟3獲得的表達相應SARS冠狀病毒蛋白的豬B細胞，用磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌3次，細胞沉澱加入1～3％多聚甲醛或1～10％甲醛固定，於4℃冰箱內作用24小時，用PBS洗滌後，加入PBS液製成細胞懸液，於4℃冰箱內放置24小時，再用PBS液洗滌，以除去固定液，用血細胞記數板記數細胞後，用0.9％的生理鹽水製備細胞懸液，濃度為5×106/ml。既製備出抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗。
實例2混合淋巴細胞培養實驗檢測抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗直接激活人T淋巴細胞抽取健康人外周血20ml，肝素抗凝，無菌下將血置於50ml的塑料離心管中，加入等體積的0.01MPBS稀釋，另外於兩個50ml的塑料管中加入20ml淋巴細胞分離液，輕輕將上述20ml稀釋全血加入淋巴細胞分離液上，保持淋巴細胞分離液與血樣品之間界面清晰，2500rpm離心30min，取出離心管，輕輕吸出界限清晰的白膜層於另一塑料管中，予以0.01MPBS，1500rpm離心7min洗滌淋巴細胞，反覆洗滌4次，至洗滌液清亮為至，再加入Hanks液懸浮細胞，1000rpm，離心5min，洗滌細胞2次，即獲得單個核細胞。把單個核細胞加入培養瓶，37℃，5％CO2孵箱培養3小時，然後輕輕衝吸培養基(含非貼壁細胞)1000rpm，離心5min，以含10％小牛血清的RPMI1640培養基懸浮並調整細胞濃度為1×107/ml。取1ml細胞懸液裝入經預處理後尼龍毛柱，關閉閥門；37℃、5％CO2孵育1小時。然後用20ml預溫37℃的含20％小牛血清的RPMI1640培養基洗柱，流速1滴/秒(洗脫液中富含T淋巴細胞)。收集最初流出的5ml洗脫液即為富含T淋巴細胞的懸液。以a-醋酸萘酯酶染色法鑑定分離T淋巴細胞懸液純度。常規臺盼藍染色法檢測分離T淋巴細胞存活率。
用RPMI 1640完全培養基懸浮抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗、人T淋巴細胞，並調整兩種細胞濃度為1×107/ml。在96孔板上，抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗和人T淋巴細胞分別以1×105/孔，5×105/孔加入，每實驗組3個復孔。另設陰性對照組，加5×105人T淋巴細胞和1×105豬血管內皮細胞；空白對照組，加5×105人T淋巴細胞。終體積為200μl，不足者以培養基補足。37℃，5％CO2、飽和溼度條件，培養96小時。培養結束前18小時加0.5uCi/孔3H-TdR。用細胞收集器將細胞收集於玻璃纖微濾紙上，蒸餾水反覆衝洗，80℃烘乾。液閃計數CPM值，結果用3孔平均值表示。
結果見圖1結果表明抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗能夠直接激活人T淋巴細胞。
實例3免疫後小鼠T淋巴細胞對表達SARS基因片段的正常細胞殺傷活性檢測將6～8周齡、雄性BALB/C小鼠隨機分為實驗組和對照組(每組十隻)，實驗組小鼠每隻腹腔內注射200ul(含有1×106)抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，同時對照組小鼠每隻腹腔內注射200ul0.9％的生理鹽水，每周一次，共4次。收集抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗免疫後的小鼠T淋巴細胞作為效應細胞，用1640培養液洗滌2遍，計數，調整細胞濃度為1×106/ml。SARS基因片段重組腺病毒感染的正常人原代培養血管內皮細胞作為靶細胞，調整細胞濃度為1×105/ml。效應細胞做3個復孔，每孔100ul，加入96孔U型板中，並按照效靶比10∶1加入靶細胞，200ul/孔，每組3個復孔，離心250g 4分鐘，37℃、5％CO2孵箱培養6小時，設僅有淋巴細胞和僅有SARS基因片段重組腺病毒感染的正常人原代培養血管內皮細胞為對照孔。培養4小時後加10ul噻唑藍(MTT，5mg/ml)，置37℃、5％CO2孵箱中培養4小時。半小時後，每孔加入二甲基亞碸(DMSO)100ul溶解紫蘭色顆粒。半小時後用酶標儀(Bio-RadModel3550-UV)測量595nm的光密度值(OD595nm)，並計算細胞毒百分率。
結果見圖2結果顯示免疫組小鼠脾細胞對SARS基因片段重組腺病毒感染的正常人原代培養血管內皮細胞有很強的殺傷活性。
實例4用流式細胞儀檢測免疫後小鼠血清中抗SARS基因片段重組腺病毒感染的正常人原代培養血管內皮細胞抗體免疫組和對照組小鼠於第三次免疫後的第5天經眼眶採血，收集小鼠血清，分別取1×106個SARS基因片段重組腺病毒感染的正常人原代培養血管內皮細胞、正常人原代培養血管內皮細胞、空腺病毒感染的正常人原代培養血管內皮細胞移入流式樣品管，用PBS液洗滌，每管加入稀釋度為1∶500的小鼠治療組和對照組血清100ul。以PBS液代替小鼠血清作為一抗空白對照。於4℃冰箱內避光作用1小時，用PBS液洗滌，每管又分別加入羊抗鼠GoatF(ab』)2 Fragment mouse IgG(H+L)-FITC(ImmunoTECH)，工作濃度1∶50，室溫避光作用30分鐘，用PBS液洗滌3次，細胞沉澱加PBS液1ml，上流式細胞儀(Coulter Elite ESP)檢測，分析其抗Mel526、MCF-7、K562抗體表達水平和平均螢光強度。
流式細胞儀檢測抗體結果見圖3從圖3可以看出，用免疫組血清染色SARS基因片段腺病毒感染的正常人原代培養血管內皮細胞強陽性，而正常人原代培養血管內皮細胞、空腺病毒感染的正常人原代培養血管內皮細胞染色陽性，說明免疫組小鼠產生了抗SARS基因片段腺病毒感染的正常人原代培養血管內皮細胞抗體。未免疫組小鼠血清染色上述細胞均為陰性。
權利要求
1.一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，其特徵在於①含有SARS冠狀病毒S蛋白的全長基因序列的全部或部分基因片段及5個特有的cDNA片段的真核表達載體；②表達上述SARS冠狀病毒基因相應蛋白的異種抗原遞呈細胞；③將表達SARS冠狀病毒相關蛋白的異種抗原遞呈細胞滅活。
2.根據權利1所述的一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，其特徵在於含有SARS冠狀病毒S蛋白的全長基因序列的全部或部分基因片段及5個特有的cDNA片段，5個特有的cDNA片段為a.1 atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt61 gacaatgctt ctcctgcaag tactgttcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca121 ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc181 aaaataattg cgctcaataa aagatggcag ctagcccttt ataagggctt ccagttcatt241 tgcaatttac tgctgctatt tgttaccatc tattcacatc ttttgcttgt cgctgcaggt301 atggaggcgc aatttttgta cctctatgcc ttgatatatt ttctacaatg catcaacgca361 tgtagaatta ttatgagatg ttggctttgt tggaagtgca aatccaagaa cccattactt421 tatgatgcca actactttgt ttgctggcac acacataact atgactactg tataccatat481 aacagtgtca cagatacaat tgtcgttact gaaggtgacg gcatttcaac accaaaactc541 aaagaagact accaaattgg tggttattct gaggataggc actcaggtgt taaagactat601 gtcgttgtac atggctattt caccgaagtt tactaccagc ttgagtctac acaaattact661 acagacactg gtattgaaaa tgctacattc ttcatcttta acaagcttgt taaagaccca721 ccgaatgtgc aaatacacac aatcgacggc tcttcaggag ttgctaatcc agcaatggat781 ccaatttatg atgagccgac gacgactact agcgtgcctt tgtaab.1 atgatgccaa ctactttgtt tgctggcaca cacataacta tgactactgt ataccatata61 acagtgtcac agatacaatt gtcgttactg aaggtgacgg catttcaaca ccaaaactca121 aagaagacta ccaaattggt ggttattctg aggataggca ctcaggtgtt aaagactatg181 tcgttgtaca tggctatttc accgaagttt actaccagct tgagtctaca caaattacta241 cagacactgg tattgaaaat gctacattct tcatctttaa caagcttgtt aaagacccac301 cgaatgtgca aatacacaca atcgacggct cttcaggagt tgctaatcca gcaatggatc361 caatttatga tgagccgacg acgactacta gcgtgccttt gtaagcacaa gaaagtgagt421 acgaacttat gtactcattc gtttcggaag aaacaggtac gttaac.1 atgtttcatc ttgttgactt ccaggttaca atagcagaga tattgattat cattatgagg61 actttcagga ttgctatttg gaatcttgac gttataataa gttcaatagt gagacaatta121 tttaagcctc taactaagaa gaattattcg gagttagatg atgaagaacc tatggagtta181 gattatccat aad.1 atgaaaatta ttctcttcct gacattgatt gtatttacat cttgcgagct atatcactat61 caggagtgtg ttagaggtac gactgtacta ctaaaagaac cttgcccatc aggaacatac121 gagggcaatt caccatttca ccctcttgct gacaataaat ttgcactaac ttgcactagc181 acacactttg cttttgcttg tgctgacggt actcgacata cctatcagct gcgtgcaaga241 tcagtttcac caaaactttt catcagacaa gaggaggttc aacaagagct ctactcgcca301 ctttttctca ttgttgctgc tctagtattt ttaatacttt gcttcaccat taagagaaag361 acagaatgae.1 atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga cccacagatt61 caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag cgccgacccc121 aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat ggcaaggagg181 aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt ccagatgacc241 aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc aaaatga
3.根據權利1所述的一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，其特徵在於含有SARS冠狀病毒S蛋白的全長基因序列的全部或部分基因片段及5個特有的cDNA片段的真核表達載體，包括各種病毒表達載體和真核表達質粒。
4.根據權利1所述的一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，其特徵在於採用與宿主不同種屬的異種抗原遞呈細胞作為細胞疫苗的細胞載體，包括但不限於原代培養和已建系的異種B細胞。
5.根據權利1所述的一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，其特徵在於異種抗原遞呈細胞表達上述SARS冠狀病毒基因相應蛋白。
6.根據權利1所述的一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗，其特徵在於將表達SARS冠狀病毒相關蛋白的靶細胞滅活，包括通過多聚甲醛或福馬林液固定滅活靶細胞，通過γ射線滅活固定靶細胞。
7.根據權利1所述的一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗在預防和治療非典型肺炎中的應用
全文摘要
本發明公開一種抗SARS冠狀病毒的細胞疫苗及應用，所述細胞疫苗①含有SARS冠狀病毒S蛋白的全長基因序列的全部或部分基因片段及5個特有的cDNA片段的真核表達載體；②表達上述SARS冠狀病毒基因相應蛋白的異種抗原遞呈細胞；③將表達SARS冠狀病毒相關蛋白的異種抗原遞呈細胞滅活。將上述細胞疫苗用於包括人類和嚙齒類動物如小鼠在內的宿主進行免疫，使其產生保護性的體液免疫和細胞免疫，以抵抗引起非典型性肺炎傳染病的SARS冠狀病毒的感染。本發明安全性和穩定性好，生產方便，價格便宜，能誘導機體同時產生針對引起非典的SARS冠狀病毒的有效體液免疫和細胞免疫，為治療和預防非典型性肺炎提供了有效且價廉的疫苗。
文檔編號A61K45/00GK1990042SQ20051005709
公開日2007年7月4日 申請日期2005年5月31日 優先權日2005年5月31日
發明者賀偉峰, 吳軍 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院