鹽酸洛哌丁胺作為抗腫瘤藥物組分及其應用的製作方法

2023-05-15 22:10:06 3

專利名稱：鹽酸洛哌丁胺作為抗腫瘤藥物組分及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及鹽酸洛哌丁胺的應用，特別是作為抗腫瘤藥物的應用。
背景技術：
惡性腫瘤包括癌和肉瘤，是危害人類健康的常見而難治之症。隨著科學技術的發展， 人們已經開發出了多種化療和生物治療藥物。目前可以單用或與化療相結合的生物治療藥 物包括細胞因子、造血生長因子、過繼免疫治療、體細胞治療、表皮生長因子酪氨酸激酶 抑制劑、血管生長抑制劑、基質金屬蛋白酶抑制劑、細胞信號通路調節劑、反義治療、法 尼基轉化酶抑制劑、多靶點抗葉酸藥、腫瘤壞死因子相關性凋亡誘導配體、生長抑素、單 克隆抗體靶向治療、瘤苗治療、基因治療等種類。為進一步提高療效，還開發了生物治療 /化療的同時療法、序貫療法等聯合治療策略[李衛東，李金翰.惡性腫瘤生物化療及其臨 床應用類別.癌症進展雜誌，2003,1(4): 202-205.]。
化療對於腫瘤已經轉移或不能用手術切除的患者是最主要的治療方法和手段。但是傳 統的細胞毒性藥物在殺死腫瘤細胞的同時，還作用於正常細胞，造成嚴重的毒副作用，而 且腫瘤細胞在存活壓力下還很容易產生耐藥性。而近年來發展迅速的分子靶向藥物雖然耙 點明確特異，但也有一系列脫靶效應(off target effect)的報導，而且單一用藥使人 體產生耐藥性的機率較大。因而，發展具有新型作用機理的療效好、毒性低的抗腫瘤新藥 具有重要的意義。
鹽酸洛哌丁胺(Loperamide hydrochloride)又名易蒙停，化學名為N， N-二甲基-a， a -二苯基-4-(對-氯苯基)-4-羥基-1-哌啶丁醯胺鹽酸鹽，是由比利時Janssen公司開發的
一種無嗎啡樣中樞作用的止瀉藥，用於急性腹瀉和各種原因引起的慢性腹瀉，對不明原因 的腹瀉和腸易激症候群等也有較好療效。同時，該藥不良反應發生率低，偶見過敏反應(包
括皮疹)、胃腸不適、噁心、嘔吐、腹痛、頭痛、口乾、頭暈、便秘、腸梗阻等，其變態 反應，特別是伴有中樞症狀的變態反應較為少見。由於其安全性較好，被作為非處方藥銷 售。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供鹽酸洛哌丁胺的一種新用途，即鹽酸洛哌丁胺作為制 備抗腫瘤藥物的應用。
作為本發明的應用的改進鹽酸洛哌丁胺通過口服吸收、皮下注射或靜脈注射，產生
抗腫瘤作用。
作為本發明的應用的進一步改進亡。
作為本發明的應用的進一步改進
的Tie2受體發揮作用。
作為本發明的應用的進一步改進
腫瘤生長停滯。
作為本發明的應用的進一步改進
作為本發明的應用的進一步改進 揮作用。
作為本發明的應用的進一步改進 進而引發細胞凋亡。
作為本發明的應用的進一步改進
腎癌、胰腺癌或黑色素瘤。
因此，鹽酸洛哌丁胺能用於抑制腫瘤細胞。
本發明的具體用法可選擇如下方式
將鹽酸洛哌丁胺先溶於二甲基亞碸(DMSO)或甲醇等助劑中形成母液。然後以適宜 的溶液(例如生理鹽水)將母液進一步稀釋成為藥液，使最終的藥液中二甲基亞碸(DMSO) 或甲醇等助劑的體積比不超過千分之一，以消除助劑對使用結果的影響。 一般可按照1.8 2.2mg鹽酸洛哌丁胺/kg體重的劑量以注射的形式給藥。
本發明所用的鹽酸洛哌丁胺藥液對肝癌細胞SMMC7721、乳腺癌細胞MCF-7、肺腺癌 細胞SPC-A1、卵巢癌耐藥細胞SKOV3-DDP等多種細胞的增殖具有顯著的抑制作用。本發 明所用的鹽酸洛哌丁胺藥液可以誘導腫瘤細胞發生明顯的凋亡。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。
圖1是不同濃度鹽酸洛哌丁胺作用24h誘導肺腺癌細胞SPC-A1凋亡的情況(PI單染)
:鹽酸洛哌丁胺能夠促進腫瘤新生血管內皮細胞的凋
:鹽酸洛哌丁胺通過結合腫瘤新生血管內皮細胞表面
:鹽酸洛哌丁胺能夠抑制腫瘤細胞的生長和分裂，使
:鹽酸洛哌丁胺能夠促進腫瘤細胞的凋亡。
:鹽酸洛哌丁胺通過結合腫瘤細胞表面的Tie2受體發
:鹽酸洛哌丁胺通過阻斷腫瘤細胞膜上的鈣離子通道
:所述腫瘤為白血病、肝癌、肺癌、腸癌、乳腺癌、圖2是鹽酸洛哌丁胺37. 5 uM對肺腺癌細胞SPC-Al的凋亡誘導作用(FITC-Annexin V/PI雙染)圖。
具體實施例方式
實施例1、鹽酸洛哌丁胺對細胞增殖的抑制作用
將鹽酸洛哌丁胺溶於二甲基亞碸(DMS0)或甲醇，配成鹽酸洛哌丁胺的濃度為50mM 的母液備用。
將對數生長期肝癌細胞SMMC7721稀釋成2X10S個/ml，接種於96孔培養板，每孔 加入O. 1 ml，置37 'C， 5% C02及飽和溼度的培養箱培養。待細胞充分貼壁後，小心吸 棄上清。用RPMI1640培養液稀釋母液，從而使鹽酸洛哌丁胺至不同的終濃度(100uM、 50uM、 25uM、 12. 5uM、 6. 25uM)，每濃度平行5孔，每孔加入0. 1 ml，空白對照組加等量 同樣稀釋的培養液，置培養箱培養24h (培養條件同上)；實驗終止前4小時每孔加入5 mg/mlMTT 10 ul。培養結束後，小心吸棄上清，每孔加入150 ul 二甲基亞碸(DMSO)， 振蕩10 min。待MTT還原產物完全溶解後，用酶標儀，以550 nm為檢測波長，655 nm為 參照波長測定其吸光度。計算細胞的存活率，並以藥物的不同濃度對細胞的存活率作圖，
從而確定藥物的半數抑制濃度(IC50)。
細胞蹄率:Hl^lllx腿 對照組的OD平均值
半數抑制濃度(IC5o):引起半數細胞死亡的藥物濃度。
實驗結果為鹽酸洛哌丁胺藥液對肝癌細胞SMMC7721的半數抑制濃度(IC5o)為 24. 2uM。
以乳腺癌細胞MCF-7替代肝癌細胞SMMC7721，其餘測試方法同上，實驗結果為 鹽酸洛哌丁胺藥液對乳腺癌細胞MCF-7的半數抑制濃度(IC5Q)為23. 6uM。
以肺腺癌細胞SPC-A1替代肝癌細胞SMMC7721，其餘測試方法同上，實驗結果為 鹽酸洛哌丁胺藥液對肺腺癌細胞SPC-A1的半數抑制濃度(IC5o)為25.9uM。
以卵巢癌耐藥細胞SK0V3-DDP替代肝癌細胞SMMC7721，其餘測試方法同上，實 驗結果為鹽酸洛哌丁胺藥液對卵巢癌耐藥細胞SKOV3-DDP的半數抑制濃度(IC5o)為 27. luM。
實施例2、 PI單染測定鹽酸洛哌丁胺誘導的細胞凋亡
取對數生長期的肺腺癌細胞SPC-A1，以2X105個/ml的密度接種於底面積25cm2的 培養瓶中，置37'C， 5%(202及飽和溼度的培養箱培養，待細胞充分貼壁後，用1640培養 基稀釋實施例1中的鹽酸洛哌丁胺母液(50mM)，從而使培養瓶中鹽酸洛哌丁胺的終濃度 分別為0、 12. 5uM、 25uM、 50uM，繼續培養24h (培養條件同上)。加入0. 25%胰酶200ul 消化細胞，1000rpm 6min離心，收集培養上清中和貼壁消化下來的細胞，以PBS洗2次， 離心去上清。加入預冷的70%乙醇，在4。C下固定細胞3h以上或過夜。離心，去固定液， 用PBS緩衝液洗細胞一次，加入終濃度為50 ug/tnl的碘化丙錠(Propidium iodide， PI) 染色，室溫作用30min。使用FACSCalibur流式細胞儀檢測，CELLQUEST軟體分析數據並 作圖，亞二倍體峰被定量，作為測定凋亡的標準。
結果表明，隨鹽酸洛哌丁胺濃度的增加，凋亡峰的比例逐漸增加(圖1)，說明鹽酸 洛哌丁胺可以誘導腫瘤細胞的凋亡。
實施例3、 FITC-Annexin V/PI雙染檢測細胞早期凋亡
取對數生長期的肺腺癌細胞SPC-A1，以2X105個/ml的密度接種於底面積250112的 培養瓶中，置37'C， 5%<:02及飽和溼度的培養箱培養，待細胞充分貼壁後，用1640培養 基稀釋實施例1中的鹽酸洛哌丁胺母液(50mM)，從而使培養瓶中鹽酸洛哌丁胺的終濃度 為37.5uM，繼續培養(培養條件同上)，分別於作用Oh、 6h、 12h、 24h後，加入0.25% 胰酶200ul消化細胞，1000rpm6min離心，收集培養上清中和貼壁消化下來的細胞，以PBS 洗2次，離心去上清。按FITC-A腿xin V/PI雙染試劑盒說明，加入FITC-A匿xin V和 PI進行染色。同時，取正常培養的肺腺癌細胞SPC-Al，不加任何染料，作為陰性對照。 另外，還需製備FITC-Amiexin V陽性對照和PI陽性對照，即將正常培養的肺腺癌細胞 SPC-A1煮沸3min，冷卻後，按試劑盒中用量，分別加入FITC-Annexin V和PI中的一禾中 即可。使用FACSArray Bioanalyzer流式細胞儀檢測。
結果表明，鹽酸洛哌丁胺作用6h即可誘導肺腺癌細胞的早期凋亡，隨作用時間延長， 凋亡細胞的比例逐漸增加(圖2)，說明鹽酸洛哌丁胺可以誘導肺腺癌細胞凋亡。
實施例4、鹽酸洛哌丁胺的體內抗腫瘤活性
取對數生長期的肺腺癌細胞SPC-Al，在每個底面積252的培養瓶中，加入0.25%胰
酶200ul消化，將消化下來的細胞加入到15 ml塑料離心管中，1000 rpm離心10 min， 小心倒掉離心管中的培養液，加入PBS，吹打均勻，再IOOO rpm離心10 min，小心倒掉 離心管中的PBS，加入新的PBS，將細胞吹打均勻後調至lxl(^個/ml，用於接種。
購買四周齡SPF級BALB/c裸鼠，在接種前先馴養5天，並自由飲水和進食。接種時， 在每隻裸鼠的前肢皮下注射肺腺癌細胞SPOAl懸液(lxl(^個/ml) 0.2ml。接種後10天 左右，可見接種處形成瘤塊。將裸鼠稱重、標記並隨機分為3組，每組10隻。分別是
陰性對照組注射生理鹽水，0.2ml/次；
陽性對照組注射阿黴素(Adriamycin， ADM)溶液(以生理鹽水稀釋配製)，劑量 2 mg阿黴素/kg體重；
試驗組注射鹽酸洛哌丁胺藥液(以生理鹽水稀釋配製)，劑量2 mg鹽酸洛哌丁胺/kg 體重-，
採用腹腔注射形式(i. P.)給藥，每天給藥一次，連續給藥7天。每隔一天測量瘤 塊的體積，並觀察、記錄裸鼠的行為和死亡情況。連續觀察30天，對各組裸鼠的瘤塊體 積及死亡情況進行對比，作為藥物療效的評價指標。
結果表明，陰性對照組裸鼠在30天內死光；陽性對照組在30天內死亡3隻，存活率70%， 瘤塊平均體積l. 73cm3;鹽酸洛哌丁胺組30天內死亡1隻，存活率90%,瘤塊平均體積l. 33cm3。 這說明鹽酸洛哌丁胺可以抑制裸鼠實體腫瘤的生長，並顯著提高裸鼠的存活率。
最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明 不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直 接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1、鹽酸洛哌丁胺作為製備抗腫瘤藥物的應用。
2、 根據權利要求l所述的鹽酸洛哌丁胺作為製備抗腫瘤藥物的應用，其特徵是鹽酸洛 哌丁胺通過口服吸收、皮下注射或靜脈注射，產生抗腫瘤作用。
3、 根據權利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為製備抗腫瘤藥物的應用，其特徵是鹽酸 洛哌丁胺能夠促迸腫瘤新生血管內皮細胞的凋亡。
4、 根據權利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為製備抗腫瘤藥物的應用，其特徵是鹽酸洛哌丁胺通過結合腫瘤新生血管內皮細胞表面的Tie2受體發揮作用。
5、 根據權利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為製備抗腫瘤藥物的應用，其特徵是鹽酸洛哌丁胺能夠抑制腫瘤細胞的生長和分裂，使腫瘤生長停滯。
6、 根據權利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為製備抗腫瘤藥物的應用，其特徵是鹽酸洛哌丁胺能夠促進腫瘤細胞的凋亡。
7、 根據權利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為製備抗腫瘤藥物的應用，其特徵是鹽酸洛哌丁胺通過結合腫瘤細胞表面的Tie2受體發揮作用。
8、 根據權利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為製備抗腫瘤藥物的應用，其特徵是鹽酸洛哌丁胺通過阻斷腫瘤細胞膜上的鈣離子通道進而引發細胞凋亡。
9、 根據權利要求1或2所述的鹽酸洛哌丁胺作為製備抗腫瘤藥物的應用，其特徵是所述腫瘤為白血病、肝癌、肺癌、腸癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌或黑色素瘤。
全文摘要
本發明公開了鹽酸洛哌丁胺的一種新用途作為製備抗腫瘤藥物的應用。鹽酸洛哌丁胺對腫瘤細胞的增殖具有顯著的抑制作用，鹽酸洛哌丁胺可以誘導腫瘤細胞發生明顯的凋亡。
文檔編號A61P35/00GK101390858SQ20081012180
公開日2009年3月25日 申請日期2008年10月20日 優先權日2008年10月20日
發明者宮興文, 徐宇虹 申請人:浙江大學