毛茛總苷在製備治療心血管疾病藥物中的應用的製作方法

2023-05-15 23:57:41 1

專利名稱：：毛茛總苷在製備治療心血管疾病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及毛莨總苷的應用，具體地說，是毛莨總苷在製備抗心絞痛藥或抗動脈粥樣^_化藥物中的應用。
背景技術：
：心絞痛、動脈粥樣硬化和心肌缺血等是嚴重危害人類健康的心血管疾病，其發病率上升，發病年齡年輕化的趨勢。已有技術中雖然有許多針對這些疾病治療藥物，療效不佳，而且不良反應嚴重，限制了這些藥物的使用，尋找這方面的新藥，仍然是當前和今後研究的熱點。動脈粥樣硬化(AS)是西方發達國家的主要死亡原因。隨著我國人民生活水平提高和飲食習慣改變，該病也成為我國主要死亡原因。動脈粥樣硬化是一種進行性的過程，病程可從兒童時就開始至成年的中後期才出現臨床症狀。由於病理發現在動脈內膜積聚脂質外觀呈黃色粥樣，因此稱為動脈粥樣化。各種動脈硬化的共同特點是動脈發生了非炎症性、退行性和增生性的病變，導致管壁增厚變硬，失去彈性和官腔縮小。動脈粥樣硬化的特點是在上述病變過程中從內膜開始，先後有多種病變合併存在，包括局部有脂質和複合糖類積聚，出血和血栓形成，纖維組織增生和4丐質沉著，並有動脈中層的逐漸退化和鉤化。現在認為，本病變是多因素共同作用的結果，首先是病變處於平滑肌細胞、巨噬細胞及T淋巴細胞的聚集；其次是包括膠原、彈性纖維及蛋白質多糖等結締組織基質和平滑肌細胞的增生；第三是脂質，其中主要含膽固醇結晶及游離膽固醇和結締組織。粥樣硬化斑塊中脂質及結締組織的含量決定斑塊的穩定性以及是否易導致急性缺血事件發生。臨床表現主要決定於血管病變及受累器官的缺血程度，主動脈粥樣硬化常無症狀，冠狀動脈粥樣硬化者，若管徑狹窄達75%以上，則可發生心絞痛、心肌梗塞、心律失常，甚至猝死。腦動脈硬化可引起腦缺血、腦萎縮，或造成腦血管破裂出血，腎動脈粥樣硬化常引起夜尿、頑固性高血壓、嚴重者可有腎功能不全。腸繫膜動脈粥樣硬化可表現為飽餐後腹痛便血等症狀。下肢動脈粥樣硬化引起血管腔嚴重狹窄者可出現間歇性跛行、足背動脈搏動消失，嚴重者甚至可發生壞疽。心絞痛是心肌缺血引起的胸痛，一般是由冠狀動脈阻塞或痙攣所導致。冠狀動脈疾病是心血管的動脈粥狀硬化，為心絞痛的主要原因。心肌缺乏血液供應時，患者會感到胸前有壓迫感。病理解剖4企查顯示心絞痛的病人，至少有一支冠狀動脈的主支管腔顯示狹窄達橫切面的75%以上。有側支循環形成者，則冠狀動脈的主支有更嚴重的阻塞才會發生心絞痛。另一方面，冠狀動脈造影發現5%~10°/。的心絞痛病人，其冠狀動脈的主要分支無明顯病變，提示這些病人的心肌血供和氧供不足，可能是冠狀動脈痙攣、冠狀循環的小動脈病變、血紅蛋白和氧的解離異常、交感神經過度活動、兒茶酚胺分泌過多或心肌代謝異常等所致。綜上所述，動脈粥樣硬化的病理病生與平滑肌細胞的增生、高血脂存在密切聯繫，而心血管的動脈粥樣硬化，為心絞痛的主要原因。
發明內容本發明的所要解決的技術問題是彌補已有技術的不足，目的在於提供毛K總苦在製備療效顯著、不良反應少的心血管疾病藥物製劑方面的新用途。本發明的技術方案提供了從抗血管平滑肌細胞增殖和降血脂的藥物可以用於預防和治療動脈粥樣硬化和心絞痛的發明思路。本發明通過如下技術方案實現上述目的毛莨總苷應用於製備治療心絞痛藥物製劑。毛策總苷應用於製備治療動脈粥樣硬化藥物製劑。所述的藥物製劑可以是目前適用於人體〗吏用的藥物製劑，如注射劑、口服製劑、氣霧劑、外用製劑及其他已有藥物製劑。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果現有治療藥物中，大部分藥物作用靶點單一，本發明將毛莨總苷應用於製備抗心絞痛、抗動脈粥樣硬化藥，具有抑制血管平滑肌增生、抗心肌缺血和調血脂多方面的作用，為該專業
技術領域：
提供了一種新的有效的藥物。將其作為新藥進行研究,並最終應用於臨床動脈硬化和心肌缺血病的治療,具有廣闊的應用前景和社會效益及經濟效益。本發明通過毛莨總苷抗大鼠血管平滑肌(VSMC)增殖作用實驗和毛復總苷調血脂實驗對毛策總苷抗血管平滑肌細胞增殖和降血脂的作用進行了研究，為該製劑在動脈粥樣硬化和心絞痛方面的應用奠定了實驗基礎；同時本發明通過毛莨總苷對垂體後葉素所致小鼠心肌缺血的保護作用研究觀察了毛莨總苷對心肌缺血和血流狀態的影響，為該製劑在改善心絞痛症狀方面的應用提供了進一步的實驗依據。圖1實施例1中自動酶標儀測定各孔的吸光度值的結果圖，其中，橫坐標為樣品編號，l為尼莫地平，2為毛莨總苷100pg/ml，3為毛莨總苷50)aug/ml，4為毛萊總苷25pug/ml，5為模型組；縱坐標為吸收值；圖中*表示與模型組比較該樣品PO.05,**表示與模型組比較該樣品PO.Ol。具體實施例方式以下通過具體的實施例進一步說明本發明的技術方案。實施例1毛萊總苷(TGRJ)的製備毛萊總苷由廣東藥學院藥理教研室以毛復(ia"w"cw/w乂apom'cw)全草為原料，經30%~90%乙醇回流提取三次，過80目篩，合併提取液，減壓濃縮回收溶劑，揮幹乙醇，得膏狀物。毛萊全草還可用乙醇滲漉，滲漉液回收溶劑，濃縮得膏狀物；或將毛復全草用水^提醇沉，過濾，濾液回收乙醇，濃縮，得膏狀物。膏狀物用蒸餾水溶解，濾液上柱，經D-101大孔樹脂吸附，水洗,棄去，再用純乙醇洗脫,收集此部位,蒸乾乙醇得膏狀物即毛"l總苷。製得的毛策總苷可用於製備各種適用於人體的藥物製劑，如注射劑、口服製劑、外用製劑或其他目前已有的藥物製劑。實施例2毛策總苷抗大鼠血管平滑肌(VSMC)增殖作用實驗1材料1.1藥品與試劑毛茛總苷實施例1製得的毛莨總苷。DMEM液體細胞培養基，Hyclone7^司，批號NSG0054月臺牛血清(FBS),Hyclone公司，批號20060404胰蛋白酶，Sigma分裝，批號DH355-2磷酸緩沖液(PBS),北京鼎國生物技術有限責任公司青黴素，Sigma分裝,批號:DH231-1鏈黴素，Sigma分裝，批號:DH325p塞唑藍(MTT),Sigma分裝，批號DH343-1三氯醋酸，Genebase,批號:G2365二曱基亞碸，北京鼎國生物技術有限責任公司尼莫地平注射液，均購自上海禾豐製藥有限^^司。1.2儀器細胞培養箱,美國Thermo電子電器公司生物螢光倒置顯微鏡(LeicalM50),德國萊茨公司淨化工作檯(SW-CJ-1FD型單人雙面)，蘇州淨化普通冰箱(4。C至-18。C),海爾，華凌，伊萊克斯低溫冰箱(-20。C至-80。C),日本三洋酶標儀(ELX800),美國Biotech公司低速離心機(LD4-2A型)，北京醫用離心機廠立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-30SII),上海博迅實業有限公司醫療設備移液器，上海艾本德生物技術國際貿易有限公司酸度計(PHS-25型)，上海雷磁^f義器廠磁力攪拌器(JB-2型)，上海雷磁新涇儀器有限公司迴旋式振蕩器(HY-5型)，江蘇金壇市宏華儀器廠數顯鼓風千燥箱(GZX-9240MBE),上海博迅實業有限公司醫療設備廠電熱恆溫水槽(DK-8D型)，上海一恆科技有限公司自動雙重純水蒸餾水器(SZ-93),上海雅榮生化設備儀器有限公司96孔培養板,Coming3.5cm培養皿，Coming25cm2或75cm2培養並瓦,Greinerbio-one15ml或50ml離心管，Falcon1.3動物SPF級SD成年大鼠，由廣東省醫學實-驗動物中心才是供，許可證號SCXK(粵)2003-002，粵監證字2005A010;體重200g。2.1毛復總苷對去曱腎上腺素誘導增殖的VSMC半數抑制濃度測定2.1.1實驗前準備(1)PBS液:取PBS濃縮液一瓶(50ml)及8.5gNaCl粉末,加三蒸水定容至1L,攪拌混勻，0.22i!m微孔濾膜過濾除菌，4"C保存。(2)D-Hanks緩沖液的配製NaCl8g,KC10.4g,NaHP04.12H200.1342g，KH2PO40.06g,三蒸水1000ml，調PH值至7.4,0.22,孩i孔濾膜抽濾除菌，置4。C保存備用。(3)含10%或20%胎牛血清(FBS)的細胞培養液:用低糖的DMEM液體培養基4要9:1或4:1的體積比與胎牛血清混勻，即得到含10%或20%FBS的細胞培養液，分裝，4。C保存。(4)0.25%胰蛋白酶稱取所需量的胰蛋白酶粉末，力口PBS液溶解，調節PH7.2，無菌過濾，分裝，-2(TC冷凍保存。(5)分離血管平滑肌細胞所用的手術工具:解剖器械(兩把普通手術剪，兩把止血鉗，兩把眼科直剪，一把眼科彎剪和三把彎頭眼科鑷)，長吸管數根，兩套平J3L,—把自製細胞刮刀，121°C,20min高壓滅菌，烘箱乾燥備用。PBS液、D-Hanks緩沖液、胰酶、培養液臨用時均用37。C預熱。2.1.2細胞的分離和培養大鼠斷頭死處後，在無菌環境下，迅速分離出胸主動脈置於玻璃平皿內的D-Hanks緩衝液中，去除管腔內血液，剝離外膜及附著組織，將動脈段縱向剪開，使內膜朝上平攤於平皿上，用自製細胞刮刀輕輕刮去內皮細胞，然後將中膜平滑月幾剪切成若干塊面積約為2mm2組織小塊，均勻貼在培養皿上[1],置於37°C、5%(:02培養箱中，2小時後加入培養液，加入量以剛沒過組織塊為宜。培養液為含20。/。胎牛血清的DMEM培養基，2-3天換液一次，每次換液為半量換液。待細胞生長至亞融合狀態時，用0.25%胰蛋白酶消化，轉入25cm2培養瓶，用含10%胎牛血清的DMEM培養基進行傳代培養。倒置相差顯微鏡下觀察單個平滑肌細胞呈梭形或帶狀,有多個細胞突起,胞漿豐富,胞質密度高，不透明,核卵圓形居中,有多個核仁。細胞生長緻密時平行排列成束，部分重疊,表現為典型的"谷峰狀"生長[2'3]。本實驗所用的VSMC為傳代至8~9代的細胞。選用p塞唑藍(Methylthiazolyltetrazolium,MTT)染色法^r測。原理MTT的四唑環能被活細胞線粒體中的各種脫氫酶還原，生成結晶狀深紫色的不溶性物質一一formazan(藍紫色的甲瓚)，其溶於二曱基亞碸(DMSO)在紫外分光光度計570nm波長附近有明顯吸收峰。處理步驟細胞培養培養一定時間後，加入MTT磷酸緩衝液(lmg/ml,50p1/孔)，繼續培養4h,吸乾淨孔內液體後，加入DMSO(150pl/孔)，室溫下在平才反振蕩器上振搖10min,使結晶溶解。然後在570nm波長下用自動酶標儀測定各孔的吸光度值,記錄結果。2.1.4半數抑制濃度測定將細胞接種至96孔板中，分成5個組，每組6孑L,細胞密度為6000個/孔，按照下述方案加藥處理①正常組培養液加入等體積DMEM培養基；②毛萊總苷100嗎/ml+NE組加入終濃度為100嗎/ml的毛莨總苷，3h後再加入NE使培養液中NE的終濃度為3xl(T5mol/L;③毛莨總苷50嗎/ml+NE組加入終濃度為50嗎/ml的毛萊總苷，孵育細胞3h後，再加入NE使培養液中NE的終濃度為3xl(T5mol/L;④毛莨總苷25嗎/ml十NE組加入終濃度為25嗎/ml的毛萊總苷，3h後再加入NE^使培養液中NE的終濃度為3xl(T5mol/L;⑤毛復總苷12.5jig/ml+NE組加入終濃度為12.5|ig/ml的毛莨總苷，3h後再加入NE使培養液中NE的終濃度為3x1(T5mol/L;模型組加入NE使培養液中NE的終濃度為3xl(T5mol/L。待細胞貼壁後換培養液，加藥幹預72h後觀察，得出各實驗組的抑制率(％)。抑制率(％)=[(A模型組-A實驗組)/(A模型組-A對照組)]xlOO%,結果見表1:表1不同濃度毛^總苷對去曱腎上腺素誘導血管平滑肌增生的抑制作用劑量昭/ml吸收值抑制率~~與才莫型組比專支*,p<0.05,**,p司，批號070103垂體後葉素(PIT),瀋陽濟世製藥有限公司，批號107220011.2儀器BL-420E生物機能實驗系統，成都泰盟超級恆溫器(501型)，上海市實驗^l器廠1.3動物SPF級昆明種小鼠，體重20—25g,70隻，雌雄各35隻，購自廣東省醫學實驗動物中心。許可證號SCXK(粵)2003-0002,粵監證字2007A006。2實驗方法1.1分組及給藥將小鼠70隻，隨機分為7組，每組10隻，雌雄各5隻。分為生理鹽水灌胃給藥組，毛萊總苷高劑量(400mg/kg)灌胃給藥組，毛策總苷低劑量(200mg/kg)灌胃給藥組，生理鹽水腹腔注射給藥組，毛萊總苷高劑量(400mg/kg)腹腔注射給藥組，毛^總苷低劑量(200mg/kg)腹腔注射給藥組，硝苯地平(100mg/kg體重)灌胃給藥組。各組給藥2次/天，連續給藥3天。最後一次給藥後1小時，腹腔注射20%烏拉坦0.075m1/10g腹腔麻醉後固定，記錄正常II導聯心電圖，然後尾靜脈注射垂體後葉素0.2ji/10g製備心肌缺血模型，分別記錄第30s、lmin、2min、10min的心電圖。1.2統計學方法實驗數據以(i士s)表示，採用t檢驗進行統計學處理。3實驗結果3.1毛萊總苷對垂體後葉素導致小鼠T波改變的影響實驗結果見表2，結果表明，毛茛總苷高、低劑量組在注射PIT後第30s,lmin，2min後的T波抬高均明顯低於生理鹽水組(P0.01,PO.05),表明毛莨總苷高、低劑量組對垂體後葉素致小鼠心肌缺血均有抵抗作用，其抵抗效果均不如硝苯地平組顯著，而高劑量組的效果稍優於低劑量組T波抬高幅度-注射Pit後T波-注射Pit前T波。表2毛萊總苷對垂體後葉素導致小鼠T波改變的影響(n=10;c士s)tableseeoriginaldocumentpage12表2結果表明，400mg/kg體重劑量和200mg/kg體重劑量的毛莨總苷均能抑制垂體後葉素所致心肌缺血時小鼠心電圖T波抬高，對垂體後葉素引發小鼠的心肌缺血有保護作用。4討論垂體後葉素是從牛、豬等垂體後葉中提取的多肽物質，內含縮宮素及加壓素，加壓素能明顯使冠狀動脈、毛細血管、小動脈、小靜脈收縮[2]。給小鼠尾靜脈注射PIT後，可迅速使冠狀動脈血管收縮痙攣，致心臟血氧供應障礙，導致心肌缺血[3]。ST段的抬高常用於心肌缺血的判斷，T波代表左右兩心室復極過程的電位變化，小鼠心電圖的T波在R波的降枝中下部出現返折上升形成，T波平坦、雙向、倒置常為心肌缺血、炎症的心肌損傷的表現[4]。同時其直接作用於竇房結自律細胞、特殊傳導系統和心室肌細胞，使竇房結自律細胞的自律性下降，使特殊傳導系統的傳導速度減慢，使心室肌的去極化過程及傳導速度減慢，從而使心率減慢[5]。因而將注射PIT後心率減慢作為評價小鼠心肌缺血損傷程度的指標。硝本地平具有抑制Ca"內流作用，直接鬆弛血管平滑肌，擴張冠狀動脈，增加冠脈血流量，提高心肌對缺血的耐受性，同時擴張周圍小動脈，降低外周血管阻力，從而使血壓下降。小劑量擴張冠狀動脈時不影響血壓，為壽交好的抗心絞痛藥，因此將其選作對抗心肌缺血的陽性對照藥物。本研究採用垂體後葉素誘發小鼠心肌缺血模型來評價毛萊總苷是否有改善心肌缺血的作用，結果表明，400mg/kg體重劑量和200mg/kg體重劑量的毛K總香均能抑制心肌缺血出現的小鼠心電圖T波抬高，對垂體後葉素引發小鼠的心肌缺血有保護作用。5結論毛裡總苷對垂體後葉素所致實驗小鼠的心肌缺血有保護作用。實施例4毛蒗總苷調血脂實驗1.1受試藥物毛莨總苷，實施例1製得，以齊墩果酸為標準，含量為60。/。，實驗時，根據實際需要用生理鹽水配製成適當濃度,備用。1.2動物SPF級SD大鼠，由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號由廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號SCXK(粵)2003-002,粵監證字2004A021,體重130150g,雌雄各半。2方法和結果取SPF級SD大鼠60隻，體重130~150g，雌雄各半，隨機均分6組，每組10隻，即分為正常組，模型組，毛萊總苷高、中、低劑量組(即分別為400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg)，陽性對照組；共6組。實驗開始時，正常組用普通飼料，後5組用高脂飼料餵養(高脂飼料處方1%膽固醇、0.5%膽鹽、0.2%丙基硫氧嘧啶、2%豬油、5%黃豆粉、1%雞蛋和魚粉、2%蛋黃粉、88.3%基礎伺料)，18天後，開始Po給藥，正常組不作任何處理，模型組Po生理鹽水，毛萊總苷低、中、高劑量組和陽性對照組每天給藥一次，連續10天，末次給藥後24小時，取血測定TC、TG、LDL-C，結果列於表3。表3毛萊總苷對試驗性大鼠高脂血症的影響(11=10)iUfSLDL-C(mg/kg)(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)與模型組比較*,p<0.05;**,p<0.01與正常組比較#,p〈0.05;##,p<0.01;#^,p<0.001由表3可見模型組與正常組比較，TC、TG、LDL-C四個指標差異均有—2.39±0.660.83±0.240.28±0.10—23.98±8.01扁1.17±0.34#8.38±3.91###40016.68±9.36*0.74±0.38*5.63±2.37*20015.73±10.16*0.61±0.25**5.42±4.8810022.18±11.560.96±0.538.66±5.4710017.83±4.23*0.77±0.29**5.83±1.23*香苦香組組總總總康常型萊萊復脂正模毛毛毛血統計學意義，說明大鼠高脂血症模型是成功的。給藥組與模型組比較，毛萊總苷高、中劑量組對TC、TG、LDL-C三項指標均有顯著降i氐作用，^提示毛莨總苷對高脂血症有較好的防治作用。權利要求1.毛茛總苷應用於製備治療心絞痛藥物製劑。2.毛茛總苷應用於製備治療動脈粥樣硬化藥物製劑。3.如權利要求1或2所述的應用，其特徵在於所述的藥物製劑是目前適用於人體使用的藥物製劑。4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於所述藥物製劑為注射劑、口服製劑或外用製劑。全文摘要本發明公開了毛茛總苷的新用途，具體是應用於製備治療心絞痛的藥物製劑或治療動脈粥樣硬化的藥物製劑。現有治療藥物中，大部分藥物作用靶點單一，本發明將毛茛總苷應用於製備抗心絞痛、抗動脈粥樣硬化藥，具有抑制血管平滑肌增生、抗心肌缺血和調血脂多方面的作用，為該專業
技術領域：
提供了一種新的有效的藥物。文檔編號A61K36/71GK101530482SQ20091003885公開日2009年9月16日申請日期2009年4月21日優先權日2009年4月21日發明者王來友,王榕樂,王素軍,譚毓治,晉趙申請人:廣東藥學院