耐鹽植物的育種方法

2023-05-15 04:00:41

專利名稱：耐鹽植物的育種方法
技術領域：
本發明涉及耐鹽植物的育種方法，是利用一種新的外源DNA導入手段，提高受體植物的耐鹽性，進而育成能在鹽鹼地生育的耐鹽性作物。它屬於生物工程技術領域，也屬於農業生物技術領域。
土壤鹽漬化是影響農業生產和生態環境的重要因素之一。據統計全世界的鹽鹼地約佔陸地總面積的三分之一(Epsteint,1983)，我國有鹽鹼地約一億畝，沿海窪地約5500萬畝，且有逐年增加的趨勢(中國海洋高技術研究開發專題報告，1992)。在人口不斷增加，耕地日趨減少和淡水資源不足的壓力下，選育適於鹽鹼地種植，並能耐受海水倒灌或海水浸漬的耐鹽作物品種，是開發利用大面積鹽鹼土的重大課題，也是生物科學技術急需解決的重大課題。
用傳統的方法進行耐鹽作物的選育，至今尚未選育出真正的耐鹽品種。隨著分子生物學技術的發展，人們寄希望於基因工程育種，目前不少實驗室從糖、胺基酸、甜菜鹼等可以調節細胞滲透壓的低分子有機化合物出發，將其合成途徑中有關的重要酶基因轉移到作物中，以提高作物的耐鹽性(Serrano,R.et al,Critical Reviews inPlant Sciences,1994,13(2):121-138；McCue,K.F.et al,Plant MolecularBiology,1992 18:1-11)。如陳受宜等已將黑麥脯氨酸合成酶基因(ProA)導入菸草和百脈根中，將甜菜鹼醛脫氫酶基因(BADH)導入到草莓和菸草，轉基因植物的耐鹽性有明顯提高(陳受宜等中國科學1991,2:127-145；張勁松等中國科學1995,11:1172-1177)；美國北卡羅來納大學發現0.25-0.4M NaCl能促進水稻內源性ABA增加和Em基因的表達(Qratrano R.S.et al,Plant Physiol.1992 98 1356-1363)；Nomura等將大腸桿菌合成甜菜鹼的bet基因簇導入到淡水蘭藻，在0.4M NaCl條件下，細胞內積累的甜菜鹼提高到約80mM，而對照在這種條件下不能生長(Nowura M.et al,PlantPhysiol.1995 107:703-708)；與抗滲透脅迫有關的基因還有CAM酶、PEP羧化酶、丙酮酸磷酸雙激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等基因(Mitchll C.T.et al,Science 1993259(22):508-510)。研究表明除了這些低分子有機化合物在細胞內的積累可以提高植物的抗鹽性之外，某些蛋白質也有類似作用。1987年Singh首次報導了一種調滲蛋白(Osmotin,OSM)(Singh N.K.et al,Plant Physiol.1987,85:529-536)，並很快成為研究的熱點；最近美國和伊朗有人從生活在死海中的H.marismortui分離到一種鐵氧還蛋白(ferredoxin)，並對其結晶構造進行分析，由於其結構的特異性而對水分子有異常高的結合能力，因而能在高鹽條件下生存(Nat.Struce.Biol.3,452 1966)。雖然這類的研究報告不少，也克隆了一些蛋白質基因，然而由於生物學功能和調節背景尚不清楚，目前還難於利用。
由於植物耐鹽機制十分複雜，涉及到一系列形態結構和代謝過程的變化，目前尚不清楚植物的耐鹽性究竟涉及多少基因，這也是目前通過轉移單個基因只能部分提高耐鹽性的原因。
本發明的目的是為選育適於鹽鹼地種植，並能耐受海水倒灌或海水浸漬的耐鹽作物品種，確立有效、安全、實用的耐鹽植物分子育種方法。
為實現本發明目的所採取的技術措施是將鹽生植物(紅樹、鹽藻等)作為耐鹽基因供體，培育耐鹽作物的重要種質資源庫，將其總DNA片段，通過花粉管通道導入到蔬菜作物如豇豆、茄子、辣椒中，經GUS基因表達檢測、核酸BAPD分析、蛋白質SDS-PAGE等檢測，證明外源DNA導入後，在受體植物中能夠表達；通過細胞學、生理學、遺傳學分析，DNA導入後的受體植物發生了一定的變化，並能穩定遺傳；進一步通過供體植物cDNA文庫的建立，識別與分離有關耐鹽基因。同時，在鹽生植物紅樹、鹽藻的總DNA片段導入到受體植物後，後代的篩選和培育是後代在一定的鹽脅迫條件下篩選，選育出能在海灘種植、用1∶3海水或直接用海水澆灌，並能正常開花結實的高耐性植物。
在以蔬菜為研究模型植物的基礎上，逐步擴大到水稻、糧油、花卉等植物。
本發明與已有技術相比已達到的技術效果本發明將外源DNA片段導入蔬菜作物中，得到耐鹽性顯著提高的蔬菜作物，這在國內外是首次報導。具有如下特點1．保持了DNA導入的受體植物的品種特性，即導入外源DNA後的茄子、豇豆等還是茄子、豇豆；2．導入外源DNA後的植物的耐鹽性顯著增加，能在海灘種植和用海水澆灌，而對照植株則不能在這種鹽脅迫條件下生存；3．外源DNA供體一紅樹、鹽藻的DNA是採用CTAB法進行提取的，而我們選用的這一種紅樹的果實和鹽藻是可以食用的，安全無毒；4．外源DNA導入材料的篩選方法簡單易行，只需在一定的鹽脅迫條件下種植，就可篩選到耐鹽的植物。
國內外有一些導入單個基因提高植物耐鹽性的報導，但沒有看到通過這種方法得到轉基因植物並能在海灘種植和用海水澆灌的報導，在國際上我們的研究工作是首創，1995年國家科委基礎研究高技術司組織專家鑑定認為「耐鹽豇豆分子育種技術的建立，這一成果在耐鹽植物分子育種方面居國內外同類研究的先進水平」。
實施例一、耐鹽茄子分子育種方法1．材料和方法1.1供體海岸植物紅樹(Rhizophora apiculata，紅樹科，喬木)受體日本富士紫長茄(Solanum melongena)1.2紅樹DNA的提取按照本實驗室建立的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法進行，製得的DNA，紫外檢測其A260/A280≥1.8，分子量約50Kb。
1.3外源DNA導入茄子的方法基本上按照周光宇的方法(Methods in Enzymology,1983,101:433-481)，略加改進。關鍵是需要摸索受體植物在自花授粉或人工授粉後導入外源DNA的最佳時間和方式，以保證一定的導入率。
1.4後代的耐鹽性篩選導入外源DNA獲得的當代種子稱為D1代種子，用其培育的植株稱為D1代植株，依次類推。種子先在盆中用淡土育苗，待株高約10-12cm，有5-6個葉片時，移至海灘地，生長穩定後，用海水直接澆灌。海灘地沙質土壤基礎含鹽量為0.3-0.4％,pH值為7.0-7.2，海水含鹽量約2.5-3.0％。
1.5植株生長情況測定平均株高、存活率、葉面積、結實率、單株產量等。
1.6若干生理指標檢測測定葉片的Na+、K+、Ca++含量、葉片蒸騰速率、光合速率、滲透勢等。
1.7光鏡、電鏡觀察2．結果2.1 DNA導入後的結實情況在茄子開花當天上午8-9時進行人工授粉，授粉後10-24小時導入外源DNA,132朵花獲得78個果實，結實率為59.1％。果實與種子的形態特徵與對照植株基本相同。
2.2若干生理生化特性變化對D1代植株葉片的蒸騰速率、光合速率、Na+含量進行了測定。在0.8％NaCl鹽水澆灌條件下，白天的蒸騰速率、光合速率均比鹽水澆灌和淡水澆灌的對照植株低。葉片的Na+含量，D1代植株比淡水對照植株高，但比鹽水對照植株低24.4％，表明D1代植株通過降低蒸騰和光合作用速率，使葉片內的Na+含量下降，達到一定的拒鹽能力。
2.3氣孔開放特性對照植株在淡水和海水澆灌條件下，葉片的氣孔在白天都是開放的。而D1代植株在海水澆灌下，在白天氣孔卻幾乎全部關閉，這一特性對於降低蒸騰，減少水分損失是有作用的。
2.4後代植株的耐鹽性在普通土壤地育苗，待幼苗長到10-12cm、5-6片葉片後，移植到海灘試驗地，生長穩定後用海水澆灌。結果表明澆海水50天，對照植株死亡80％，僅有少數植株存活，雖有結實，但發育不正常；D1代植株在海水澆灌50天後，存活率達65％，株高和每株葉片數均比對照植株高，單株產量顯著高於對照植株，D1代單株平均產量達到對照植株的2.4倍。
本試驗結果表明，通過花粉管通道導入耐鹽植物的DNA能夠提高受體植物的耐鹽性。這種耐鹽性的提高與植物的氣孔關閉、蒸騰、呼吸作用等一系列生理過程的改變有關。由於植物的耐鹽機制十分複雜，這方面的工作有待進一步深入。
我們得到的導入紅樹DNA的茄子，D1代植株能種植在基礎含鹽量0.38％的海灘地，用含鹽2.8％的海水澆灌50天後存活率高達65％。這充分表明D1代植株的耐鹽能力明顯增強，說明這種方法是一種有效的耐鹽植物分子育種的方法。二、紅樹DNA導入辣椒及RAPD和SDS-PAGE分析以海岸耐鹽植物紅樹Rhizophora apiculata，紅樹科，木本)作為供體，用相同的上述方法將紅樹DNA通過花粉管通道直接導入栽培辣椒，獲得了耐鹽能力明顯增強的後代。在1∶3海水或含鹽0.8％的條件下，約50％的後代植株能開花、結果，而普通蔬菜的生長極限鹽度一般在0.06-0.2％之間。對該組合的受體、供體及轉化後代進行隨機擴增多態性分析(Random Amplified Polymorphic DNA，簡稱RAPD)，在近30個引物中，發現Operon K01(5』-CATTCGAGCC-3』)引物得到的後代(D2)擴增產物有一條1.1Kb的特異性DNA譜帶，該譜帶是受體中沒有的，而與供體DNA的擴增產物的一條譜帶相同。對導入外源DNA的後代和受體(對照)株的葉片可溶性蛋白質進行SDS-PAGE分析，發現在鹽脅迫條件下，導入外源DNA的辣椒後代(D2)產生了一條新的17.5KD蛋白質譜帶。經RAPD和SDS-PAGE分析，分別獲得DNA特異譜帶和新的蛋白質譜帶，表明外源DNA已進入辣椒轉化株的基因組。
權利要求
1．一種利用生物技術將外源DNA片段導入到作物體內的耐鹽植物育種方法，其特徵在於從耐鹽性高的鹽生植物紅樹、鹽藻提取總DNA，經花粉管通道導入到包括蔬菜、水稻的作物中，經包括GUS基因表達檢測、核酸RAPD分析、蛋白質SDS-PAGE檢測，證明外源DNA導入後，在受體植物中能夠表達；通過細胞學、生理學、遺傳學分析，DNA導入後的受體植物發生了一定的變化，並能穩定遺傳；進一步通過供體植物cDNA文庫的建立，識別與分離有關耐鹽基因。
2．按權利要求1所述的耐鹽植物育種方法，其特徵在於鹽生植物紅樹、鹽藻的總DNA片段導入到受體植物後，後代的篩選和培育技術，它是後代在一定的鹽脅迫條件下篩選，選育出能在海灘種植、用1∶3海水或直接用海水澆灌，並能正常開花結實的高耐鹽性植物。
全文摘要
本發明是利用一種新的外源DNA導入手段,提高受體植物的抗鹽性,進而育成能在鹽鹼地生育的耐鹽植物的育種方法。它是將鹽生植物紅樹、鹽藻的總DNA片段通過花粉管通道導入如豇豆、茄子、辣椒等蔬菜作物,經耐鹽篩選和培育,首次得到能在海灘種植,可以用1∶3海水或直接用海水澆灌的茄子、辣椒。這是首創、快速有效的耐鹽植物分子育種方法,表明通過DNA(基因)重組,受體植物可以獲得DNA供體植物的某些特性。它具有顯著的經濟效益和社會效益。
文檔編號C12N15/82GK1230593SQ9812168
公開日1999年10月6日 申請日期1998年12月1日 優先權日1998年12月1日
發明者林棲鳳, 李冠一 申請人:海南大學