用於校正傳感器元件的方法和裝置的製作方法

2023-05-15 06:14:46 3

專利名稱：用於校正傳感器元件的方法和裝置的製作方法
用於校正傳感器元件的方法和裝置 本發明涉及用於校正傳感器元件的方法和裝置，尤其是用於校正在微陣列裝置上 的傳感器元件的方法和裝置。在核酸分析技術中，基於微陣列的方法的發展在過去幾年裡取得了快速的進步。 微陣列裝置是探針分子矩陣的裝置，探針分子安置在傳感器上的單個且可尋址的位置中， 從而陣列裝置中的每個位置形成能探測目標分子的傳感器元件。在核酸分析技術中，通常 使用寡核苷酸探針作為探針分子，該探針分子例如在晶片形式的裝置中固定(「點(spot)」) 在載體上的柵格狀矩陣裡。通過與互補的目標核酸雜交在寡核苷酸探針上形成結合。然後 能用很多可選擇的方法檢測這種結合，從而能夠基於結合事件的獲知目標核酸(Z)的存在 和如有必要的話也定量確定目標核酸(Z)的存在。光學方法、電化學方法、重量分析方法、 磁學方法和其他的合適的方法可以用作探測原理。在光學方法中，通過標記物標記目標核酸及由寡核苷酸探針和目標核酸形成的雜 交物，標記物導致產生了光可檢測的信號。標記物可以是染料、螢光團、生色團、嵌入染料、 螢光染料或者類似物。結合事件發生時，在每個寡核苷酸探針的可尋址位置上光可檢測的 信號可以通過例如CCD照相機檢測到，該CCD照相機能夠描繪整個陣列。在電化學探測方法中，寡核苷酸探針固定在電化學傳感器上。通過標記物標記目 標核酸及由寡核苷酸探針和目標核酸形成的雜交物，其中，每個寡核苷酸探針位置上的標 記物局部地改變傳感器元件的電化學特性，從而能夠測量電信號，例如電壓、電流、電容變 化等等。相關方法可以從DE 101 26 341中獲知。這裡用生物素標記目標核酸，在目標核 酸與寡核苷酸探針雜交之後，用抗生蛋白鏈菌素-鹼性磷酸酶標記已經結合的目標核酸， 並向鹼性磷酸酶提供酶底物，磷酸酶使酶底物在轉化時產生局部改變導電性的產物，從而 在其上固定了寡核苷酸探針的電極上可測量到局部的電流增加。在重量分析法中，檢測因目標核酸和寡核苷酸探針雜交時的質量改變而產生的信 號。已知的是，例如，所謂的FBAR方法和Kantilever方法。在磁學檢測中，寡核苷酸探針固定在磁傳感器元件上，例如，GMR傳感器。目標核 酸及由寡核苷酸探針和目標核酸形成的雜交物可以用順磁性粒子(例如氧化鐵納米粒子) 標記，從而在結合目標核酸時在寡核苷酸探針位置上可檢測到局部的磁性改變。在所有的檢測原理裡出現的問題是如下的事實各個傳感器元件間會出現質量差 另IJ，這正好在高靈敏和量化或者半量化的測量方法時會導致強度不同的信號。也會因為其 他的外部影響(例如溫度波動或溫度梯度)，因為傳感器的表面流體學導致的流動波動或 者流動梯度和其他的因素，導致不是所有的在微陣列裝置中的傳感器元件都具有相同的靈 敏度或者在相同濃度的目標核酸(Z)時產生相同信號強度的信號。例如已知的是，位於微 陣列裝置邊緣的傳感器元件和位於微陣列裝置中間的傳感器元件具有不一樣的表現行為。可靠的和無誤的基於微陣列的陣列運作需要同樣是可靠的和無誤的質量控制 (QualitStskontrolle)。首先其必須包含必要的陽性對照元件和陰性對照元件。為此，在理想 的情況下應該通過兩點校正法來校正每個傳感器元件，這就是說，每個傳感器除了裝有待 測試樣之外還裝有兩個已知的試樣(試樣濃度)，並記錄下每個測量信號。
這樣的方式尤其對於有高比例的傳感器元件或可尋址位置的微陣列系統是非常 難以實現的，因為兩點校正系統通常要求複雜的和高費用的措施。在本領域內已知的是，這 個問題可以通過在微陣列裝置中設置不同的傳感器元件位置作為對照傳感器元件(對照 點(Kontroll-Spot))來解決或者避免。然而這有如下的缺陷，此時必須假設不同傳感器的 表現行為絕對一致，並且設置的對照點代表所有的傳感器元件。
本發明的任務是實現簡單的和成本低廉的兩點校正法，該方法可以在同樣的傳感 器元件上實施，這種傳感器元件也用作目標核酸的傳感器。根據本發明，這個目標通過權利 要求1所述的方法和權利要求14所述的裝置得以實現。在從屬權利要求中描述了本發明 的有利的改進方案。本發明涉及校正傳感器元件的方法，傳感器元件具有固定的寡核苷酸探針，傳感 器通過所述寡核苷酸探針檢測(erfassen)目標核酸(Z)的結合，該方法包括a)使傳感器元件接觸對照核酸(K)，對照核酸的解鏈溫度Tm(K)低於目標核酸的 解鏈溫度Tm (Z)；b))在溫度T[p] Tm(K)，並獲得陰性對照信號。本發明進一步涉及根據權利要求1的校正傳感器元件的方法，包括a)使傳感器元件接觸包含對照核酸(K)和目標核酸(Z)的混合物，其中，對照核酸 的解鏈溫度Tm⑷低於目標核酸的解鏈溫度Tm(Z)；bl)在溫度T[p] < Tm⑷時使混合物雜交至寡核苷酸探針上，獲得陽性對照信 號；b2)在測量溫度T = T [測量]時改變嚴緊條件，使得Tm(K) < T [測量] Tm⑷，並獲得陰性對照信號。Tm(K)是在提供的溶液條件下對照核酸的解鏈溫度。Tm(Z)是在提供的溶液條件下目標核酸的解鏈溫度。T[η]是實施陰性對照信號測量的溫度。T[ρ]是實施陽性對照信號測量的溫度。T [測量]是實施測量信號測量的溫度。優選通過提高溫度實現改變嚴緊條件。或者，可以通過改變溶劑條件或者通過改 變溶劑條件和溫度的組合實現改變嚴緊條件。按照本發明的另一個方面，在不同的溫度T[測量1-η]時測量多個測量信號1至 η，其中 Tm(K) < T[測量 1-n] < Tm(Z)。按照本發明的另一個方面，該方法可以針對設置在陣列裝置中的大部分傳感器元 件而實施。按照本發明的另一個方面，目標核酸和對照核酸可以用可檢測的標記物進行標記。目標核酸和對照核酸可以直接標記(例如，用染料、酶或者類似物)，也可以間接 標記(例如，通過生物素、帶有標記物的二級結合配偶體(sekundarerBindimgspartner)的識別序列或者類似物)。根據本發明的另一個方面，可檢測標記物可以是酶標記物，其可以使底物轉化成 傳感器元件可檢測的產物。根據本發明的另一個方面，可以在步驟(a)之前使傳感器元件接觸可檢測產物， 以便獲得第一校正信號。根據本發明的另一個方面，可以在另一傳感器元件上，分別在溫度T[p]、T[測 量]、T[測量1-η]和Τ[η]時附加獲得溫度補償信號，可檢測標記物直接固定在該另一傳感 器元件上。根據本發明的另一個方面，傳感器元件是電化學傳感器元件，目標核酸和對照核 酸用可檢測標記物進行標記，該標記物是酶標記物，其使底物轉化成傳感器元件可檢測的 產物。酶標記物尤其可以是磷酸酶。根據本發明的另一個方面，優選地，對照核酸(K)的解鏈溫度Tm(K)比目標核酸 (Z)的解鏈溫度Tm(Z)至少低5°C，更優選地，對照核酸(K)的解鏈溫度Tm(K)比目標核酸 (Z)的解鏈溫度Tm(Z)至少低10°C。根據本發明的另一個方面，優選地使用具有隨機化的十聚核苷酸序列 (Decaoligonukleotidsequenz)的核酸組合物作為對照核酸。也可以使用隨機化的6、7、8、 9、11、12、13、14或者15聚物。特別優選的是生物素化的寡聚物。帶有特異性識別序列的對 照核酸同樣是可能的，這種特異性識別序列結合至傳感器元件的寡核苷酸探針的特異性互 補序列上，其中，寡核苷酸探針上的互補序列不結合至目標核酸上。此外，本發明涉及一種裝置，該裝置包括-至少一個傳感器元件，該傳感器元件具有固定在上面的核苷酸探針，所述傳感器 元件通過該核苷酸探針檢測目標核酸的結合，其中寡核苷酸探針和目標核酸的結合複合物 具有解鏈溫度Tm(Z)；_用於改變傳感器元件溫度的加熱和/或冷卻手段；-至少一種對照核酸，其能和核苷酸探針形成結合複合物，所述結合複合物具有低 於Tm (Z)的解鏈溫度Tm(K)。根據本發明的另一個方面，該裝置還包括大部分的設置在陣列裝置中的傳感器元 件。傳感器元件可以作為微陣列(例如，生物晶片)提供。陣列裝置可以作為微流體設備 (mikrofluidische Vorrichtung)的一部分得以實現。微流體設備是這樣一種設備在該 設備中，能夠在微升體積範圍內操作流體，特別是液體。根據本發明的另一個方面，裝置中的對照核酸以幹試劑的方式儲存。對照核酸通 過引入相應的溶劑(例如，緩衝溶液)溶解，然後能與寡核苷酸探針結合。根據本發明的另一個方面，該裝置以試劑盒(Kit)的形式提供，該試劑盒包含設 備和組合物，所述設備包含加熱和/或冷卻手段以及至少一個傳感器元件，所述組合物包 含對照核酸。根據本發明的另一個方面，對照核酸用可檢測標記物進行標記。根據本發明的另一個方面，可檢測標記物是酶標記物，其可以使底物轉化成傳感 器元件可檢測的產物。
根據本發明的另一個方面，可檢測標記物直接固定在另一傳感器元件上。根據本發明的另一個方面，該裝置的傳感器元件是電化學傳感器元件，對照核酸用可檢測標記物進行標記，所述標記物是酶標記物，其使底物轉化成傳感器元件可檢測的產物。根據本發明的另一個方面，該裝置包括作為對照核酸的核酸組合物，其包含隨機 化的十聚核苷酸序列。根據本發明的另一個方面，該包含隨機化的十聚核苷酸序列的核酸是生物素化 的。就本發明而言，傳感器元件是在目標核酸(Z)結合到與傳感器元件聯合的寡核苷 酸探針上時能獲得測量技術可用信號的元件。這種信號可以是定性或者定量的信號。這種 信號優選為定量的，這就是說，信號強度與結合的目標核酸的量相關聯。寡核苷酸探針是一種作為探針結合目標核酸用的寡核苷酸。作為寡核苷酸探針優 選地是單鏈核酸。核苷酸探針可以由DNA、RNA或者合成的或修飾的核酸類似物構成。寡核 苷酸探針優選地具有確定的序列。優選地，寡核苷酸探針具有大於10個核苷酸的長度，更 優選地具有大於20個核苷酸的長度。「固定的」寡核苷酸探針表示的是這樣一種核苷酸這 種核苷酸在空間上被固定在傳感器元件上或者在空間上離傳感器元件足夠近地被固定，以 至於在傳感器元件探針上進行測量的條件下，保持其在傳感器元件上的位置或者離傳感器 元件足夠近的位置。這種寡核苷酸探針能直接設置在傳感器元件上，例如，在電化學傳感器 元件的電極上或者離傳感器元件在空間上相當的近，也可以是間接的，例如，通過間隔分子 固定或者通過隔室固定，也就是說，通過定界(Abgrenzung)或者包囊(Umschlie β ung)固 定。對照核酸就本發明而言是同樣能雜交至寡核苷酸探針的核酸，其中，寡核苷酸探針和對 照核酸(K)的雜交物總是具有比寡核苷酸探針和目標核酸(Z)的雜交物更低的解鏈溫度。 這通常通過如下得以實現，對照核酸與寡核苷酸探針雜交的互補鏈的長度短於目標核酸與 寡核苷酸探針雜交的鏈長。接下來更詳細地解釋這方面。術語「雜交」包括在可以通過互 補鏈形成雜交物的條件(溫度、PH值、緩衝液組成、鹽濃度)下使兩個核酸(例如，寡核苷 酸探針和對照核酸)接觸。術語「獲得信號」包括所有必要的步驟和前提，以便能在傳感器元件上導出顯示核 酸結合至與寡核苷酸探針的信號。在直接標記時，用染料標記目標核酸，信號可以例如直接 通過CCD照相機獲得。在間接標記時，例如，通過目標核酸或者對照核酸的生物素化時，就 本發明而言，術語「獲得信號」包括所有其他必需的步驟(用抗生蛋白鏈菌素_酶複合物的 溫育過程、清洗步驟、用酶底物溫育的過程和測量信號的測量)。就本發明而言，陽性對照信號是在具體提供的條件下(溫度等等)相應於最大信 號強度的信號，且該信號強度能在傳感器元件上輸出。這例如是這樣的情況所有的單個寡 核苷酸探針分子均已結合了結合配偶體的情況。在本發明上下文中術語「陰性對照信號」是對於各傳感器元件在具體測試條件下 相應於最小信號或者背景噪音的信號。這例如是這樣的情況沒有一個寡核苷酸探針分子 在獲得信號時已結合了結合配偶體。陣列裝置表示若干傳感器元件的裝置，傳感器元件設置在若干可尋址位置子上。可檢測標記物在本發明的上下文中表示如下的標記物，通過這種標記物能夠直接或者間接地獲得可測量信號。該標記物可以是直接標記物，例如，染料、螢光染料、放射性標 記等等。同樣地，術語可檢測標記物也包括間接標記，在間接標記時為了獲得可測量信號需 要其他的步驟，例如，生物素標記、抗體標記、酶標記等等。寡核苷酸探針鹼對的序列和其長度取決於很多的考慮。寡核苷酸探針序列的長度 不能超過確定的長度。寡核苷酸探針和目標核酸的雙鏈體的解鏈溫度隨著寡核苷酸探針長 度的增加而升高。解鏈溫度(Tm)是當寡核苷酸探針從目標核酸中熔解(解鏈)的溫度，換 一種說法，在低於其解鏈溫度時，寡核苷酸探針與目標核酸雜交。核酸雙鏈的解鏈溫度在穩 定的外部條件(溶劑條件)總是不僅取決於其長度也取決於其核苷酸組成。G-C鹼基對通 過三個氫橋得以穩定，T-A鹼基對僅通過兩個氫橋得以穩定。因此G-C鹼基對「更穩定」。 解鏈溫度隨著G核苷酸和C核苷酸的數目的增加更大程度地升高。有很多方法計算解鏈溫 度，結果均以。C表示GC方法是簡單的但是不準確的方法
Tm(°C ) = (64+41*(% GC-16. 4)) °C其中％ GC是G鹼基和C鹼基在鹼基總數中的比率。「鹽調節的(salt adjusted) 」方法較準確，其涉及反應物中的Na+離子濃度Tm(°C ) = (100. 5+41*% GC-(820L)*16. 61og[Na+]) °C其中L是鹼基的總數，[Na+]表示Na+離子濃度。另一個方法是「鹼基堆積」方法，在該方法中雜交時形成螺旋的焓項和熵項均考慮 在內。溶劑的其他組成部分對解鏈溫度也有影響。尤其是當使用甲醯胺調控雜化條件 時。使用以下公式考慮這些參數來估算溫度Tm = 81. 5+0. 41*(% GC)+16. 61og[Na+]-(820:L)-0. 61*(% 甲醯胺)_1· 錯 配)其中％錯配=錯配鹼基的比例。雜化溫度最佳地應該低於DNA/DNA雜交物的解鏈 溫度約5-10°C，在DNA/RNA雜交物的情況下5°C就足夠了。當序列更短時使用其他近似公式。為了估算雜化溫度，在實踐中，(4+2)規則得 到了證實每個胞嘧啶和每個鳥嘌呤計4°C，每個腺嘌呤和每個胸腺嘧啶核苷計2°C。這個 總和減去5-10°C得出大約的雜化溫度。各種近似計算解鏈溫度的公式表明，除了探針長度 (互補區域的長度)之外，GC含量、鹽濃度和溶劑性質也決定解鏈溫度。參數的組合構成了 嚴緊條件，其決定了兩個互補的或者至少部分互補的核酸鏈是否可以雜交。相應地可以通 過溫度、鹽濃度、溶劑參數的變化改變嚴緊條件，並調控雜交(也稱為「復性」)和雙鏈的解 鏈或者熔解。同時也存在很多可以用來計算序列的解鏈溫度的軟體。現在參照實施例和


性且示例性地描述本發明。各附圖表示圖1 使用本發明方法的示例性傳感器元件的示意2 本發明的第一實施方式的示意圖；圖3 本發明的另一實施方式的示意圖；圖4 本發明的另一實施方式的示意圖；圖5 本發明的另一實施方式的示意圖6 本發明的另一實施方式的示意圖。在圖1中是示例的具有測量裝置(帶有兩個電極2和3)的傳感器元件，其中存在 附加的金平面(GoWfMche) 5，寡核苷酸探針100固定在金平面5上。或者，相應的寡核苷 酸探針也能直接地固定在電極2、3上。例如，在DE10126 341 Al中詳細地描述了相應的傳 感器元件。
圖1示意了具有平坦表面的基底1，其例如由矽晶片的晶體表面得以構成。在基 底1上，在給定的陣列位置上實現電化學探測器2、3的陣列，通過電化學探測器2、3得以用 酶偶聯反應進行生物分析研究。具體地，在生物分析研究中，寡核苷酸探針標為100，分析 物分子標為200，所謂的酶標記物標為300。寡核苷酸探針100特異性地與互補分析物分子 200 (該分子可以是目標核酸或者對照核酸)反應，並且酶標記物300以陣列位置特異性的 方式固定。接著通過酶標記物的催化作用使酶底物400轉化成產物500。在傳感器元件上藉助電極2、3可測量到底物/產物的減少/增加。作為可檢測產 物500的實例可以提到對氨基苯酚/醌亞胺氧化還原對 對氨基苯酚醌亞胺2個電子以及2個H+離子參與了相應的氧化還原過程。這個系統可以應用於例如酶偶聯的檢測反應中。這裡，酶「鹼性磷酸酶」作為標記 物和強化物質被應用。鹼性磷酸酶能夠使對氨基苯基磷酸酯分解成對氨基苯酚和磷酸鹽。 對氨基苯基磷酸酯相應的對氨基苯酚在電極系統裡被氧化，氨基苯酚/醌亞胺氧化還原形成循環。 然後，信號可以作為在反應時間⑴內的電流強度⑴的增加在電極上輸出，其中，信號強 度 S = dl/dt。在圖2中示出了本發明的第一實施方式的示意圖。在T[p] Tm(K)。寡核苷酸探針和對照核酸的雙鏈體解鏈，以至於 對照核酸被釋放並能(和酶一起)漂洗除去。在溫度Τ[η]時，所有的寡核苷酸探針再次不 飽和的，以至於沒有測量到信號(_)或者只測量到噪音信號，並得到最弱的信號作為陰性 對照信號。陽性對照信號和陰性對照信號的數值可以存儲在，例如，控制設備中，所述數值能 進一步用作將來的參考數值。可以用這種方式對微陣列的各個位置進行具體的校正，每個 陣列位置(每個「點」)通過圖2中描述的方法校正。這也可以用於微陣列的質量控制。在圖3中顯示了另一實施方式的示意圖。傳感器元件上加載有試樣，假定該試樣 含有適合相應寡核苷酸探針的目標核酸(Z)。此外添加對照核酸(K)。溫度是T [P] < Tm(K)， 其中Tm(K)是在給定的溶劑條件下寡核苷酸探針和對照核酸的雙鏈體的解鏈溫度(附加 地，Tm(K) <Τ[Ζ])。由目標核酸和對照核酸形成的混合物的濃度足夠的高，以至於所有自 由的寡核苷酸探針能被目標核酸或者對照核酸飽和。在溫度Τ[ρ]時，目標核酸和對照核酸 雜交至所有的游離的寡核苷酸探針。用生物素(B)標記對照核酸。然後添加抗生蛋白鏈菌 素結合的酶(E)，該酶結合生物素(B)並可以轉化底物(未顯示)，從而在傳感器元件上輸 出信號(+)。在溫度Τ[ρ]時所有的寡核苷酸探針被目標核酸或者對照核酸飽和，從而得到最 強的信號作為陽性對照信號。接著將溫度T [測量]提高至Tm⑷<Τ[測量] Tm (Z)。寡核苷酸探針和目標核酸的雙鏈體或者說雜交 物現在也解鏈，以至於目標核酸被釋放並能(和酶一起)漂洗除去。在溫度Τ[η]時，所有 的寡核苷酸探針再次為不飽和的，以至於測量不到信號(_)或者只測量到噪音信號，得到 最弱的信號作為陰性對照信號。目標核酸的信號強度數值S(Z)例如然後能通過與陽性對照信號和陰性對照信號 的關係來表達，例如，根據如下公式S [Ζ] = (S [測量]-S [η]) / (S [ρ] -S [η])
用這個方法可以在每次測量時同時進行傳感器元件的校正，這實現了特別高的準確度。比如如下選擇對照核酸的序列通過比目標核酸更短的互補序列使對照核酸結合 至寡核苷酸探針。或者，對照核酸也可以具有比目標核酸更少的GC含量，或者具有更少的 GC含量和更短的互補連結序列的組合。這在圖2至圖6中僅示意性描述。僅基於清楚的原 因示意的是具有5對結合鹼基對的目標核酸和有2對結合鹼基對的對照核酸。優選地，目標核酸通過具有15個或者更多個結合鹼基對的區間進行結合，更優選地，目標核酸通過具 有30個或者更多個結合鹼基對的區間進行結合。當目標核酸通過具 有大約20到25個鹼基的互補區間結合至寡核苷酸探針上時， 對照核酸可以選擇例如具有6至12鹼基的長度的互補區間。可以選擇這樣的目標核酸該 目標核酸在互補區間上部分地具有與目標核酸一致的序列，從而該序列通過寡核苷酸探針 上的與目標核酸部分相同的核苷酸進行結合。使用具有隨機化的序列的短鏈寡聚物作為對 照核酸也是值得考慮的，例如，隨機化的六聚物(Hexamer)、隨機化的十聚物(Decamer)或 者類似的。根據備選的實施方式，寡核苷酸探針具有不能雜交至目標核酸而是只能雜交至對 照核酸的序列的區間。根據另一實施方式，這種區間可以通過間隔序列從結合目標核酸的 序列隔離開來，以至於甚至可以使目標核酸和對照核酸同時結合至寡核苷酸探針。這例如 在圖4中所描述，這裡在寡核苷酸探針上，不僅較短的對照核酸而且較長的目標核酸都能 結合至寡核苷酸探針的不同區間上。除此之外，圖4的方法根據圖3的方法實施。在圖5中顯示了本發明另一實施方式的示意圖，這裡測定目標核酸(Z)的熔點曲 線。傳感器元件上加載有試樣，假定該試樣含有適合相應寡核苷酸探針的目標核酸(Z)。此 外如根據圖3的方法添加對照核酸⑷。溫度是T[p] < Tm(K)，其中Tm⑷是在給定的溶劑 條件下寡核苷酸探針和對照核酸的雙鏈體的解鏈溫度。由目標核酸和對照核酸形成的混合 物的濃度足夠的高，以至於所有自由的寡核苷酸探針能被目標核酸或者對照核酸飽和。在 溫度Τ[ρ]時，目標核酸分子和對照核酸分子雜交至所有的游離的寡核苷酸探針。用生物素 (B)標記對照核酸。然後添加抗生蛋白鏈菌素結合的酶(E)，該酶結合生物素(B)並可以轉 化底物(未顯示)，從而在傳感器元件上輸出信號(+)。在溫度Τ[ρ]時，所有的寡核苷酸探針通過目標核酸或者對照核酸被飽和，以至於 得到最強的信號作為陽性對照信號。接著經過T[測量1]、Τ[測量2]等等將溫度逐步提高至T[p] < T[測量1-η] Tm (Z)。寡核苷酸探針和目標核酸的雙鏈體現在完全解 鏈，以至於所有的目標核酸被釋放並能(和酶一起)漂洗除去。在溫度Τ[η]時，所有的寡 核苷酸探針現在再次為不飽和的，以至於沒有測量到信號(_)或者只測量到噪音信號，得 到最弱的信號作為陰性對照信號。此外可以通過對氨基苯酚(pAP)，即電化學反應的主要底物，進行初始的校正測 量，以便確定是否所有的電極對這種氧化還原反應物質的存在有應答。從而能夠證實所有 的電極對這種氧化還原反應產物有應答。現在漂洗除去游離的對氨基苯酚，並開始溫度相 關的測量次序。在圖6中顯示本發明的另一實施方式的示意圖。上面一列是正常的測量次序，和圖5描述的一樣，概括為與目標核酸(Z)及對照核酸⑷雜交，在T[p] < Tm⑷時測量陽性對照，對照核 酸解鏈，在Τ[ρ] <Τ[測量1-n] Tm(Z)時 獲得陰性對照信號。向傳感器的其他傳感器元件上施用帶生物素的寡核苷酸探針(在圖6 的下面的列中所描述)，這些傳感器元件作為分開設置的點用於溫度控制。這裡，酶在整個 測量溫度區間 T [p] < Tm(K)、T[p] < T [測量 1-n] Tm(Z)上獨立於 DNA 雜交物的解鏈溫度通過生物素_抗生蛋白鏈菌素複合物結合至寡核苷酸探針，並提供探測 系統(酶活性和電化學氧化還原反應)與溫度的關係。根據最強信號的溫度曲線，測試點 上的信號強度可以得到校正，其中在這些測試點上測量目標核酸。此外還可以設置附加的以具有隨機化序列的寡核苷酸探針所覆蓋的陰性對照點， 這種具有隨機化序列的寡核苷酸探針不能特異性地結合核酸。從而能夠補償非特異的結 合影響和流動導致的溫度影響。最後根據 酶轉化(底物轉化)校正每個傳感器對，單位是 Mol/(升X秒)。這裡也再一次可能的是，從測量點(帶有寡核苷酸探針，對於目標核酸是 特異性的)的信號強度和陰性對照點出發計算補償後的信號，例如，通過計算差數和商數。要注意的是，實施例只是解釋性和示例性的，在權利要求的保護範圍內，改變和修 改是可能的。尤其是，本發明的方法可以與其他傳感器元件和標記物或者標籤結合使用，例 如用於光學的、磁性的或者重量分析的傳感器元件。
權利要求
校正傳感器元件的方法，所述傳感器元件具有固定的寡核苷酸探針，所述傳感器通過所述寡核苷酸探針檢測目標核酸(Z)的結合，所述方法包括a)使所述傳感器元件接觸對照核酸(K)，該對照核酸的解鏈溫度Tm(K)低於目標核酸的解鏈溫度Tm(Z)；b)在溫度T[p]＜Tm(K)時使對照核酸(K)雜交至寡聚核苷酸探針上，獲得陽性對照信號。
2.根據權利要求1所述的方法，所述方法包括附加的步驟c)改變嚴緊條件使得T[n]>Tm(K)，並獲得陰性對照信號。
3.根據權利要求1所述的校正傳感器元件的方法，包括a)使傳感器元件接觸包含對照核酸(K)和目標核酸(Z)的混合物，其中，對照核酸的解 鏈溫度Tm⑷低於目標核酸的解鏈溫度Tm(Z)；bl)在溫度T[p] <Tm(K)時使混合物雜交至寡核苷酸探針上，獲得陽性對照信號； b2)在測量溫度T = T [測量]時改變嚴緊條件，使得 Tm⑷<T [測量]<Tm(Z)，獲得測量信號。
4.根據權利要求2所述的方法，所述方法包括附加的步驟 c)改變嚴緊條件使得T[n] >Tm(Z)，並獲得陰性對照信號。
5.根據前面權利要求中任一項所述的方法，其中，通過提高溫度實現所述改變嚴緊條件。
6.根據權利要求3所述的方法，其中，在不同的溫度T[測量1-n]時測量多個測量信號 1 至 n，其中 Tm(K) <T[測量 l_n] <Tm(Z)。
7.根據前面權利要求中任一項所述的方法，其中，所述方法針對設置在陣列裝置中的 大部分傳感器元件而實施。
8.根據前面權利要求中任一項所述的方法，其中，目標核酸和對照核酸用可檢測標記 物進行標記。
9.根據權利要求8所述的方法，其中，可檢測標記物是酶標記物，其可以使底物轉化成 傳感器元件可檢測的產物。
10.根據前面權利要求中任一項所述的方法，其中，在步驟(a)之前使傳感器元件接觸 可檢測的產物，以便獲得第一校正信號。
11.根據前面權利要求中任一項所述的方法，其中，在另一傳感器元件上，分別在溫度 T[p]、T[測量]、T[測量1-n]和T[n]時附加獲得溫度補償信號，其中可檢測標記物直接固 定在所述另一傳感器元件上。
12.根據前面權利要求中任一項所述的方法，其中，所述傳感器元件是電化學傳感器元 件，目標核酸和對照核酸用可檢測標記物進行標記，所述標記物是酶標記物，其使底物轉化 成傳感器元件可檢測的產物。
13.根據前面權利要求中任一項所述的方法，其中，對照核酸(K)的解鏈溫度Tm(K)比 目標核酸(Z)的解鏈溫度Tm(Z)至少低5°C。
14.一種裝置，其包括-至少一個傳感器元件，所述傳感器元件具有固定在上面的核苷酸探針，所述傳感器元 件通過所述的核苷酸探針檢測目標核酸的結合，其中寡核苷酸探針和目標核酸的結合複合物具有解鏈溫度Tm(Z)；-用於改變傳感器元件溫度的加熱和/或冷卻手段；-至少一種對照核酸，其能和核苷酸探針形成結合複合物，該結合複合物具有低於 Tm(Z)的解鏈溫度Tm(K)。
15.根據權利要求14所述的裝置，還具有大部分設置在陣列裝置中的傳感器元件。
16.根據權利要求14或15中任一項所述的裝置，其中，所述裝置中的對照核酸以幹試 劑的方式儲存。
17.根據權利要求14或15任一項所述的裝置，其中，所述裝置以試劑盒的形式提供， 所述試劑盒包含設備和組合物，所述設備包含加熱和/或冷卻手段以及至少一個傳感器元 件，所述組合物包含對照核酸。
18.根據權利要求14至17中任一項所述的裝置，其中，所述對照核酸用可檢測標記物 進行標記
19.根據權利要求18所述的方法，其中可檢測標記物是酶標記物，其可以使底物轉化 成傳感器元件可檢測的產物。
20.根據權利要求14至19中任一項所述的裝置，其中，可檢測標記物直接固定在另一 傳感器元件上。
21.根據權利要求14至20中任一項所述的裝置，其中，所述傳感器元件是電化學傳感 器元件，其中所述對照核酸用可檢測標記物進行標記，所述標記物是酶標記物，其使底物轉 化成傳感器元件可檢測的產物。
22.根據權利要求14至21中任一項所述的裝置，其中，對照核酸(K)的解鏈溫度Tm(K) 比目標核酸(Z)的解鏈溫度Tm(Z)至少低5°C。
23.根據權利要求14至22中任一項所述的裝置，包括作為對照核酸的核酸組合物，所 述組合物包含隨機化的十聚核苷酸序列。
24.根據權利要求23所述的裝置，其中，所述包含隨機化十聚核苷酸序列的核酸是生 物素化的。
25.根據權利要求14至24中任一項所述的裝置，其中，所述傳感器元件是電化學傳感 器元件。
全文摘要
本發明涉及校正傳感器元件的方法，該傳感器元件具有固定的寡核苷酸探針，該傳感器通過所述寡核苷酸探針檢測目標核酸的結合，該方法包括a)使傳感器元件接觸對照核酸(K)，該對照核酸的解鏈溫度Tm(K)低於目標核酸的解鏈溫度Tm(Z)；b)在T[p]＜Tm(K)的溫度對照核酸(K)雜交至核苷酸探針，獲得陽性對照信號；和任選地，c)改變嚴緊條件使得T[n]＞Tm(K)，並獲得陰性對照信號。根據本發明的改進方案，在測試溫度T[測量]時，其中Tm(K)＜T[測量]＜Tm(Z)，測量目標核酸(Z)的測量信號。所述方法特別適用於微陣列的校正和質量控制。
文檔編號C12Q1/68GK101868554SQ200880116967
公開日2010年10月20日 申請日期2008年10月29日 優先權日2007年11月20日
發明者凱特賈·弗雷德裡克, 勒妮·韋伯, 彼得·波利卡, 曼弗雷德·斯坦澤爾, 沃爾特·岡布雷克特 申請人:西門子公司