病毒載體的生產方法
2023-05-15 06:17:51
專利名稱：病毒載體的生產方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，具體涉及一種病毒載體的生產方法，尤其涉及慢病毒載體 的生產方法。
背景技術：
病毒載體病毒具有一些獨特的性質如多數病毒可感染特異的細胞，在細胞內不 易降解；RNA病毒能整合到染色體以及基因水平較高等。因此病毒載體是良好的基因轉運 載體。目前已被用作載體的病毒有逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關的病毒。皰疹病毒和肝炎病 毒等。逆轉錄病毒用作載體時需進行幾步改造(1)將天然的野生型RNA前病毒轉變成DNA 載體，並插入欲轉移的相關外源基因。其基本原理是用標記基因和外源基因替代病毒的編 碼基因；(2)製備輔助細胞為載體DNA提供其喪失的功能；(3)將載體DNA導入輔助細胞以 產生病毒載體；(4)病毒載體感染靶細胞，外源基因在細胞內得以表達。現有的病毒載體生產方法主要有(1)常規的細胞培養方法在培養皿中培養細胞。該方法生產一次病毒載體需要 培養10-20個直徑為15cm的培養皿，花費大量的培養基和血清，每次換液需要很長的時間 和精力，由於操作過程中步驟繁多，容易造成細胞的汙染。(2)生產病毒載體時需要進行細胞轉染，常規的轉染方法，需要大量的質粒和轉染 試劑，成本相當昂貴，生產工藝不能重複化，不能滿足病毒載體大生產量的需求。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於克服上述不足之處，提供一種更利於病毒載體包 裝細胞吸附和生長，病毒濃度高，操作簡便，低成本、一次性使用，適合於規模化生產的病毒 載體的生產方法。本發明提供了一種病毒載體的生產方法。包括用聚酯纖維紙片方法培養病毒載體 包裝細胞和細胞高密度轉染技術。本發明利用傳統的價格低廉的磷酸鈣轉染試劑實現對懸 浮細胞的高效轉染，細胞轉染效率可達90%以上。利用聚酯纖維紙片作為微載體加入到細 胞培養體系中，作為細胞的附著物，細胞不透過縫隙，可固定在纖維的空隙中附著生長。本發明的生產方法包括下列步驟一、聚酯纖維紙片方法培養慢病毒載體包裝細胞(1)包裝細胞先在細胞培養皿中培養到IO6-IO7個總量；(2)將IO6-IO7個總量的細胞從細胞培養皿中消化下來，並離心收集；(3)將收集的細胞與聚酯纖維紙片混合後鋪入細胞培養皿或細胞培養裝置，聚酯 纖維紙片的濃度為每30ml培養基中加入0. lg-5g的聚酯纖維紙片；(4)加入含5% -10%胎牛血清的細胞培養基淹沒聚酯纖維紙片；(5)放置32-37°C的二氧化碳培養箱中孵育；(6)24小時內進行細胞換液；
(7)連續培養4-10天後，將聚酯纖維紙片收集，用胰酶進行消化，消化時間短於20 分鐘，然後低速離心收集細胞；(8)在15ml或50ml離心管中，將細胞重新懸浮於10_30ml的新鮮含0% -2%胎牛 血清培養基中；二、細胞高密度轉染(1)取一個試管，將產病毒所需要的各種質粒，包括輔助質粒和目的載體質粒，按 照1 1 2比例混合，總量300-600ug ；(2)向質粒中加入250ul_800ul的0. 5M氯化鈣；(3)將上述質粒和氯化鈣混合物放置冰上或4°C 10-20分鐘；(4)取500ul_2ml的2 X HBS (平衡緩衝液)與上述混合物混勻；(5)混勻後將試管放置室溫25°C 10-30分鐘後加入到步驟一(8)中得到的細胞懸 浮液中，形成轉染體系；(6)將轉染體系放置到32_37°C的二氧化碳培養箱中孵育20_60分鐘，每5分鐘輕 搖管子，避免細胞糾集成團；(7)將離心管中的混合物倒入到預先準備的含有0. 6-10g的聚酯纖維紙片載體的 15cm細胞培養皿或細胞培養設備中，同時再加5%胎牛血清的培養基至總體積30ml ；(8)放入32-37°C二氧化碳培養箱中培養6-12小時後，用新鮮的含有10%胎牛血
清培養基換液；(9)每隔M小時收取病毒上清液，收取4次，獲得病毒上清。本發明所述步驟一(1)的細胞培養基為高糖DMEM培養基，含10% Gibco的胎中血 清，抗生素和穀氨醯胺。本發明所述高糖DMEM培養基、5%胎牛血清培養基、10%胎牛血清培養基與0% 2 %胎牛血清培養基通過市售得到。本發明利用聚酯纖維紙片作為微載體加入到細胞培養體系中(0. lg-5g/30ml培 養基的濃度加聚酯纖維載體紙片)，作為細胞的附著物。所述聚酯纖維紙片為市售的的各種聚酯纖維無紡布，具生物兼容性和親水性(在 使用前可以用1-10%的明膠進行浸泡30分鐘)、70-95%緻密度(在10倍的顯微鏡下觀察 纖維的緻密程度)、適用於充填床式生物反應器(Packing-BedBioreactor)、具有高表面積 /體積比(S/V ratio)等，且結構輕量化，每Ig約20-100片纖維片，可提供500-5000cm2表 面積供細胞生長。使用時以3-150g/lL濃度，裝載於吊籃式培養瓶內不鏽鋼充填隔間內，經 100-12rc, 20-60分溼熱滅菌後供培養使用。該聚酯纖維紙片特點1、不溶於水。2、聚酯纖維紙片規格為紙片厚度為小於l_5mm3、纖維直徑為l-10uM。4、交叉錯集排列密度70% -95%5、在10倍顯微鏡下觀察，細胞不可透過縫隙，可固定在纖維的空隙中開始附著生長。6、每片的大小可自行調節
7、使用前必須經過酒精或者射線消毒處理。本發明適用於腺病毒載體，杆狀病毒載體、α逆轉錄病毒載體、β逆轉錄病毒屬、 Y反轉錄病毒載體、S反轉錄病毒載體、ε反轉錄病毒載體以及慢病毒載體；其中的慢病 毒載體包括牛慢病毒載體、馬慢病毒載體、貓慢病毒載體、羊慢病毒載體和人類慢病毒載體 等各類病毒載體的大規模製備，同時適用於蛋白的大規模生產應用。本發明的方法可以大量提高包裝細胞的產量與病毒載體的產量。改進的新型磷酸 鈣高密度細胞轉染法可提高轉染效率。傳統的磷酸鈣轉染方法中的細胞數為IO6細胞/ml， 本發明用到的濃縮高密度細胞達到5xl07細胞/ml。
圖1-5本發明實施例1每隔M小時聚酯纖維紙片的細胞生長情況(圖1為M小 時後、圖2為48小時後、圖3為72小時後、圖4為96小時後、圖5為120小時後。)圖6為本發明實施例1培養7天後1個15cm直徑的培養皿可以生產5X IO8細胞 數，是傳統工藝培養的50倍。其中，縱座標為細胞總數，單位為IO7數量級；橫坐標中的數字為培養天數圖7為本發明實施例2生產的病毒產量，本發明的生產方法是傳統工藝的100倍產量。其中，縱座標為10的7次方病毒顆粒(病毒產量)橫坐標的1組代表傳統的生產工藝，2組代表本發明方法
具體實施例方式實施例1培養生產人類免疫缺陷病毒-1來源的慢病毒載體包裝細胞293細胞的 方法(1)先培養人胚腎293細胞2-3盤(IOcm培養皿)，每盤細胞培養基為IOmlsigma 公司的高糖DMEM培養基，含10% Gibco的胎牛血清，1 %抗生素和1 %穀氨醯胺，在37度二 氧化碳培養箱中孵育，每M小時換液，到細胞長滿培養皿為止)，養到滿為止，吸乾培養皿 中的培養基後，加5ml0. 25 %的胰酶在37度二氧化碳培養箱中，孵育10分鐘後，用移液槍輕 輕吹打細胞，消化下來細胞後，收集到離心管中低速離心(1000轉每分鐘的速度離心)，將 上清去掉，再用30ml含10%胎牛血清的DMEM培養基懸浮細胞.(2) 0. 6g聚酯纖維紙片放入15cm細胞培養皿裡，將收集的30ml細胞加到15cm培 養皿裡(恰好淹沒紙片)，放到二氧化碳培養箱中，37°C，5%二氧化碳。(3)每隔M小時換新鮮培養液(含10%胎牛血清的DMEM培養基)，並按照常規的 細胞計數法計數，連續培養7天後，紙片上的細胞已經長滿。結果培養7天後1個15cm直徑的培養皿可以生產5 X IO8細胞數，是現有技術培 養的50倍。(見圖6)實施例2細胞高密度轉染法生產人類免疫缺陷病毒-1來源的慢病毒載體(1)按實施例1方法，用聚酯纖維紙片的方法培養慢病毒載體包裝細胞，培養7天 後1個15cm直徑的培養皿可以生產5 X IO8細胞數；(2)用30ml pH7. 4的磷酸鹽緩衝液清洗所有的紙片2次，再用IOml胰酶消化細胞，消化時間10分鐘，用力吹打紙片直到細胞全部脫落後，在15ml離心管裡1000轉每分鐘 離心收集細胞；(3)倒掉上清，加入IOml的無血清sigma公司的DMEM(常規培養基，市售)培養 基，得到細胞懸浮液；(4)準備 1. 5ml 管，向管中分別加入質粒 P8. 91 IOOug, PCMV-VSV-G IOOug, Lv-PGK-GFP 250ug。共 450ug 質粒，然後加入 250ul 氯化鈣(0. 5Mol/L)；(5)冰上放置10分鐘；(6)逐滴加入500ul 2XHBS溶液(Hank' s平衡鹽溶液)；(7)室溫25度放置15分鐘後將混合物逐滴加入步驟(3)中得到的細胞懸浮液中；(8)混合均勻上述質粒細胞混合物，放入37°C，5%二氧化碳培養箱中孵育30分 鍾，每5分鐘輕微搖動離心管，促使細胞懸浮避免成團；(9)將離心管中的混合物倒入到預先準備的含有Ig的聚酯纖維紙片載體的15cm 細胞培養皿中，同時再加含有5%胎牛血清的sigma公司的DMEM培養基至總體積30ml ；(10)放入37°C二氧化碳培養中培養12小時後，用新鮮的DMEM+10%胎牛血清培養
基換液；(11)每隔M小時收取病毒上清。(12)收取4次後檢測病毒總產量為2. 74 X IO9病毒顆粒。本實施例和傳統工藝比較，生產的病毒產量，本實施例的生產方法是傳統工藝的 100倍產量。(見圖7)
權利要求
1.一種病毒載體的生產方法，其特徵在於該方法包括下列步驟一、聚酯纖維紙片方法培養慢病毒載體包裝細胞(1)包裝細胞先在細胞培養皿中培養到IO6-IO7個總量；(2)將106-107個總量的細胞從細胞培養皿中消化下來，並離心收集；(3)將收集的細胞與聚酯纖維紙片混合後鋪入細胞培養皿或細胞培養裝置，酯纖維紙 片的濃度為每30ml培養基中加入0. lg-5g的聚酯纖維紙片；(4)加入含5%-10%胎牛血清的細胞培養基淹沒聚酯纖維紙片；(5)放置32-37°C的二氧化碳培養箱中孵育；(6) 小時內進行細胞換液；(7)連續培養4-10天後，將聚酯纖維紙片收集，用胰酶進行消化，消化時間短於20分 鍾，然後低速離心收集細胞；(8)在15ml或50ml離心管中，將細胞重新懸浮於10-30ml的新鮮含0%-2%胎牛血清培養基中；二、細胞高密度轉染(1)取一個試管，將產病毒所需要的各種質粒，包括輔助質粒和目的載體質粒，按照 1:1: 2比例混合，總量300-600ug ；(2)向質粒中加入250ul-800ul的0.5M氯化鈣；(3)將上述質粒和氯化鈣混合物放置冰上或4°C10-20分鐘；(4)取500ul-2ml的2X HBS平衡緩衝液與上述混合物混勻；(5)混勻後將試管放置室溫25°C10-30分鐘後加入到步驟一(8)中得到的細胞懸浮液 中，形成轉染體系；(6)將轉染體系放置到32-37°C的二氧化碳培養箱中孵育20-60分鐘，每5分鐘輕搖管 子，避免細胞糾集成團；(7)將離心管中的混合物倒入到預先準備的含有0.6-10g的聚酯纖維紙片載體的15cm 細胞培養皿或細胞培養設備中，同時再加5%胎牛血清的培養基至總體積30ml ；(8)放入32-37°C二氧化碳培養箱中培養6-12小時後，用新鮮的含有10%胎牛血清培 養基換液；(9)每隔M小時收取病毒上清液，收取4次，獲得病毒上清。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟一(1)的細胞培養基為高糖DMEM 培養基，含10% Gibco的胎中血清，抗生素和穀氨醯胺。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述聚酯纖維紙片為不溶於水、紙片厚度 為l_5mm、纖維直徑為1-lOuM、交叉錯集排列密度70% -95%、使用前必須經過酒精或者射 線消毒處理。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述病毒載體為腺病毒載體，杆狀病毒載 體、α逆轉錄病毒載體、β逆轉錄病毒屬、Y反轉錄病毒載體、δ反轉錄病毒載體、ε反 轉錄病毒載體、牛慢病毒載體、馬慢病毒載體、貓慢病毒載體、羊慢病毒載體或人類慢病毒 載體。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述方法適用於蛋白的大規模生產應用。
全文摘要
本發明公開了一種病毒載體的大規模生產方法。包括用聚酯纖維紙片方法培養病毒載體包裝細胞和細胞高密度轉染技術，本發明方法可以提高包裝細胞的產量與病毒載體的產量，提高轉染效率，本發明的濃縮高密度轉染時的細胞密度達到5×107細胞/ml。本發明適用於腺病毒載體，腺相關病毒載體，杆狀病毒載體以及α逆轉錄病毒載體、β逆轉錄病毒屬、γ反轉錄病毒載體、δ反轉錄病毒載體、ε反轉錄病毒載體、牛慢病毒載體、馬慢病毒載體、貓慢病毒載體、羊慢病毒載體或人類慢病毒載體的大規模製備，並適用於蛋白的大規模生產應用。
文檔編號C12N15/867GK102140477SQ201010103819
公開日2011年8月3日 申請日期2010年2月1日 優先權日2010年2月1日
發明者張文煒, 楊光華, 王 華 申請人:上海比昂生物醫藥科技有限公司