一種亞硝酸鹽還原酶及其編碼基因的製作方法

2023-05-15 15:27:41

一種亞硝酸鹽還原酶及其編碼基因的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一個新的亞硝酸鹽還原酶基因，其編碼的亞硝酸鹽還原酶最適pH5.5；最適反應溫度35℃；經0.1M?pH5.5緩衝液在30℃-50℃下處理1h，仍能保持90％以上的活性；具有較好的水解亞硝酸鹽的能力；可作為飼料或食品添加劑應用於飼料與食品行業。
【專利說明】一種亞硝酸鹽還原酶及其編碼基因

【技術領域】
[0001] 本發明屬於基因工程【技術領域】，尤其涉及一種亞硝酸鹽還原酶及其編碼基因。

【背景技術】
[0002] 由於農業上氮肥的大量使用，環境中硝酸鹽和亞硝酸鹽大量富集，致使農產品、食 品以及飼料中有大量的亞硝酸鹽殘留。而亞硝酸鹽是一種對人體有害的物質，它不僅使人、 畜禽直接中毒、致死，而且是致癌物亞硝胺的前體，據研究，食道癌與患者攝入的亞硝酸鹽 量呈正相關。亞硝酸鹽還原酶能夠將飼料、食品以及環境中的亞硝酸鹽還原成氨或是一氧 化氮。


【發明內容】

[0003] 本發明的目的是提供一種亞硝酸鹽還原酶。
[0004] 本發明的另一目的是提供編碼上述亞硝酸鹽還原酶的基因。
[0005] 本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0006] 本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0007] 本發明所述亞硝酸鹽還原酶XW4NIR可得自類芽孢桿菌（Paenibacillus Ash)，其 胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本發明提供的亞硝酸鹽還原酶XW4NIR總共含313個胺基酸，理論分子量為34kDa。 該酶的最適pH值為5. 5,在pH4. 0 - 7. 5的範圍內維持50%以上的酶活性；經pH5. 5的緩衝 液在30°C -50°C下處理lh，仍能保持90%以上的活性；該酶最適溫度為35°C ;在pH5. 5及 37°C下，該酶對0.5% (w/v)亞硝酸鈉的比活力為1548. 12±66.81U/mg。
[0009] 本發明提供了編碼上述亞硝酸鹽還原酶的基因 XW4N，該基因序列如SEQ ID NO. 2 所示。
[0010] 本發明通過PCR的方法分離克隆了亞硝酸鹽還原酶XW4NIR的編碼基因 XW4N，其 全長942bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TGA。經BLAST比對，該亞硝酸鹽還原酶基因 XW4N 編碼的胺基酸序列與GenBank中nitrite Paenibacillus sp. HGF5來源的潛在亞硝酸鹽還 原酶假定蛋白具有最高的一致性，為49%，說明亞硝酸鹽還原酶XW4NIR是一種新的亞硝酸 鹽還原酶。
[0011] 本發明還提供了包含上述亞硝酸鹽還原酶基因 XW4N的重組載體，優選為 PET-XW4N。將本發明的亞硝酸鹽還原酶基因 XW4N插入到表達載體的限制性酶切位點之間， 使其核苷酸序列與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，將本發明 的亞硝酸鹽還原酶基因插入到質粒pET-28a(+)上的Hind III和Xho I限制性酶切位點之 間，得到重組大腸桿菌表達質粒PET-XW4N。
[0012] 本發明還提供了包含上述亞硝酸鹽還原酶基因 XW4N的重組菌株，優選所述菌株 為大腸桿菌、酵母菌、類芽孢桿菌或乳酸桿菌，優選為重組菌株BL21 (DE3) /XW4N。
[0013] 本發明製備亞硝酸鹽還原酶XW4NIR的方法按以下步驟進行：
[0014] (1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；
[0015] (2)培養重組菌株，誘導重組亞硝酸鹽還原酶表達；
[0016] (3)回收並純化所表達的亞硝酸鹽還原酶XW4NIR。
[0017] 其中，優選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優選將重組大腸桿菌表達質粒轉化大 腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21 (DE3) /XW4N。
[0018] 本發明提供了一個新的亞硝酸鹽還原酶基因，其編碼的亞硝酸鹽還原酶最適 ρΗ5· 5 ;最適反應溫度35°C;經0· 1M ρΗ5· 5緩衝液在30°C -50°C下處理lh，仍能保持90%以 上的活性；具有較好的水解亞硝酸鹽的能力；可作為飼料或食品添加劑應用於飼料與食品 行業。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為本發明實施例提供的亞硝酸鹽還原酶的SDS-PAGE分析圖，其中，Μ :低分子 量蛋白質Marker ;1 :純化的重組亞硝酸鹽還原酶XW4NIR ;
[0020] 圖2為本發明提供的亞硝酸鹽還原酶的相對酶活與pH值的曲線關係圖；
[0021] 圖3為本發明提供的亞硝酸鹽還原酶的相對酶活與pH值在不同時間的曲線關係 圖；
[0022] 圖4為本發明提供的亞硝酸鹽還原酶的相對酶活與溫度的曲線關係圖；
[0023] 圖5為本發明提供的亞硝酸鹽還原酶的相對酶活與溫度在不同時間的曲線關係 圖；
[0024] 圖6為本發明提供的亞硝酸鹽還原酶的相對酶活與金屬離子的柱狀圖。

【具體實施方式】
[0025] 試驗材料和試劑
[0026] 1、菌株及載體：類芽孢桿菌（Paenibacillus Ash)來源於實驗室保存菌株。
[0027] 大腸桿菌 Escherichia coli BL21 (DE3)和表達載體 pET_28a(+)購於 Novagen 公 司。
[0028] 2、酶類及其它生化試劑：限制性內切酶、DNA聚合酶、連接酶和dNTP購自TaKaRa 公司；其它均為國產試劑。
[0029] 3、培養基：
[0030] LB 培養基：PeptonelOg，Yeast extract5g，NaCllOg，加蒸饋水至 1000ml，pH 自然 (約為7)。固體培養基在此基礎上加2. 0% (w/v)瓊脂。
[0031] 說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書 進行。
[0032] 實施例1 :亞硝酸鹽還原酶基因 XW4N的克隆
[0033] 提取類芽孢桿菌基因組DNA :將類芽孢桿菌於平板劃線培養單菌落，挑取單菌落 於20mL培養基過夜培養，收集菌體提取基因組DNA。
[0034] 從LB平板上刮取3-5個菌落，加入180 μ L溶菌酶37 °C條件下處理lh後加入 20μ L蛋白酶K，混勻後加入220μ L GB溶液，震蕩，70°C放置lOmin ;加入220μ L無水乙 醇，混勻；將其轉到吸附柱中，於12000rpm離心lmin，向吸附柱中加入500 μ L⑶溶液，離心 lmin，；向吸附柱中加600 μ L漂洗液PW，離心lmin，棄廢液；重複一次後再離心2min，晾乾 (37°C開蓋lOmin);滴加50 μ L洗脫緩衝液TE，37°C放置5min ;離心2min ;於-20°C保存。
[0035] 根據前期測序得到的核甘酸序列，設計合成引物：
[0036] XW4F 如 SEQ ID No. 3 所示，為 5, -ATGCAGGCCATTCTGTCTGACGGA-3,；
[0037] XW4R 如 SEQ ID No. 4 所示，為 5, -TCATCCAAGCACCTTCGCCTCATAA-3,；
[0038] 以類芽孢桿菌總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應參數為：94°C預熱5分鐘， 94°C變性45秒，50°C復性30秒，72°C延伸1分30秒，30個循環，72°C保溫5分鐘。
[0039] 實施例2 :重組亞硝酸鹽還原酶XW4NIR的製備
[0040] 以XW4NIR F和XW4NIR R為引物對，類芽孢桿菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增。 PCR反應參數為：94°C預熱5分鐘，94°C變性45秒，52 °C復性30秒，72 °C延伸1分30秒，30 個循環，72°C保溫5分鐘。PCR結果得到亞硝酸鹽還原酶的基因 XW4N，並在該基因5'和3' 端分別引入了 Hind III和Xho I酶切位點。將編碼亞硝酸鹽還原酶的基因 XW4N進行雙酶 切（Hind III和Xho I)，同時將表達載體ET-28a(+)進行雙酶切（Hind III和Xho I)。將 上述酶切的亞硝酸鹽還原酶XW4NIR與表達載體pET-28a(+)相連接，獲得含有亞硝酸鹽還 原酶基因 XW4N的重組質粒pET-XW4N並轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組大腸桿菌菌株 BL21(DE3)/XW4N〇
[0041] 取含有重組質粒pET-XW4N的E. coli BL21 (DE3)菌株和只含有pET-28a(+)空質 粒的E. coli BL21(DE3)菌株，以0. 1%的接種量接種於LB(含50yg/mLAmp)培養液中， 37°C培養16h。然後將此活化的菌液以1%接種量接種到新鮮的LB(含50μ g/mL Amp)培 養液中，振蕩培養約2 - 3h(0D538達到0. 6 - 1. 0)後，加入終濃度0. 7mM的IPTG進行誘導， 於20°C繼續振蕩培養約20h。12000rpm離心5min，收集菌體。用pH7. 0的Tris-HCl緩衝 液懸浮菌體後，於冰浴下超聲波破碎菌體。以上濃縮的初酶液離心lOmin後，吸取上清並用 Nickel-NTA Agarose純化目的蛋白。SDS-PAGE結果參見圖1，圖1為本發明實施例提供的 亞硝酸鹽還原酶的SDS-PAGE分析圖，圖1中，Marker從上到下依次為116. OkDa，66. 2kDa， 45. OkDa，35. OkDa，25. OkDa，18. 4kDa，14. 4kDa。圖1表明，重組亞硝酸鹽還原酶在大腸桿菌 中得到了表達，經Nickel-NTA Agarose純化後為單一條帶。
[0042] 實施例3 :純化的重組亞硝酸鹽還原酶XW4NIR的性質測定
[0043] 1、重組亞硝酸鹽還原酶XW4NIR的活性分析
[0044] 酶活的大小是根據亞硝酸鈉在反應體系中的降解量多少來計量的，即反應體系中 亞硝酸鈉的初始含量減去反應一段時間後剩餘的亞硝酸鈉量。同一時間內，亞硝酸鈉降解 的越多，NiRs的活性就越大。取2mL的酶液，將其加入到含有亞硝酸鈉200μ g/mL的反應 體系中，37°C反應5h後，測定反應前後體系中亞硝酸鈉的含量變化，計算亞硝酸鹽還原酶 的活性。酶活力單位定義為：在溫度為35°C，pH5. 5條件下，每分鐘還原1 μ g亞硝酸鹽的酶 量定義為一個酶活力單位U。
[0045] 結果表明，在pH5. 5及37 °C下，該酶對0. 5 % (w/v)亞硝酸鈉的比活力為 1548. 12±66. 81U/mg。
[0046] 2、重組亞硝酸鹽還原酶XW4NIR的最適pH和pH穩定性測定：
[0047] 酶的最適pH測定：將亞硝酸鹽還原酶XW4NIR在37°C下和0. 1M pH3. 0 - 9. 0的緩 衝液中進行酶促反應。酶的pH穩定性測定：將純化的酶液置於0. 1M ρΗ3. Ο - 9. 0的緩衝液 中，在37°C下處理lh、3h和5h，然後在ρΗ5. 5及37°C下進行酶促反應，以未處理的酶液作為 對照。結果參見圖2和圖3,圖2為本發明提供的亞硝酸鹽還原酶的相對酶活與pH值的曲 線關係圖，圖3為本發明提供的亞硝酸鹽還原酶的相對酶活與pH值在不同時間的曲線關係 圖。圖2和圖3表明：亞硝酸鹽還原酶XW4NIR的最適pH為5. 5,在pH4. 0 - 7. 5的範圍內 維持50%以上的酶活性；經pH5. 5的緩衝液在30°C -50°C下處理lh，仍能保持90%以上的 活性。
[0048] 3、重組亞硝酸鹽還原酶XW4NIR的最適溫度及熱穩定性測定：
[0049] 酶的最適溫度測定：在pH5. 5的緩衝液中，於10 - 80°C下進行酶促反應。酶的熱 穩定性測定：將同樣酶量的酶液置於30°C - 90°C中，處理0 - 5h後，在pH5. 5及37°C下進 行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。結果參見圖4和圖5,圖4為本發明提供的亞硝酸 鹽還原酶的相對酶活與溫度的曲線關係圖，圖5為本發明提供的亞硝酸鹽還原酶的相對酶 活與溫度在不同時間的曲線關係圖。圖4和圖5表明：亞硝酸鹽還原酶XW4NIR的最適溫度 為351：，此酶在301：-501：時比較穩定，保溫511後相對酶活力仍達到60%以上 ；在371： 下亞硝酸鹽還原酶XW4NIR很穩定。
[0050] 4、不同金屬離子及EDTA對重組XW4N活力的影響
[0051] 在酶促反應體系中加入10mM的金屬離子及EDTA，研究其對酶活性的影響。在 37°C、pH5. 5條件下，以亞硝酸鈉為底物測定酶活性。結果參見圖6,圖6為本發明提供的亞 硝酸鹽還原酶的相對酶活與金屬離子的柱狀圖，圖6表明，10mM的Ag 2+、Fe3+、Mn2+、Pb2+、C〇 2+、 Ni2+、EDTA等對XW4NIR有不同程度的抑制作用，Cu2+、Mg2+、Na+和Al 3+對XW4NIR有激活作 用，其餘金屬離子對亞硝酸鹽還原酶XW4NIR的影響較小。
[0052] 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本【技術領域】的普通技術人 員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發明的保護範圍。
[0001] _序歹丨J 表_ 雲南師範大學 亞硝酸鹽還原酶及其編碼基囚 4 Patent In version 3. 3 <210) 1 313 PRT 人工序列 <400/ 1 Met Gin Ala lie Leu Ser Asp Gly Leu Glu Thr Val Ala Glu Val Lys 15 10 15 Ala Scr Thr Lys Ala Scr Gly Ser Cys Gly Gly Cys Ala Pro Ala Val 20 25 30 Ala Ala Leu Val Lys Leu Ala Lys Ala Gly Gly Gin Arg Ser Gin Lys 35 40 45 Scr Arg Pro Asn Thr Ala Asp Arg Thr Pro Ala Arg Ala Val Cys Scr 50 55 60 Cys Thr Asp Met Ser His Ala Ala Leu Arg Gin Ala lie Asp Glu Ala 65 70 75 BO Met Leu Gin Ala Pro Ala Scr lie Scr Gly Leu Met Glu Ala Lcii Gly 85 90 95 Phe Val Asn Arg Ala Gly Cys Gly lie Cys Arg Pro Ala Val Arg Tyr loo 105 no
[0002] Tyr Ala Glu Leu Ala Ala Ala Asp Ser Val Gly Asn Pro Gly Asn Val 115 120 125 Gin Ser Val Gb Ala Ser Asp Ser Ala Pro Glu Asp Arg Ser Tyr Arg 130 135 140 Gly Val His lie Arg Thr Gly Asp His. Ala Glu Arg Thr Asp Ala Asp 145 150 155 160 Val Glu Arg Gly Met Arg Trp lie Glu Glu Gin Leu Met Arg Asp Trp 165 170 175 Ala Asn Leu Ser Leu Pro Tyr Pro Val Thr Ala Gly lie Ala Glu Ser 180 185 190 Thr His Gly Asp Val Ser Val Leu Val Gin Gly lie Gly lie Ala Ala 195 200 205 Ser Pro Ala Gly Trp Glu Val Tyr Leu Gly Gly His Ala Gin His Pro 210 215 220 Val Arg Glu Ala Gin Leu Val Gly Leu Ala Glu Glu Ala Gly Glu Ala 225 230 235 240 Val Arg Leu Ala Ser Ala Cys Leu Gin Trp Tyr Arg Gin Lys Ser Arg 245 250 255 Phe Gly Glu Pro Leu Trp Gin Trp Val Asp Arg Glu Gly He Val Pro 260 265 270 He Arg Glu His Val Leu Asp Ala Cys Leu Gin Gin Glu Leu Ala Asp 275 280 285 Lys Leu lie Gly Asn Ser Lys Trp Tyr Asp Ala Asn Leu Ala Ser Gly 290 295 300 His Arg Tyr Glu Ala Lys Val Leu Gly 305 310
[0003] 2 942 <212〉 DNA 人工序列 2 atgcaggcca ttctgtctga cggacttgag acggtcgccg aggtgaaagc gagcacgaag t>0 gcttccggct cttgcggagg ctgcgcacca gcggtcgcag cgctagtgaa gctggcgaag 120 gcggggggac agcggagcca gaagtcgagg ccgaacactg cagaccgcac gccagctaga 180 gctgtatgca gctgcacaga catgagccat gcggccttgc gtcaagctat tgacgaagcg 240 atgctgcagg caccggottc catatccggc ctgatggaag cgttggggtt tgtgaatcgt 300 gctggctgcg gcatalgccg tccggctgtg cgctactatg ctgaactggc tgctgcggac 360 agcgttggga atccggggaa tgttcagtct gttggggctt ccgactcggc acccgaggat 420 aggagttatc gcggtgtgca. cattcggacc ggggaccacg cggagcgaac ggacgccgat 480 gttgaaaggg ggatgcgctg gatcgaggaa cagctgatga gggactgggc gaatctgtca 540 ttgccctatc cggtgacggc gggcatagcg gagagcacgc atggcgacgt cagcgtcctc 600 gtgcagggga tcggcatcgc agcttctccc gctggctggg aggtgtatct gggcggacat 660 gcgcagcatc ctgtacgaga agcccagctt gtcggattgg cagaagaggc gggggaggcg 720 gtgcggctcg cctcggcttg tctgcagtgg tatcgccaga agagccggtt tggcgagccg 780 ctgtggcaat gggtggatcg cgaaggcatc gtaccgatcc gggaacatgt gctggatgca 840 tgcc tgcagc aagagcttgc cgacaagctg atcggaaaca gcaagtggta tgatgcgaac 900 ctggcgtcag gccatcgtta tgaggcgaag gtgcttggat. ga 942 3 〈211〉 24 DNA <213〉人工序列
[0004] 3 Atgcaggcca ttctgtctga cgga 24 4 25 <212〉 DNA <213〉人工序列 4 tcatccaagc accltcgcct cataa
【權利要求】
1. 一種亞硝酸鹽還原酶，其特徵在於，其具有⑴或（II)所示的胺基酸序列中任意一 個： (I)具有SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列； (Π )具有SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸 獲得的胺基酸序列。
2. -種編碼如權利要求1所述的亞硝酸鹽還原酶的基因。
3. 根據權利要求2所述的基因，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示或者由 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或幾個鹼基獲得。
4. 包含權利要求2或3所述基因的重組載體。
5. 含有權利要求4或5所述載體的宿主細胞。
6. 包含權利要求2或3所述基因的菌株。
7. 根據權利要求6所述的菌株，其特徵在於，所述菌株為重組菌株。
8. 根據權利要求7所述的菌株，其特徵在於，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、類芽孢杆 菌或乳酸桿菌。
【文檔編號】C12R1/19GK104046598SQ201410292553
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月25日 優先權日:2014年6月25日
【發明者】黃遵錫, 劉凌雲, 謝振榮 申請人:雲南師範大學