自動化循環腫瘤細胞檢測的製作方法

2023-05-15 11:24:31 4

自動化循環腫瘤細胞檢測的製作方法
【專利摘要】本發明屬於體外診斷的領域，並且涉及檢測體液(例如血液、尿)中的循環的或擴散的活細胞，或混有液體的組織樣本(例如骨髓)的方法和裝置，其包括以下步驟：a)通過適用於攔截待測細胞的多孔膜來過濾液體樣本，使得待測細胞停留在所述膜的至少部分的表面上，並且使得所述樣本液體經過該膜，b)塗覆第一處理液，其包含第一試劑用於以第一標記物標記所述待測細胞，c)以預定的時間段在所述膜上溫育所述處理液，其中所述待測細胞經標記，d)檢測在所述膜的表面上的經標記的待測細胞。
【專利說明】自動化循環腫瘤細胞檢測
【技術領域】
[0001]本發明屬於體外診斷的領域，並且涉及檢測體液(例如血液、尿)中的循環的或擴散的活細胞，或混有液體的組織樣本(例如骨髓)的方法和裝置。本發明的方法特別用於循環腫瘤細胞的自動提取和分析，並優選應用於腫瘤的診斷。
[0002]本發明實現了在將血液或骨髓通過特殊的過濾方法過濾之後，通過功能測試自動化檢測來自外周血或骨髓的細胞或細胞成份。所述細胞特別為來自外周血或其他體液的循環腫瘤細胞(英文circulating tumor cells, CTC或(複數)CTCs)、間充質幹細胞或細菌，以及來自骨髓的擴散腫瘤細胞(英文:disseminated tumor cells, DTC)。
【背景技術】
[0003]外周血中CTC的存在表明處於非常早期的實體腫瘤細胞的可能的分散(Streuung)，而用常規的影像檢查方法可能還未檢測到轉移。因此，檢測或表徵外周血中的CTC使得識別早期的全身性腫瘤細胞的擴散以及使用CTC作為預後標記物成為可能。由此可以支持和實施全身性療法的預測和連續監測。此外，可以利用CTC的表徵和評估作為為實體腫瘤選擇適當治療的診斷工具。
[0004]對於早期發現、診斷和治療控制癌症來說，血液中循環腫瘤細胞(CTC)的檢測變得越來越重要。此外，由於CTC的數量較低(每毫升血液中僅有3~5個)以及由於白細胞的背景較高出~IOX 106/ml)，要選擇一種方法來儘可能有選擇地富集CTC或能夠在其他血細胞大量過剩前將其表現出來。因而採用例如過濾的物理方法，其中通過相應的孔徑可以對細胞的大小進行選擇，或者其他例如通過選擇性地抗體結合來富集血液樣本中CTC的方法。
[0005]迄今為止，沒有一種基於尺寸選擇的方法是完全自動化的。在CTC的富集步驟和實際的選擇性免疫化學檢測反應之間手動操作是必須的。
[0006]除了流式細胞計數的方法(例如FACS法，螢光激活細胞分類法)和過濾的方法之外，迄今為止只有Veridex公司的商業化的批准用於常規體外診斷的系統(CellSearch)。當CTCs的待測數量等於或大於3/ml時，所使用的方法允許以幾個毫升的血液的輸出體積檢測CTCs。所使用的用於富集的方法利用的是與磁珠相連接的抗體和CTC的特異性結合。經富集的CTC的特異性檢測在經螢光標記的抗體的幫助下能可視化地進行。
[0007]也已知有通過尺寸的選擇來富集CTC的或貧化血液中的白細胞並且將其輕微「固定」的物理方法。於此使用具有經限定的孔徑的過濾器，其允許白細胞和其他血液成份透過，但應防止CTC穿過。對於包括一系列清洗步驟和可選的染色步驟的後續處理來說，在染色臺(FSrbestation).上手動傳輸過濾器是通常的做法。
[0008]與此相反，本發明使得用於檢測樣本中的(活)細胞、特別是血液樣本中的腫瘤細胞的可靠的且高性價比的自動化方法成為可能。

【發明內容】
[0009]本發明涉及權利要求1所述的方法以及權利要求10所述的裝置。
[0010]根據本發明的過濾過程中，懸浮液由過濾器(例如濾膜)過濾。在這種情況下，擠壓滲透物通過過濾器並且使滯留物留在過濾器的表面上(或在過濾器的空隙和腔體中)。因此在過濾過程中，通過過濾器形成了滲透物主要的流動方向，從而可將一個區域稱為過濾器的上遊，在該區域內(包含細胞作為主要成份的)滯留物受到阻攔；以及一個區域稱為過濾器的下遊，在該區域中所述滲透物受到擠壓並且例如於此處可將其收集。獨立於該主要流動方向，可以在特殊情況下例如在反向衝洗過濾器時，也可將流動方向反轉。
[0011]為了擠壓滲透物通過過濾器，可以使過濾器的上遊存在高於下遊的壓力從而產生壓力差。這可以通過對過濾器的上遊施加正壓、對下遊施加負壓或結合兩者來實現。為使滲透物停止流過過濾器(降低為O)，可以將壓力差設定為O。這與過濾器在空間方位無關。對於特殊情況，流動方向垂直於過濾器或者於過濾器有垂直分量分布(即沿重力方向或與重力相反的方向)，還要考慮到，在過濾器上的水柱為壓力差所作的貢獻。
[0012]對於本發明方法的一些應用，優選過濾的流動方向在過濾器中沿重力方向運行。從而，經阻攔的滯留物停留在過濾器的表面上，這使得例如對滯留物(細胞)的進一步處理成為可能。
[0013]對於特定的應用，可以優選不沿重力的方向，而是沿與重力相反的方向來進行過濾，例如當滯留物漂浮時，或是要在過濾後將細胞從過濾器底部收集進收集容器中。
[0014]本發明涉及液體樣本中的細胞的檢測方法，其包括以下步驟: [0015]a)通過適用於攔截待測細胞的多孔膜來過濾液體樣本，使得待測細胞停留在所述膜的至少部分的表面上，並且使得至少部分的樣本液體經過所述膜，
[0016]b)塗覆第一處理液，其包含用於以第一標記物標記所述待測細胞的第一試劑，
[0017]c)以預定的時間段在所述膜上溫育所述處理液，其中所述待測細胞經標記，
[0018]d)檢測在所述膜的表面上的經標記的待測細胞。
[0019]液體樣本可例如為血液樣本、尿液樣本或血漿樣本。
[0020]根據本發明的一項實施方式,通過將該處理液直接加入液體樣本來實現步驟b)。
[0021]根據本發明的一項實施方式，在檢測經標記的待測細胞前，例如以擠壓通過該膜的方式去除所述第一處理液。
[0022]適合用於標記的試劑包括可將細胞非特異性地或特異性地染色的標記物。非特異性標記物例如染料可以將蛋白質、核酸或其他細胞成份染色。特異性標記物可以例如是抗體、寡聚核苷酸探針、肽或其他分子，它們可以特異性地結合蛋白質、核酸序列或其他細胞特異性結構。標記物可以用可檢測的標籤例如顯色染料、螢光染料、同位素標記或類似物來直接標記。備選的是，可通過二級檢測試劑(例如二級抗體或酶-底物-系統)來檢測標記物。
[0023]此外，例如在步驟b)之前或在步驟d)之後可任選地塗覆至少一種另外的處理液。
[0024]該至少一種另外的處理液優選包含選自以下的試劑:
[0025]-用於清洗的試劑，
[0026]-用於固定生物結構的試劑，
[0027]-用於防止非特異性標記活動(Markierungsereignissen)的試劑，或
[0028]-具有以另一種標記物標記待測細胞的試劑，其中所述另一種標記物不同於用於所述用於標記的第一試劑。
[0029]作為用於清洗的試劑已知有相應的清洗緩衝液。它們可以進一步包含用於使細胞膜滲透化的試劑，例如表面活性劑、皂苷和類似物。作為用於固定生物結構的試劑已知有相應的固定液，其含有固定劑，例如甲醛、戊二醛和類似物。
[0030]作為用於防止非特異性標記活動的試劑已知有相應的封閉緩衝液(Blockierpuffer)。當使用例如抗體作為標記物時，已知通過封閉緩衝液使含有同一物種的非特異性免疫球蛋白的抗體的非特異性結合達到飽和，且該標記物抗體源自於該抗體。
[0031]所述另一處理液優選包含適用於清洗或固定細胞或適用於防止非特異性標記活動的試劑。 [0032]根據本發明優選的方面，在該方法中在過濾後通過以合適處理液進行溫育用染料對在膜上的細胞進行染色。為此，可以選擇能將細胞或細胞成份染色的並且在細胞學和組織學中已知的染料。這可以是的活或死的染料。所述染料將細胞核或其他細胞器特異性染色，或將某些細胞成份，例如核酸或蛋白質特異性的染色。已知的細胞染料例如為臺盼藍(Trypanblau)、DAPI 以及類似物。
[0033]也可以用顯微鏡分析在膜上的未經染色的或經染色的待測細胞。
[0034]根據本發明一項優選的實施方式，在步驟c)期間，在膜的背離所述待測細胞於步
驟a)中停留的側的一側上施加正壓(iiberdruck)，其中選擇使得處理液經過所述膜的穿流
得到阻止的正壓，其中所述正壓^ IOmbar或< 5mbar。優選正壓為3~IOmbar。通過較低的正壓來阻止處理液滲透過膜。
[0035]優選如此選擇所述正壓，使其在向下的流動方向上(即重力的方向)等於或大於在過濾器上方的水柱的壓力。此處成立的是:1cm水柱對應於約Imbar。在過濾器處於大致水平的布置的情況下，所述水柱對應於在過濾器上方的懸浮液的液面高度，其中從上至下地過濾該懸浮液。
[0036]根據本發明優選的一項實施方式，在步驟d)期間，在膜的背離所述待測細胞於步驟a)中停留的側的一側上施加負壓(Unterdruck),其中選擇使得所述處理液抽吸經過所述膜的負壓。
[0037]根據本發明優選的一項實施方式，所述待測細胞為腫瘤細胞。本發明的方法特別適用於檢測CTC。
[0038]根據本發明優選的一項實施方式，這樣來選擇步驟c)的處理液以及溫育條件，使得待測細胞可以在預定的時間段內存活。因此，才有可能對該細胞實施進一步的功能性測試。可選擇具有生理鹽水濃度的緩衝液作為處理液。可在相應的溫度和溼度條件下進行溫育。
[0039]進一步地可檢測由待測細胞釋放的物質。
[0040]本發明進一步地涉及了用於實施本發明方法的步驟a)至d)的裝置，其包括:
[0041]a)適用於攔截待測細胞的多孔膜，
[0042]b)用於將液體塗覆於所述膜上的手段，
[0043]c)用於將液體擠壓經過膜的手段，
[0044]d)用於調節膜前後的壓力差的手段，
[0045]e)用於控制時間進程的手段，其可以對在膜上塗覆所述液體、所述液體以預定時間段停留在所述膜上以及所述液體受擠壓經過所述膜進行控制，
[0046]其中，用於調節壓力差的手段能在所述膜的背面產生正壓，從而實現所述液體以預定時間段停留在所述膜上。
[0047]用於將液體塗覆於膜上的手段例如可作以輸入管線(Zuleitung)或移液設備來實施。
[0048]用於將液體擠壓經過膜的手段可以包括用來產生壓力差的手段，其中過濾器上遊的壓力大於下遊。
[0049]可將用於控制時間進程的手段可設置成程控控制裝置，在其中可調節預定的時間段。
[0050]根據本發明優選的一項實施方式，在膜的背離所述待測細胞受阻攔於膜上的側的一側上施加正壓，其中選擇使得處理液經過所述膜的穿流得到阻止的正壓，其中所述正壓^ 50mbar>^ 20mbar>^ IOmbar或< 5mbar。優選正壓為3~lOmbar。通過較低的正壓來阻止處理液滲透膜。
[0051]優選如此選擇所述正壓，使其在向下的流動方向上(即重力的方向)等於或大於在過濾器上方的水柱的壓力。此處成立的是:1cm水柱對應於約Imbar。在過濾器處於大致水平的布置的情況下，所述水柱對應於在過濾器上方的懸浮液的液面高度，其中從上至下地過濾該懸浮液。
[0052]可以在相應 的夾持裝置中將所述膜夾緊，以便於可以施加相應的負壓和正壓。
[0053]優選將膜布置在載玻片上，以便於在實施本發明方法的步驟a)至d)之後例如可通過顯微鏡進行觀察來鑑定帶有膜的載玻片用於細胞檢測。
[0054]顯微鏡載玻片是約為26X76mm(IS08255-2)的透明板，其厚度約0.1~1.5mm。
[0055]所述載玻片優選具有開口，以便於可以輕鬆地抽吸液體。其可以是多個小開口，例如孔隙或鑽孔。或者它也可以是由膜覆蓋的一個或多個較大的縫隙。
[0056]該膜具有例如為0.1~200 μ m的孔徑。從而在樣本中的細胞碎片、血小板和較小的固體成份穿過過濾器(膜)時，細胞可受到阻攔。
[0057]根據本發明優選的一項實施方式，所述膜的孔徑為2~50 μ m，進一步優選為5~20 μ m,更進一步優選為5~10 μ m。在2~50 μ m、5~20 μ m或特別在5~10 μ m的大小範圍內的孔徑提供的優勢在於:受到阻攔的細胞部分地附著在孔隙中並且因此特別良好地附著在膜上，並且可用於進一步的分析。
[0058]根據本發明的一個方面，通過第一標記物檢測到下文中列表1和2列出的抗原。
[0059]根據本發明優選的方面，在使用血液樣本的情況中，在過濾前會實施紅細胞裂解(例如，通過低滲裂解)，以去除造成幹擾的紅細胞。
[0060]此外，在過濾後也可將所述細胞放回到細胞培養介質中，並且為進一步的研究作培養。因此，例如可培養並進一步研究經檢測的腫瘤細胞，以檢查其對某些藥物(例如細胞抑制劑)的反應。
[0061]列表1:優選的細胞特異性抗原
[0062]-用於肝細胞癌和生殖腺及生殖腺外的生殖細胞瘤的α-1-甲胎蛋白(AFP)
[0063]-用於多發性骨髓瘤的本瓊蛋白(Bence-Jones-Protein)
[0064]-用於卵巢的生殖細胞腫瘤和睪丸的非精原細胞瘤的β-HCG(人絨膜促性腺激素的β-亞基)
[0065]-用於乳腺癌(Mammakarzinom)或卵巢癌(Ovarialkarzinom)的CA 15-3
[0066]-用於膜腺癌(Pankreaskarzinom)的CA19-9 和 CA50
[0067]-用於卵巢癌(Ovarialkarzinom)的CA-125
[0068]-用於甲狀腺髓樣癌的降鈣素(humanesCalcitonin, hCT)
[0069]-用於大腸癌、胰腺癌以及肺的類腺癌(Adenokarzinomder Lunge)的癌胚抗原(CEA)
[0070]-用於肺癌(支氣管癌)的所有變體的細胞角蛋白21片段(CYFRA21-1)和絲氨酸蛋白酶抑制劑B4 (SCC)
[0071 ]-HER_2/neu
[0072]-HPV抗體或HPV抗原
[0073]-用於神經母細胞瘤的人高香草酸(HomovaniMinsdure)
[0074]-用於類癌的5-羥吲哚乙酸
[0075]-用於嗜鉻細胞瘤的兒茶酚胺、香草扁桃酸
[0076]-用於生殖細胞瘤的 乳酸脫氫酶(LDH)
[0077]-用於生殖細胞瘤的乳酸脫氫酶同工酶I(LDH-1);在目前的指南中還不建議使用常規測定
[0078]-MAGE 抗原
[0079]-用於嗜鉻細胞瘤的腎上腺素
[0080]-用於非小細胞肺癌(NSCLC)或乳腺癌的MUCl
[0081]-用於小細胞支氣管癌(SCLC)、神經母細胞瘤以及精原細胞性生殖細胞腫瘤的NSE
[0082]-用於精原細胞性生殖細胞腫瘤的胎盤鹼性磷酸酶(PLAP)
[0083]-用於前列腺癌(Prostatakarzinom)的PSA
[0084]-用於乳頭狀或濾泡狀甲狀腺癌的任意濃度的甲狀腺球蛋白(Tg)
[0085]-胸苷激酶
[0086]-細胞角蛋白，例如細胞角蛋白8，18，19
[0087]列表2:附加的細胞特異性抗原
[0088]2 微球蛋白(β2_Μ)
[0089]-CA54-9
[0090]-CA72-4
[0091]-CA195
[0092]-癌相關血清抗原(CASA)
[0093]-C 肽
[0094]-細胞角蛋白
[0095]-胃泌素
[0096]-胰高血糖素
[0097]-葡萄糖-6-磷酸異構酶(GPI)
[0098]-胰島素[0099]-新蝶呤
[0100]-核基質蛋白22 (NMP22)
[0101]-骨特異性鹼性磷酸酶(Ostase)
[0102]-P53自體抗體
[0103]-副蛋白
[0104]-催乳素(PRL)
[0105]-S-100 蛋白
[0106]-絲氨酸蛋白酶抑制劑B4(SCC)
[0107]-妊娠特異性βI糖蛋白(SP-1)
[0108]-腫瘤相關的糖蛋白12(TAG12)
[0109]-胸苷激酶(TK)
[0110]-組織多肽抗原(TPA) [0111]-組織多肽特異性抗原(TPS)
[0112]-腫瘤M2-PK
[0113]-血管活性腸多肽(VIP)
[0114]-轉酮酶樣蛋白I(TKTLl)
[0115]列表1和2所列出的抗體是特異性標記物的示例性靶向物(Targets)(例如抗體)。由其可根據本發明方法來檢測細胞，特別是腫瘤細胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0116]下文將對本發明的方法加以示例性的說明。圖1示出了本發明方法的步驟a)至d)。
[0117]步驟A示出了通過多孔膜來進行液體樣本的過濾，以這種方式將待測細胞攔截或使其停留在膜表面上，
[0118]步驟B示出了含有用於標記待測細胞的第一試劑的第一處理液的塗覆，
[0119]步驟C示出了以預定的時間段在膜上溫育處理液，其中待測細胞受到標記(通過陰影來表示待測細胞)，以及
[0120]步驟D示出了例如通過抽吸來去除處理液。
【具體實施方式】
[0121]通過以下方式將需要從周圍介質(樣本液體)中分離出的固體(細胞、顆粒、組織)與介質分離:所述固體保留在過濾膜的表面，該過濾膜對於待分離的固體來說是不可滲透的，而對於周圍介質以及汙染待分離固體的固體來說是可滲透的。為此提供可以確定和改變氣體或液體通過於其可滲透的表面的流速的方法。在醫學診斷中固體優選為細胞成份，周圍的介質優選為全血/血清/血漿，其也可包含顆粒，而且因其屬性可以滲透所述表面(例如白細胞)。
[0122]通過自動化過程，例如通過移液機械臂特別將除樣本之外的所有隔離/富集以及檢測必需的試劑塗覆在膜的表面上。可以將所述樣本以及試劑可控地保留在表面上以用於溫育和/或通過其可滲透的表面將它們去除。這可以通過使用各種傳感器和執行裝置來實現，其使得物質按照要求受調整地穿過膜的滲透層(可滲透的表面)。此時例如可以根據流速，或者對於特別敏感的細胞成份通過施加給系統的壓力差(相對於環境壓力)來進行調
難
iF.0
[0123]從向半滲透的表面上塗覆介質到選擇性標記的所有步驟優選在液體處理機械臂中自動化地實施和監控。此外，可實現同時且並行地處理多個待檢樣本。
[0124]通過連續的隔離/富集的實驗方案的實施以及在單元設備中的選擇性檢測反應，不需要迄今為止常規的手動進行的中間步驟和樣品傳輸，就能實現出錯更少的分析以及更快的運行時間。因為在這裡提出的方法中，藉助於在半滲透的表面上的針對性塗覆和穿過該表面的受控流動來調節所有檢測所需的處理液或試劑的溫育，使得所用試劑量得以顯著減少，這在免疫化學試劑的價格通常很高的情況下意味著可觀的成本優勢。無論是在手動的免疫化學染色，還是在已知的「自動染色」的情況下，溫育用量(Inkubationsvolumen)要大得多，因為不僅要潤溼待處理的表面，還要淹沒更大的區域或必須以足夠的量填充整個溫育容器。
[0125]為了實施富集/清洗和染色步驟，以下是必需的:
[0126](a)液體量或液面高於半滲透性表面，
[0127](b)液體穿過半滲透性表面的滲透速度，
[0128](C)知道滲透 所需的環境和設備之間的壓力差，並且利用來控制滲透速度和確定當前所分析的樣本的量。
[0129]為此所需的傳感器和執行裝置(Aktorik)既可以是滲透設備的組成部分，也可以是移液機械臂的組成部分，或者分布存在，這使得所述組件之間的通訊是必須的。
[0130]對於各個樣本/通道的單獨控制來說，至少需要一個壓力傳感器和一個閥，用它們能調節施加給環境的壓力差(即正壓或負壓)。例如可通過連接一個存儲容器(VorratsgefM〗)來產生各個壓力差，由此既能相對於周圍環境產生負壓又能產生正壓。
[0131]通過液體處理機械臂可以有利地對液體流動進行監控，為此採用以下步驟:
[0132](a)由通道特異性液位測量(例如電容)來確定在半滲透性膜上的液體量，從而進行溢位檢查和控制移液後的時間點，
[0133](b)轉換所獲得的測量數據，其由外部軟體讀取並且可以將其導向進一步的處理，
[0134](C)根據各個液面來對其他的液體等份進行移液。
[0135]通過流速或滲透所需的壓力差來有利地控制介質穿過半滲透性表面進行滲透的速度。為此對敏感的待隔離的組件施加儘可能低的例如低至7mbar的壓力差，但該壓力差也可增至50mbar。然而，壓力差的連續測量也可用來確立，是否在半滲透型膜上還存在樣本材料，並且因此可作為滲透完成的信號，或者如果在測定進程中出現半滲透性表面的堵塞，可將其用作分析斷開的信號(Analyse-Abschaltsignal)。
[0136]通過分份添加樣本(例如通過液體處理機械臂)和偶爾的混合(Aufmischen)樣本，可以在很大程度上避免細胞的沉降以及由此相伴的細胞損失。
[0137]下文以舉例的方式描述了用於富集和以免疫化學的方式檢測或以分子生物學的方式表徵樣本中的CTC的自動化步驟。
[0138](i)手動步驟:
[0139]?將待測樣本裝入設備中[0140].裝入所需的準備好的試劑
[0141].裝入其他耗材(例如移液器吸頭)
[0142].在分析完之後清理廢液
[0143](ii)自動化富集CTC和以免疫化學的方式檢測CTC的過程:
[0144].混合血液樣本
[0145].血液樣本取樣並且添加到稀釋/裂解/固定緩衝劑中
[0146].溫育血液樣本和緩衝劑
[0147].通過一系列的清洗和溫育步驟來有選擇地調節膜
[0148].將經處理的血液樣本移液至裝置中，使膜得到覆蓋
[0149].通過液面差和壓力差來調節CTC在膜上的富集(例如通過移液器吸頭中的液面傳感器，壓力測量以及由低/高壓存儲容器上的閥來調節壓力差)
[0150]?在膜持續堵塞時結束滲透過程
[0151].溫和地固定和清洗 在半滲透性膜上的細胞
[0152].通過用必要的處理液/試劑溫育膜上的細胞來進行免疫化學的染色
[0153].通過液面差和壓力 差來調節測定過程(移液器吸頭中的液面傳感器，壓力測量以及由低/高壓補充容器上的閥來調節壓力差)
[0154].在膜受到持續堵塞時結束滲透過程
[0155]接著，可選擇地:(c)通過FISH(螢光原位交雜)來「以分子生物學的方式表徵」
[0156].通過使用必要的試劑在膜上加熱(temperiert)溫育來進行分子生物學的染色
[0157]?在長時間的溫育過程中通過放置蓋玻片來防止蒸發，在溫育後會將其再次去除
[0158](iv)最後的步驟
[0159].將適合的固定介質移液到半滲透性膜上，該介質也可以是固化的
[0160]?放置蓋玻片
[0161]可選擇再次手動進行步驟(iv)。
[0162]在所謂免疫染色的情況下，例如用抗體溶液、標記試劑、清洗緩衝液以及許多處理液(大多連續地)來溫育人體細胞或細胞切片(組織切片)。通常以顯微鏡分析在顯微鏡載玻片上的染色對象。
[0163]染色所需的流體處理步驟是非常多樣化且複雜的。所使用的試劑部分非常昂貴。在載玻片上的自動化處理能實現僅有很少用量的節約成本的處理。通常情況下會將載玻片上方的試劑洗去，這除了消耗大量的試劑外還可能伴有對象的部分損失。
[0164]根據本發明，試劑不是在表面上被衝洗掉(hinwegspiilen),而是通過膜被衝洗流過(hindurchspiilen),這樣就能節省試劑,避免對象的損失以及通常讓過程控制變得更好。
【權利要求】
1.液體樣本中細胞的檢測方法，包括以下步驟: a)通過適用於攔截待測細胞的多孔膜來過濾液體樣本，使得待測細胞停留在所述膜的至少部分的表面上，並且使得至少部分的樣本液體經過所述膜， b)塗覆第一處理液，其包含用於以第一標記物標記所述待測細胞的第一試劑， c)以預定的時間段在所述膜上溫育所述處理液，其中所述待測細胞經標記， d)檢測在所述膜的表面上的經標記的待測細胞。
2.權利要求1所述的方法，其中在步驟b)之前或在步驟c)之後塗覆至少一種另外的處理液。
3.權利要求1或2所述的方法，其中至少一種另外的處理液包含選自以下的試劑:用於清洗的試劑、用於固定生物結構的試劑，用於防止非特異性標記活動的試劑，或用於以另一種標記物標記待測細胞的試劑，其中所述另一種標記物不同於所述第一標記物。
4.上述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第二處理液包含適用於清洗或固定細胞或防止非特異性標記活動的試劑。
5.上述權利要求中任一項所述的方法，其中在步驟c)期間，在膜的背離所述待測細胞於步驟a)中停留側的一側上施加正壓，其中選擇正壓使得處理液經過所述膜的穿流得到阻止。
6.上述權利要求中 任一項所述的方法，其中在步驟d)期間，在膜的背離所述待測細胞於步驟a)中停留側的一側上施加負壓，其中選擇負壓使得所述處理液抽吸經過所述膜。
7.上述權利要求中任一項所述的方法，其中所述待測細胞為腫瘤細胞。
8.上述權利要求中任一項所述的方法，其中在步驟c)中選擇能使待測細胞在所述預定時間段內存活的處理液以及溫育條件。
9.上述權利要求中任一項所述的方法，其中檢測由所述待測細胞釋放的物質。
10.用於實施權利要求1~9中任一項所述的方法的裝置，其包括: a)適用於攔截待測細胞的多孔膜， b)用於將液體塗覆於所述膜上的手段， c)用於將液體擠壓經過膜的手段， d)用於調節膜前後的壓力差的手段， e)用於控制時間進程的手段，其可以對在膜上塗覆所述液體、所述液體以預定時間段停留在所述膜上以及所述液體受擠壓經過所述膜進行控制。 其中，用於調節壓力差的手段能在所述膜的背面產生< 50mbar的正壓，從而實現所述液體以預定時間段停留在所述膜上。
11.權利要求10所述的裝置，其中所述膜布置在載玻片上。
12.權利要求10或11所述的裝置，進一步包括用於收集受擠壓經過所述膜的液體的廢液容器。
【文檔編號】C12Q1/68GK103620058SQ201280030928
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年4月13日 優先權日:2011年5月20日
【發明者】K.弗雷德裡克, J.班戈特, W.古姆布雷科特, K.希爾陶斯基, P.波利卡, M.斯坦澤爾 申請人:西門子公司