用於對包括全血的生物流體執行免疫測定的配體分析中的結合標記和游離標記的虛擬分離的製作方法

2023-05-15 10:33:46

專利名稱：用於對包括全血的生物流體執行免疫測定的配體分析中的結合標記和游離標記的虛擬分離的製作方法
技術領域：
本發明涉及在人和動物的生物流體(諸如全血、血清、血漿、尿液、乳液、胸 膜液和腹膜液、以及精液)中通過電子手段對免疫檢測物質的有效檢測、量化和表徵， 在薄腔室中對靜態流體樣本執行該檢測、量化和表徵，所述腔室具有至少兩個平行平板 壁，所述至少兩個平行平板壁中的至少一個是透明的。
背景技術：
本發明涉及對所有免疫測定的性能的改進，其目前涉及通過在配體分析中執行 結合光學檢測標記和游離光學檢測標記的虛擬分離來代替從游離分析物分離出結合分析 物的物理分離，其中，雖然任意可光學檢測和量化的標記都行，但所述標記優選地為熒 光標記。下列頒發的美國專利中描述了該分析中所使用的腔室和用於測量這些腔室中的 分析物的儀器頒發給 S.C.Wardlaw 的 No.6,9^,953、No.6,869,570、No.6,866,823 ；以及 2007年4月19日公布的頒發給S.C.Wardlaw的美國專利申請US 2007/0087442。
在現有技術中，從游離分析物分離出結合分析物的物理分離由多種方法完成， 所述多種方法包括但不限於通過木炭或滑石粉來吸收游離標記；對包含有結合分析物 或未結合分析物的珠狀物(beads)的磁分離；通過諸如附著於試管壁的抗體之類的容器 來吸收結合標記分析物並且在針對結合了抗體的分析物使用二次析出抗體之後通過離心 法；以及上述專利和公開中所描述的方法。
下列美國專利中描述了結合目標分析物分析的現有技術物理分離的一些類 型5,834,217 ； 5,776,710 ； 5,759,794 ； 5,635,362 ； 5,593,848 ； 5,342,790 ； 5,460,979 ； 5,480,778 ；以及5,360,719，所有這些專利都頒發給了 R.A丄evine等人。在上述專利中， 通過離心法、或者其他物理方法(諸如傾析、過濾等)來執行從游離分析物分離出結合分 析物。
現有技術還描述了免疫測定的類型，其被稱為「均相免疫測定」。均相免疫 測定不需要從未結合分析物或游離分析物物理分離出結合分析物。「從游離分析物分離 出結合分析物」是通過利用相對較大抗體對酶的空間位阻影響並且通過對酶促作用的著 色產物或螢光產物進行量化來實現的。均相免疫測定的另外的方法利用螢光團的螢光淬 滅來從游離分析物區分出結合分析物。儘管這些方法極大地簡化了免疫測定的執行， 但是，它們通常僅對高濃度低分子量的分析物有用，這是因為諸如蛋白質(例如，胰島 素)、生長激素等之類的高分子量的目標分析物對酶也有幹擾並且可能影響淬滅。另外，這種均相類型的免疫測定通常沒有標準免疫測定的高靈敏度。
提供一種目標分析物的配體分析是非常理想的，在該配體分析中，對目標分析 物的量化是虛擬的，其可以通過電子手段來執行，從而在保持標準免疫測定的靈敏度的 同時還具有均相免疫測定的優點，以及可用於諸如類激素胰島素、生長激素等之類的大 尺寸目標分析物。發明內容
免疫測定用於分析諸如血液中的激素等之類的各式各樣的分析物。它們通過找 到特別結合至被測量目標分析物的特定結合物的通用技術起作用。此處，將結合物稱為 配體。此處，配體被限定為包括但不限於用於結合目標分析物的那些抗體、凝集素、適 配體或天然物質。將要被測量的樣本摻合有特定於目標分析物的配體以及標記型式的被 測量分析物。隨著對該混合物的培養，有標記目標分析物分子和無標記目標分析物分子 競爭配體上的結合部位。適當的時間段之後，通過任意多種方法將配體移除，並且對 結合到配體的標記與未結合的並在混合物中保持游離的標記進行比較。該結合/游離比 與目標分析物最初在樣本中的濃度相關，儘管結合標記或游離標記都可以給出相同的信 息。該比例的使用可以用於進行質量管理檢驗，其中，如果體積恆定，則結合的加上遊 離的所得的總數相對恆定。在本發明的實踐中也可以採用該質量管理。
根據本發明的一方面，提供一種用於針對可能存在於生物流體樣本中的目標分 析物材料對該流體樣本進行分析的方法。該方法利用流體樣本內配置的游離目標分析物 和結合目標分析物的虛擬分離，其涉及對樣本的電子掃描。該方法涉及將流體樣本置於 具有預定和固定高度的試驗腔室中，以便在該腔室中產生流體樣本的薄層。腔室的至少 一個壁(通常是頂壁)是透明的，以使得可以觀察到腔室中的樣本。在某些情況下，腔 室的頂壁和底壁都是透明的。腔室的高度(例如，通常為Iym至200 μιη)可以根據當 前應用而改變。例如，當要分析抗凝全血時，6 μ m的腔室高度是優選的，這是因為其在 血液樣本中造成了紅細胞的單細胞層以及散布的血漿空隙。
固定結構或者覆蓋有配體的珠狀物(legand-coated bead)的高度最佳地應該不小 於腔室高度的十分之一，並且理想地達到腔室的高度。這是因為，如果包圍結合有標記 的微粒或結構的處於游離狀態的標記(即，螢光團)的總量遠大於將要檢測到的結合標記 的最低量，則精確地確定結合到珠狀物或結構的標記的量的能力將由於信噪比的影響而 減小。數學上不存在對腔室高度的限制，但是由於被檢測標記的信噪比的實際限制，為 了實現最佳的功能，需要薄腔室和結構，其佔據圍攏在結構外圍的柱體的體積的至少十 分之一，並且從腔室的底部延伸至頂部。在配體附著於腔室頂部或底部而不是附著於結 構或珠狀物的示例中，上述比例適用，但是，所述分析最佳地應該被規劃為使得結合配 體區域之上的柱狀體積包含不多於結合到期望檢測的配體區域的最低量的十倍。可以通 過使腔室儘可能的薄或者可以通過改變反應的化學計量來減小該限制。
本發明的方法可以用於在現場護理時對病人的藥物過敏或過敏原敏感進行測 試。藥物過敏和過敏原敏感是常見且重要的問題。對病人和社會來說代價是昂貴的。例 如，對青黴素過敏的病人使用青黴素類藥物進行治療可能導致死亡或嚴重反應。在該討 論中，將青黴素用作代表性藥物是因為其是造成嚴重過敏反應的最常見的藥物類型。本發明並不限於對青黴素過敏的測試，而可以用於測試對其他藥物(例如，抗生素、肌肉 鬆弛藥、麻醉劑等)和過敏原的敏感性。
青黴素是廉價、有效且通常無毒的藥物。鑑於已感知的過敏，可以使用另一種 較少微生物靶向的藥物對認為其對青黴素過敏的病人進行治療。然而，這種替代藥物可 能對病人產生嚴重的副作用，並且給保健制度帶來巨大的開銷，因為新的藥物可能會比 青黴素藥物昂貴幾百或幾千倍。同樣重要的是社會的開銷，這種開銷與使用更廣譜的藥 物來代替更集中於目標組織的藥物時所發生的抗藥細菌、病毒、或其他感染病原物的興 起有關。因此，對具體病人、醫療服務提供者、以及社會來說重要的是，通過除了病人 給出病歷之外的方法來確定是否存在藥物過敏或過敏原敏感。本發明的一個目的是在病 人的全血或血漿樣本中檢測是否存在藥物過敏和/或過敏原敏感。
有充分的文件證明，許多聲稱對青黴素過敏的病人可能是不過敏的，並且類似 地，一些認為其不過敏的病人從其最後暴露以後可能已發展為過敏。據報告，大約80% 的認為其對青黴素過敏的病人實際上可以使用青黴素，因此，對於這些病人來說，對抗 生素選擇的限制是不必要的，而這種限制會潛在地導致不太有效、更大毒性以及更昂貴 的治療。
在任何地方，對檢測藥物過敏的能力的需要都大於對現場護理時處理病人的能 力的需要。醫師在他們的辦公室、急診室或醫院開藥都不需要為等待在體外或通過皮 試執行的試驗而耗費幾個小時或一天。皮試可以額外地暴露病人對試驗物質反應的危險 性，並且通過回憶反應具有導致過敏或增大過敏的理論上的可能性。目前，體外試驗是 複雜的，執行體外試驗是耗時的並且在其最有用很久之後才能將信息提供給醫師。另 外，許多藥物(包括青黴素類型的藥物)的過敏原性質可能是由於多於一個表位(epitope) 而引起的，並且精確的測試將需要對可能引起過敏反應的所有共同表位進行測試。通常 對有限數量的試驗過敏原及其表位執行文獻中充分描述了的RAST測試。
普遍認為，IgE介導的免疫反應是最嚴重的過敏反應(包括過敏性反應、蕁麻 疹、痢疾性腸道腫脹、以及由於氣道腫脹引起的呼吸道阻塞)的起因。一些專家認為， 其他免疫球蛋白類型也可能引起對藥物的過敏反應，但是對^G和IgM介導的藥物過敏 的過敏反應通常不危及生命並且更有可能是皮疹。
本發明的優點是其提供了一種優選地在現場護理時執行的方法，該方法確定IgE 的存在或對一種或多種藥物具有親和力的任意其他免疫球蛋白的存在，所述一種或多種 藥物是或者可能是在既定情景下指定使用的藥物。
所選標記是使用容易檢測並附著於配體的螢光團。但是，本發明不限於使用 螢光標記。如果需要在同一腔室中檢查是否存在可附著於珠狀物的多於一類的免疫 球蛋白，則可以使用多於一個顏色的螢光團。沒有附著抗原的珠狀物被用作對照物 (controls)。對照珠狀物可以在化學和幾何上類似於被覆蓋的珠狀物，而僅在顏色或者其 他使其被檢測到的方法(例如，螢光或者併入其結構中的螢光染料的組合)上不同。對照 珠狀物提供對照以使得可以將檢測(例如，來自針對附著於珠狀物的IgE的螢光標記抗體 的顯著的螢光信號，所述珠狀物包含被作為潛在過敏原而測試的藥物的決定簇(表位)) 與表示不覆蓋或沒有結合至表位的類似珠狀物的信號相比較。因此，非特異性結合被控 制並且將不會導致誤診。


圖1是根據現有技術的可用於對血液或其它樣本執行免疫測定的配體支撐表面 的示意性側視圖。
圖1(a)是根據現有技術的類似於圖1但是示出了洗去樣本之後的表面的視圖。
圖2是根據現有技術的類似於圖1但是示出了可用於對血液或其它樣本執行夾心 免疫測定的配體支撐表面的示意性側視圖。
圖2(a)是根據現有技術的類似於圖2但是示出了將第二標記加入樣本之後樣本 的視圖。
圖2(b)是根據現有技術的類似於圖2(a)但是示出了洗去樣本之後的表面的視 圖。
圖3是根據本發明形成的採樣腔室的第一實施例的平面圖，該腔室包含添加有 血液樣本配體支撐分析物捕獲微粒的抗凝全血樣本。
圖4是圖3所示採樣腔室的一部分的側視截面圖，該部分包含一個配體覆蓋的目 標分析物捕獲微粒。
圖5是試驗腔室的平面圖，類似於圖4所示，其示出了血液樣本中包含一個配體 覆蓋的目標分析物捕獲微粒的樣本區域，並且還示出了不包含配體覆蓋的目標分析物捕 獲微粒而僅包含游離的標記目標分析物的樣本區域。
圖6是部分配體覆蓋的目標分析物捕獲表面的分段截面圖，其中所述表面的部 分覆蓋有配體而其他部分不覆蓋有配體。
圖7是具有如圖6所示的頂面的封閉腔室的截面示意圖。
圖8是圖6中所示表面的平面圖。
圖9是圖6和圖8所示捕獲表面上的配體帶的發光蹤跡。
具體實施方式
現在參照附圖，圖1和圖1(a)示出了現有技術的競爭性免疫測定(也被稱為 「平衡分析」)，其通常用於低分子量的分析物，諸如甲狀腺激素、甲狀腺素，其中標號 1表示通過任意多種已知方法將特定於目標分析物的配體2附著其上的表面。表面1可 以是玻璃或塑料管或者微粒的透明壁。溶液3包含無標記目標分析物4 (未知)和有標記 目標分析物5的混合物。一段時間(可以是從幾分鐘到幾小時，這取決於目標和標記) 之後，有標記目標分析物5和無標記目標分析物4將相互平衡，其中許多(但通常不是全 部)配體部位2將被有標記目標分析物5或無標記目標分析物4佔據。此時(圖la)，以 保留結合到配體2的有標記目標分析物5的方式將混合物3與配體支撐表面1分離。然 後，測量結合到表面1的有標記目標分析物5 (參見圖la)，並且游離的有標記目標分析物 也可以被測量或者通過以下方法計算總量=游離的+結合的，或者結合的=總量-游離 的。結合目標分析物與游離目標分析物之比與樣本中的總目標分析物量成反比。
圖2至圖2(b)示出了通常被稱為「夾心」分析的配體分析，其中利用了兩種不 同的配體。表面1具有以上述類似方式結合到其上的配體2 ( 「結合配體」)，並且包含 目標分析物4的樣本被引入溶液3並且在表面1上培養。立即或者經過適當的時間段之後，不同的標記配體6被引入溶液，該標記配體6結合到目標分析物4上與結合配體2的 部位不同的部位(圖2a)。實際上，這造成了在中心包含目標分析物4的「夾心」。然 後，從表面1洗去游離的有標記配體6以使其離開覆蓋著有標記部位的表面1 (圖2b)。 然後，對結合到表面1的有標記分析物4進行量化，並且因此獲得的信號與原始樣本中目 標分析物4的量成正比。通常認為夾心分析更精確並且某種程度上更準確，但是其僅可 適用於具有至少兩個不同的可結合配體的部位的目標分析物分子。
在上述任何一種分析中，從游離標記分離結合標記被認為是對生產過程的挑戰 方面之一，並且通常需要一個或多個機械上複雜的步驟，諸如離心、傾析、衝洗等。因 此，使這些測試自動化的儀器也相對複雜並且需要多種操作。
與之相比，本發明的方面提供了一種「虛擬分離」的方法，其中結合標記和遊 離標記不進行物理上的分離，而通過試驗細胞構造和來自試驗細胞中不同區域的信號的 數學運算的組合來進行分離。因此，可以實現簡化的自動化配體分析的方法和設備。
根據本發明的方面，執行免疫測定或者配體分析，其中結合物是配體或者對目 標分析物具有高親和力的其他物質。
例如，可以使用在美國專利公開NO.2007/0M3117和No.2007/0087442以及美國 專利No.6,866,823中描述的樣本容器和成像儀器系統來實現根據本發明的分析，所有這些 專利公開和專利以引文的方式整體併入本文。但是，本發明的分析不限於這些腔室和成像裝置。
本公開以及權利要求中所使用的術語「免疫測定」意味著基於抗體的結合劑和 不基於抗體的結合劑兩者。後者的示例包括但不限於用於結合維生素B12的內在因子、 以及用於結合生物素標記目標的抗生素蛋白或者相反。
在本發明的方面下，提供了一種配體附著的限定明確並按照自然規律限定的表 面，並且然後，從數學上對來自結合到該表面的標記的信號與來自可能留在溶液中的任 意周圍的游離標記的信號進行區分。通常存在下述兩種情況。
圖3是樣本腔室組件40的截面的平面圖，該腔室組件40包含抗凝全血樣本。腔 室組件40包括上壁和下壁7 (參見圖4)，其中至少一個壁是透明的。優選地，兩個壁7 都是透明的。腔室組件40包括隔離構件42 (參見圖幻，其可以任意地位於腔室組件40 的內部。隔離構件42優選地為球狀的，並且確定和控制腔室組件40的高度。在分析抗 凝全血樣本的情況下，具有約6μιη直徑的隔離組件42尤其有效。包含於腔室組件40中 的血液樣本將包括各紅細胞44和紅細胞結塊46。血液樣本還包括不包含任何形成的血 液成分的空血漿空隙區48。最後，血液樣本還包括多個配體覆蓋的目標分析物捕獲微粒 8，其優選地為球狀的形式。目標分析物捕獲微粒8任意地分布在整個血液樣本中，並且 其針對血液樣本分析的直徑可以為約3μιη-4μιη，從而使得可以容易地在血液樣本中檢 測到它們。
圖4示出了圖3所示腔室組件40的結構。腔室組件40由頂壁和底壁7限定，其 中至少一個壁必須為透明的。腔室內為微粒8，其表面被配體9覆蓋。只要其體積可以被 確定，微粒8可以為任意形狀，但是其體積優選地為球狀。微粒8可以為配體可附著的任 意材料，諸如玻璃、聚苯乙烯等。微粒不限於任何特定直徑(例如，2 μ m至100 μ m)， 並且該直徑可以根據被分析流體以及所使用腔室高度而改變。壁7之間的距離通常不小於微粒8的直徑，但是上限距離將取決於微粒8的性質。
混合物10以結合圖1描述的類似方式包含目標分析物11和有標記目標分析物12 兩者。在經過適當的培養時間段後，對來自結合目標分析物和游離目標分析物的信號進 行分析。
圖5是試驗腔室組件的頂視圖，類似於圖4所示，其示出了混合物10的未限定 的延伸區域13。在該延伸區域內，來自標記12的總信號被收集於限定區域14上，該區 域不限於任意特定形狀。收集的方法可以是螢光掃描(在螢光標記的情況下)或者放射 性核苷酸掃描(在放射性標記的情況下)。該區域被選擇為使其包括具有已知的或可測量 的直徑的至少一個微粒8。也對不包含微粒的相鄰限定的區域16進行測量。來自區域 16的信號表示來自未結合標記的信號，因為在區域16的位置處沒有結合部位。但是， 來自區域14的信號具有來自結合標記和來自游離標記兩者的信號。可以以多種方法來確 定每個信號的影響。如果微粒為球狀的(其為優選的形狀)，則可以根據其直徑來計算 其體積(Vp)，可以使用從標記收集信號的同一光學系統來測量該直徑。限定區域14的 體積(V14)和限定區域16的體積(V16)均可以根據其寬度和腔室深度容易地計算出來。 假設與限定區域14和16相關的腔室體積相同，則來自游離標記的信號等於來自區域16 的信號(S16)。S卩，在不存在來自微粒(結合標記)的信號的情況下，來自區域14的信 號應該為Sf = S16X (V14-Vp)。任意超過該量的信號6b)來自結合標記Sb = S14-Sf。與區域14內的體積相比，如果微粒的體積較小，則不需要進行體積校正。所 要確定的是掃描的每個像素(或者像素的集群)的平均標記信號強度。本申請中所使用 的術語「像素」可以包括一個或多個相鄰像素的含義。
在第二並且是最優選的實施例中，配體附著於腔室本身的至少一個表面。圖6 示出了(上)透明腔室表面17，其可以是玻璃或塑料(諸如聚丙烯的或者聚苯乙烯)，該 表面上附著有通過任意多種已知的方法均勻覆蓋的配體。形成均勻覆蓋之後，通過機械 或化學方法或者通過雷射燒蝕從一個或多個區域18選擇性地移除配體，相應地在相鄰區 域19中留下活性配體。
圖7示出了該表面17作為包含混合物20的薄腔室的部分，其包括無標記目 標分析物21和有標記分析物22。該腔室高度優選地小於約1mm，並且最優選地小於 200 μ m( S卩，在Iym至200 ym的範圍內)。如上所述，在經過適當時間段之後，有 標記分析物和無標記分析物將與配體達到平衡，留下一部分結合至表面的有標記分析物 23，但是僅在配體剩餘的區域中。在螢光標記的情況下，使用適當波長的光源M來照亮 腔室表面17以激發標記中的螢光。透鏡25收集通過濾光器沈過濾並且投射到析像裝 置27上的螢光發射，所述析像裝置可以為電耦合器件(CCD)、互補型金屬氧化物半導體 (CMOS)等。可替換地，光源可以為聚焦極小的雷射，其將光點移動到腔室上，並且在 該情況下，光收集裝置27可以為簡單的光電管或者光電倍增器。
圖8所示腔室觀的示意性頂視圖示出了任何一種處理的最終結果，其中活性配 體四和燒蝕配體30呈現為一系列垂直條紋。來自圖7設備的掃描線由線a-a表示。圖 9是沿掃描線a-a截取的波形表示，其中峰值31是來自活性配體的信號，而波谷32來自 非活性區域。因此，結合標記濃度由從波峰到波谷的距離表示，並且波谷的高度表示遊 離標記。活性區域和非活性區域均不限於任意特定幾何形狀。
在一些實施例中，可以使用非常柔韌的腔室壁17，通過對其施加相對較小的點 負荷其可以局部地發生彈性變形。腔室壁17的彈性性能使得可以進行獨特的選擇以捕 獲非常微弱的「結合」信號。如果對腔室壁17進行按壓(諸如通過成像區域之外的細 針)，則游離標記22被從局部視域側向排出，從而其信號顯著地減小。隨著該「背景」 信號的減小，可以檢測到來自結合標記23的非常微弱的信號。
如果標記螢光為不同波長，或者如果分析物1的配體和分析物2的配體分別處於 腔室中不同的物理位置，則可以同時測量多種分析物。
根據本發明方法的方法示例包括執行分析以確定病人是否可能對一種或多種藥 物(例如，抗生素，包括青黴素等)或過敏原過敏。通過使用具有分析腔室的萃取柱 (cartridge)來執行該分析，所述分析腔室包含大量(例如，成千上萬)抗生素表位覆蓋的 珠狀物以及未覆蓋抗生素表位的對照珠狀物。為了針對多於一個抗生素表位進行分析， 每個特定抗生素表位與一種特定類型的珠狀物匹配，以用於進行識別。可以使用諸如珠 狀物顏色、大小、形狀等之類的特徵來相互區分與不同表位相關的珠狀物群，例如，表 位A被覆蓋在白色珠狀物上，表位B被紅色珠狀物覆蓋等。少量(例如，0.5至5微升) 毛細管樣本或者靜脈抗凝全血被沉積在腔室中(例如，通過毛細管作用被吸入腔室)，並 且一旦關閉了腔室，則將血液引入腔室內包含珠狀物的區域。在第一時間段(例如，幾 分鐘到一小時)的培養之後，樣本內存在的免疫球蛋白結合到那些覆蓋有免疫球蛋白分 子對其具有特定親和力的藥物(或過敏原)的珠狀物上。樣本內存在的不同的免疫球蛋 白分子對不同的藥物(或過敏原)可能具有特有的不同親和力。組合的珠狀物和血液樣 本還混合有針對被測免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白E( 「IgE」 )等)並且可以被培養 第二時間段(例如，幾秒鐘到幾分鐘)的一種或多種有標記抗體。可以對針對被測免疫 球蛋白的抗體標記螢光團以生成「有標記抗體」。然後，將樣本引入上述類型的分析腔 室。兩個階段的培養所需的實際時間可以根據經驗來確定，並且可能取決於當前抗體的 親抗原性(avidity)和濃度。通過以上述一種或多種方式從游離的和結合的有標記抗體收 集信號來分析布置在腔室內的樣本。如果分析涉及確定多於一種藥物的過敏易感性、或 者對多於一種過敏原的敏感性，則該分析還將包括根據不同類型的被覆蓋珠狀物來區分 結合的有標記抗體。結合標記表示那些結合到被測免疫球蛋白的有標記抗體，該免疫球 蛋白結合到覆蓋有該特定免疫球蛋白微粒與其具有特定親和力的藥物(或者過敏原)的微 粒。可以通過測量被成像微粒的總信號並且減去包括在圖像中的圍繞該微粒的最接近的 區域中的周圍游離信號，來計算結合到微粒上的標記量。可以通過測量相同類型的有標 記的被覆蓋珠狀物和無覆蓋珠狀物來計算給定類型的被覆蓋珠狀物上的標記量之比。因 此，可以通過實踐本發明來實現確定樣本是否包含對給定藥物(或過敏原)具有親和力的 免疫球蛋白分子。另外，通過使用每種類型覆蓋有不同藥物(或過敏原)的不同類型的 可檢測珠狀物或微粒，在本發明的情況下可以同時執行對多於一種藥物過敏(或者對多 於一種過敏原敏感)的檢測。對於所有藥物過敏(過敏原敏感)測試，如果微粒大小和 組分與被覆蓋微粒相同，則可以使用單一類型的微粒(或珠狀物)作為對照微粒。根據 需要，可以使用多於一種對照微粒，對照微粒的大小和與其相比較的覆蓋有藥物或過敏 原的微粒的大小相匹配。
在一些實施例中，在第二次培養(包含有標記配體的培養)之後，所述方法包括以下步驟，即對腔室內布置的包含未結合標記的樣本添加不包含標記的液體，從而主要 留下附著於固定珠狀物或結構的標記。隨後，如前所述實現結合和游離的虛擬分離，但 是對包含標記的液體的移除可以用來以複雜性為代價增大分析的靈敏度。由於腔室的總 容量以及腔室中的液體量處於小於一至幾微升的範圍內，因此對腔室添加大量(例如， 幾十微升)無標記流體將會移除大部分包含標記的流體，而通過利用結合與游離的虛擬 分離處理來移除剩餘的游離標記信號。
上述方法提供了一種新的和有利的技術，用於確定包含配體的腔室區域或者沒 有針對樣本內目標分析物的配體的腔室區域內結合的和游離的有標記目標分析物的量， 並且從而提供與樣本有關的定性和定量信息。在一些情況下，諸如知道樣本中是否存在 目標分析物之類的定性信息對於當前分析是足夠的信息。這種情況的示例是當存在IgE 為正常狀態時，確定樣本是否具有針對給定藥物的該特定IgE。如果需要更多的定量信息 (例如，樣本中目標分析物的濃度)，則可以將所獲得的結合/游離信息與標準曲線一起 使用以確定該定量信息(例如，樣本內的目標分析物的量)，該標準曲線是針對所考慮的 特定目標分析物和樣本根據經驗得出的。已知可用於與所有類型的免疫測定一起使用的 標準曲線，並且本發明不限於任意特定標準曲線。可以在分析之前或者與分析同時實現 樣本虛線，並且將其結果存儲於執行分析的儀器上。
儘管關於本發明的特定具體實施例描述和示出了本發明，但是，本領域技術人 員應該理解的是，在不脫離本發明的思想和範圍的情況下，可以進行各種形式和細節的 改變。
權利要求
1.一種用於執行流體樣本的目標分析物免疫測定的方法，包括以下步驟在腔室內布置流體樣本；在樣本內提供可檢測標記，所述標記用於結合至目標分析物以產生有標記的目標分 析物，所述有標記的目標分析物在樣本中是可檢測到的；在腔室內提供至少一個第一表面區域，所述第一表面區域具有附著到其上的目標分 析物特定配體，所述目標分析物_特定配體用於選擇性地將樣本中存在的目標分析物結 合至第一表面區域；在腔室內提供至少一個第二表面區域，所述第二表面區域沒有用於選擇性地將樣本 中存在的目標分析物結合至第二表面區域的目標分析物_特定配體；光學掃描所述至少一個第一表面區域，以檢測和記錄所述至少一個第一表面區域中 有標記目標分析物的每個像素分布的平均標記信號強度；光學掃描所述至少一個第二表面區域，以檢測和記錄所述至少一個第二表面區域中 有標記目標分析物的每個像素分布的平均標記信號強度；以及確定所述至少一個第一表面區域中的有標記目標分析物的量、所述至少一個第二表 面區域中的有標記目標分析物的量、以及所述第一和第二表面區域中有標記目標分析物 的量的比中的至少一個。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述腔室具有1μ m至200 μ m的高度。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述腔室具有約6μ m的高度。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述流體樣本為全血。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述腔室具有3μιη至15μιη範圍內的高度。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述腔室具有至少一個壁，並且在該壁上布置所 述至少一個第一表面區域和所述至少一個第二表面區域。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述至少一個第一表面區域和所述至少一個第二 表面區域布置在在所述腔室內布置的物體上。
8.根據權利要求1所述的方法，還包括以下步驟使用在腔室的第一表面區域中確 定的有標記目標分析物的總量和在腔室的第二表面區域中確定的有標記目標分析物的總 量來確定流體樣本中目標分析物的總量。
9.根據權利要求8所述的方法，其中確定流體樣本中目標分析物的總量的步驟使用標 準曲線。
10.根據權利要求8所述的方法，還包括以下步驟使用在流體樣本中確定的有標記 目標分析物的總量和在腔室的第二表面區域中確定的有標記目標分析物的總量來確定流 體樣本中結合目標分析物的總量。
11.根據權利要求10所述的方法，其中確定流體樣本中結合目標分析物的總量的步驟 使用標準曲線。
12.根據權利要求1所述的方法，其中所述可檢測標記是可檢測的螢光分子。
13.一種用於執行流體樣本的目標分析物免疫測定的方法，包括以下步驟在腔室內布置流體樣本；在樣本內提供附著於第一配體的可檢測標記，所述第一配體特定於目標分析物的表 位，所述第一配體用於結合至目標分析物以產生有標記的配體目標分析物，所述有標記的配體目標分析物在樣本中是可檢測到的；在腔室內提供至少一個第一表面區域，所述第一表面區域具有附著到其上的目標分 析物特定第二配體，所述目標分析物_特定第二配體用於選擇性地將樣本中存在的目標 分析物結合至第一表面區域；在腔室內提供至少一個第二表面區域，所述第二表面區域沒有用於選擇性地將樣本 中存在的目標分析物結合至第二表面區域的目標分析物_特定第二配體；光學掃描所述至少一個第一表面區域，以檢測和記錄所述至少一個第一表面區域中 有標記配體目標分析物的每個像素分布的平均標記信號強度；光學掃描所述至少一個第二表面區域，以檢測和記錄所述至少一個第二表面區域中 有標記配體目標分析物的每個像素分布的平均標記信號強度；以及確定所述至少一個第一表面區域中的有標記配體目標分析物的量、所述至少一個第 二表面區域中的有標記配體目標分析物的量、以及所述第一和第二表面區域中有標記配 體目標分析物的量的比中的至少一個。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述目標分析物是給定子類型的免疫球蛋白。
15.根據權利要求13所述的方法，其中所述第一表面區域布置在第一微粒之上。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述第一微粒是覆蓋有第一藥物的第一類型的 微粒。
17.根據權利要求15所述的方法，其中所述第二表面區域布置在第二微粒之上，所述 第二微粒是沒有藥物覆蓋的第一類型的微粒。
18.根據權利要求13所述的方法，其中所述第一表面區域布置第一類型的第一微粒和 第二類型的第二微粒之上，所述第二類型不同於所述第一類型。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述第一微粒覆蓋有第一藥物，而所述第二微 粒覆蓋有第二藥物，所述第二藥物不同於所述第一藥物。
20.根據權利要求18所述的方法，其中所述第二表面區域布置在第三微粒之上，所述 第三微粒是沒有藥物覆蓋的第一或第二類型的微粒。
21.根據權利要求13所述的方法，其中所述流體樣本是全血。
22.根據權利要求13所述的方法，其中所述腔室具有3μιη至15μιη範圍內的高度。
全文摘要
對人和動物的生物流體(諸如全血、血清、血漿、尿液、乳液、胸膜液和腹膜液、以及精液)通過電子手段執行免疫檢測物質的檢測和表徵，所述流體包含於薄腔室中形成靜態流體樣本，所述腔室具有至少兩個平行平板壁，所述平行平板壁中的至少一個是透明的。
文檔編號G01N33/543GK102027370SQ200980116791
公開日2011年4月20日 申請日期2009年4月2日 優先權日2008年4月2日
發明者史蒂芬·C·沃德洛, 羅伯特·A·萊文 申請人:艾博特健康公司