破除南方紅豆杉種子休眠的方法
2023-05-21 23:58:31
專利名稱：破除南方紅豆杉種子休眠的方法
破除南方紅豆杉種子休眠的方法技術領域
本發明屬於植物種子萌發技術領域，尤其是涉及一種破除南方紅豆杉種子休眠的方法。
背景技術：
南方紅豆杉是紅豆杉科紅豆杉屬植物，廣泛分布在歐洲、北美洲及東亞等北半球地區，國內主要分布在我國長江流域及其以南各省。現代研究表明，其主要含有紫杉醇、10-脫乙醯巴卡亭III等紫杉烷類成分，以及少量的黃酮和多糖類等成分。其中，抗癌活性成分紫杉醇可通過抑制腫瘤細胞微管解聚而誘導癌細胞的凋亡，因其獨特的抗癌機制和顯著的療效而被用於治療肺癌、乳腺癌、卵巢癌和食管癌等惡性腫瘤。但紫杉醇在紅豆杉屬植物中含量普遍很低，其需求量逐年增加，剝皮、挖根、亂採濫伐等對紅豆杉屬植物的生存造成空前的壓力。大量的砍伐不僅對紅豆杉屬植物的物種保護和地區分布帶來威脅，而且也會造成資源的枯竭和物種的滅絕。
南方紅豆杉種子具有深休眠，種皮的透性、胚的發育情況、種子的發芽抑制物、溫度等影響其萌發，自然條件下需要兩冬一夏才能萌發，未經特殊處理的形態成熟種子，一般需一年以上層積催芽方能解除休眠，發芽率低且不整齊，往往造成有限種子資源的極大浪費。南方紅豆杉存在完整種皮時，種子處於明顯的無氧呼吸狀態，而高度缺氧條件下，可導致種子內抑制物的形成，從而影響種子的生理後熟和萌發。種子形態成熟時，胚基本成熟，離體培養可以生長成苗；但外種皮的不透氣性和胚中的某些抑制物質可能是抑制南方紅豆杉種子萌發的因素。有研究表明南方紅豆杉種子中含有的可能具有發芽抑制活性的物質共有27種，有機酸類化合物9種，酯類化合物7種，醇類化合物7種，胺類化合物I種，醚類化合物I種，未知物質2種。種子種皮效應確實為影響南方紅豆杉種子萌發的因素之一，主要包括種皮的不透氣性和機械障礙。
為此，人們進行了長期的探索，提出了各種各樣的解決方案。例如，中國專利文獻公開了一種打破南方紅豆杉種子休眠的方法[申請號:201110113040.3]，其特徵在於利用變溫處理南方紅豆杉的種子，包括如下步驟:a、浸泡；b、貯藏；c、播種。通過該方法所實現了播種當年出苗率可達30%。第二年還能再出苗50%左右，提高了育苗效率。上述方案雖然在一定程度上提高了南方紅豆杉種子萌發速度和萌發率，但是仍然存在著操作較為繁瑣，成本較高，發芽率較低等技術問題。還有人發明了一種快速打破南方紅豆杉種子休眠的方法[申請號:201210201360.9]，包括:(I)種子外種皮剝離:利用機械破殼，手工剝離外種皮；(2)外植體消毒:依次經70%酒精消毒90s和0.1%氯化汞消毒12min，無菌水衝洗5次後備用；(3)種子預處理:用無菌水密封常溫浸種1-5天；(4)分離合子胚；(5)試管苗的離體培養:將種胚接種到試管苗誘導培養基上，可以獲得99.9%的種子萌發率。這種方法雖然有效提高了發芽率，但是需要將種子外種皮剝離，顯然操作操作，種子外種皮剝離過程中容易導致種胚被損壞，整個過程費時費 力。發明內容
本發明的目的是針對上述問題，提供一種易於實施，成本較低，能夠有效提高南方紅豆杉種子發芽率的破除南方紅豆杉種子休眠的方法。
為達到上述目的，本發明採用了下列技術方案:本破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特徵在於，本方法包括下述步驟:
A、酸蝕處理:將南方紅豆杉種子浸泡於質量濃度為55% 65%硫酸的中2 4小時，取出後用流水衝洗12 36小時；
B、浸泡處理:將酸蝕後的南方紅豆杉種子浸泡於預先配置的含有萌發刺激素和細胞分裂素的混合溶液中至少3小時，取出後在清水中浸泡至少3天；
C、層積處理:將浸泡後的南方紅豆杉種子進行低溫層積處理或變溫層積處理。
硫酸處理在加快胚形態後熟方面具有顯著效果，原因在於濃硫酸處理改善種皮透氣性，加快營養物質轉化；另外濃硫酸處理過程中所釋放的短暫熱量有可能激活與代謝和呼吸相關的酶，加快種子完成形態發育濃硫酸處理效果明顯，但易受種子個體發育差異、處理放熱、處理強度以及處理後衝洗狀況等因素的影響，使得處理時間難以掌握，過度浸泡有可能腐蝕種子。因此本發明將濃硫酸稀釋至質量濃度為55% 65%後再對種子進行酸蝕處理，這樣更容易確定酸蝕時間。濃硫酸優化的質量濃度為60%。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，在上述的步驟A中，所述的硫酸的質量濃度為58%-62%，浸泡時間為2.5 3.5小時，流水衝洗時間為20 28小時。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，在上述的步驟B中，所述的混合溶液為外源生長調節劑，該外源生長調節劑包括GA3溶液、6-BA溶液和愛多收溶液，且外源生長調節劑浸泡時間為20 28小時。
GA3是一種萌發刺激物質，在種子萌發的過程中，它能誘導產生水解酶，使種子中的貯藏物質從大分子水解為可溶性的小分子，如澱粉水解為糖，蛋白質水解為胺基酸，從而為胚所利用，促進胚的生長和種子的萌發。6-BA屬於細胞分裂素類，對植物不同生長過程中起著重要作用，它能促進細胞分裂，打破植物休眠。愛多收有效成份是單硝化愈創木酚鈉，是植物細胞賦活劑，能迅速滲透到植物體內，以促進細胞的原生質流動，加快植物髮根速度，對植物髮根、生長、生殖及結果等發育均有不同程度的促進作用。GA3、6-BA和愛多收濃度過高或過低均不利於種子發芽。GA3溶液的濃度過高會抑制胚的生長。愛多收溶液濃度過高或者過低都不利於葫蘆種子萌發率的提高。這與愛多收本身的雙重作用有關，即低濃度促進種子萌發，而濃度過高時對植物有抑制作用。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，所述的GA3溶液的質量濃度為180 220mg.Γ1 ;所述的6-BA溶液的質量濃度為4 6mg.I/1 ;所述的愛多收溶液稀釋5800 6200倍。愛多收溶液稀釋5800 6200倍是指愛多收稀釋5800 6200倍。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，所述的GA3溶液的優化質量濃度為200mg*r1 ;所述的6-BA溶液的優化質量濃度為5mg -T1 ;所述的愛多收溶液優化稀釋倍為6000 倍。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，在上述的步驟B中，所述的混合溶液為混合營養液，該混合營養液包括GA3、6-BA、硼酸、檸檬酸、維生素E、維生素D、多效唑、穀氨酸鈉、甘氨酸、吲哚丁酸、硝酸銨、KN 03、PEG，且混合營養液浸泡時間為3.5 4.5小時。
混合營養液中GA3、6_BA等可調節代謝，誘導種子萌發酶的生成，促進萌發；維生素E、維生素D、穀氨酸鈉、甘氨酸等可以在種子萌發過程中提高其所需要的營養成分。ΚΝ03、PEG等具有滲透調節作用，可以去除種皮和胚中不透氣的蠟質；硼酸、檸檬酸、多效唑、吲哚丁酸、硝酸銨等可促進種子萌發。PEG是一種高分子滲壓劑，可以提高種子的發芽率、幼苗活力等。鉀是植物體內各種重要酶的活化劑，促進糖分運輸、轉化及氮代謝，激活種子脫氫酶活性和增加呼吸強度，調節溶液水勢延緩種子吸水過程，使種子在萌發前有足夠的時間進行膜系統修復和重要酶系的活化，改善細胞內環境和代謝狀態，從而促進種子萌發。KNO3滲調處理打破休眠，促進種子萌發有一定的作用。檸檬酸、蘋果酸等有機酸可以刺激植物生長，並可以將其作為生長調節物質，在種子萌發的前處理中用有機酸浸種具有有促進種子萌發、打破休眠、提高種子活力的效應。多效唑作為一種植物生長調節物質，多效唑浸種可顯著提高決明子幼苗的葉綠素和可溶性糖含量，有利於光合產物的積累，增強幼苗根系活力，提高種子的簡易活力指數。對植物種子用少量硼酸處理，不僅能增強作物的抗旱、抗寒、抗病能力，還可以促進種子發芽。吲哚丁酸是人工合成的生長素類植物生長調節劑，對種子萌發和幼苗生長有一定的促進作用。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，所述的混合營養液的質量份數:GA3為0.8 1.2份、6-BA為1.8 2.2份、硼酸為0.8 1.2份、檸檬酸為0.8 1.2份、維生素E為0.8 1.2份、維生素D為0.8 1.2份、多效唑為1.8 2.2份、穀氨酸鈉為3.5 4.5份、甘氨酸為3.5 4.5份、吲哚丁酸為0.8 1.2份、硝酸銨為0.8 1.2份、KNO3為0.8 1.2份、PEG為4.5 5.5份、餘量為水。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，所述的混合營養液的優化質量份數:GA3為I份、6-BA為2份、硼酸為I份、朽1檬酸為I份、維生素E為I份、維生素D為I份、多效唑為2份、穀氨酸鈉為4份、甘氨酸為4份、吲哚丁酸為I份、硝酸銨為I份、KNO3為I份、PEG為5份、餘量為水。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，在上述的步驟C中，所述的低溫層積處理的溫度為2 5°C、沙子溼度為65% 75%、層積時間為42 48天。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，在上述的步驟C中，所述的變溫層積處理過程如下:放置3. 5 4.5°C冰箱處理38 42天，每隔4 6天翻動檢查一次，保持種子溼潤；然後取出，篩掉沙子，薄層陰乾，移至20 24°C恆溫室沙藏48 52天；最後，3.5 4.5°C低溫沙藏28 32天。
與現有的技術相比，本破除南方紅豆杉種子休眠的方法的優點在於:省時、有效、經濟地破除休眠方法，以解決其休眠深、萌發難且發芽率低的問題，並為種子種苗市場流通提供標準，保證種子質量。將其運用於實際生產栽培中，提高種子資源的利用率，對南方紅豆杉的育種栽培發展具有重大的意義。
具體實施方式
本破除南方紅豆杉種子休眠的方法包括下述步驟:
A、酸蝕處理:將南方紅豆杉種子浸泡於質量濃度為55% 65%硫酸的中2 4小時，取出後用流水衝洗12 36小時；
B、浸泡處理:將酸蝕後的南方紅豆杉種子浸泡於預先配置的含有萌發刺激素和細胞分裂素的混合溶液中至少3小時，取出後在清水中浸泡至少3天；
C、層積處理:將浸泡後的南方紅豆杉種子進行低溫層積處理或變溫層積處理。
在上述的步驟A中，硫酸的質量濃度為58%_62%，浸泡時間為2.5 3.5小時，流水衝洗時間為20 28小時。
在上述的步驟B中，所述的混合溶液為外源生長調節劑，該外源生長調節劑包括GA3溶液、6-BA溶液和愛多收溶液，且外源生長調節劑浸泡時間為20 28小時。具體地說，GA3溶液的質量濃度為180 220mg.Γ1 ;所述的6-BA溶液的質量濃度為4 6mg.Γ1 ;所述的愛多收溶液稀釋5800 6200倍。愛多收溶液稀釋5800 6200倍是指愛多收稀釋5800 6200倍。其中，GA3溶液的優化質量濃度為200mg.Γ1 ；6-BA溶液的優化質量濃度為5mg.Γ1 ;愛多收溶液優化稀釋倍為6000倍。
作為另一種方案，在上述的步驟B中，所述的混合溶液為混合營養液，該混合營養液包括GA3、6-BA、硼酸、檸檬酸、維生素E、維生素D、多效唑、穀氨酸鈉、甘氨酸、吲哚丁酸、硝酸銨、KNO3> PEG,且混合營養液浸泡時間為3.5 4.5小時。具體地說，混合營養液的質量份數:GA3為0.8 1.2份、6-BA為1.8 2.2份、硼酸為0.8 1.2份、檸檬酸為0.8 1.2份、維生素E為0.8 1.2份、維生素D為0.8 1.2份、多效唑為1.8 2.2份、穀氨酸鈉為3.5 4.5份、甘氨酸為3.5 4.5份、吲哚丁酸為0.8 1.2份、硝酸銨為0.8 1.2份、KNO3為0.8 1.2份、PEG為4.5 5.5份、餘量為水。其中，混合營養液的優化質量份數:GA3為I份、6-BA為2份、硼酸為I份、朽1檬酸為I份、維生素E為I份、維生素D為I份、多效唑為2份、穀氨酸鈉為4份、甘氨酸為4份、吲哚丁酸為I份、硝酸銨為I份、KNO3為I份、PEG為5份、餘量為水。
在上述的步驟C中，所述的低溫層積處理的溫度為2 5°C、沙子溼度為65% 75%、層積時間為42 48天。
作為另一種方案，在上述的步驟C中，所述的變溫層積處理過程如下:放置3.5 4.5°C冰箱處理38 42天，每隔4 6天翻動檢查一次，保持種子溼潤；然後取出，篩掉沙子，薄層陰乾，移至20 24°C恆溫室沙藏48 52天；最後，3.5 4.5°C低溫沙藏28 32天。
實施例1 (含對比實施例):
本實施例所用試劑 如下:GA3:分析純，上海藍季科技發展有限公司，批號:110418 ；6-苄氨基腺嘌呤(6-BA):分析純，上海藍季科技發展有限公司，批號:110505 ;愛多收:分析純，旭化學有限公司，批號:20110701 ;濃硫酸:分析純，杭州高晶精細化工有限公司，批號:20101009 ；NaC10:分析純，杭州高晶精細化工有限公司，批號=20101230 ;無水乙醇:分析純，金華市先科化工廠，批號:110404。
①種子選取和處理
選取飽滿的南方紅豆杉種子，用質量濃度60%濃硫酸浸泡3小時，流水衝洗24小時，分別配製0、50、200、400mg.L-1的GA3溶液，0、5、10、20mg.L—VBA溶液，將愛多收溶液分別稀釋2000、4000、6000倍。
正交實驗因素水平表和試驗安排表分別見表2-1和表2-2。種子浸泡24小時後，蒸餾水衝洗，然後再將其浸泡於清水中4天。試驗重複3次。
表1-1試驗因素和水平表
權利要求
1.一種破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特徵在於，本方法包括下述步驟: A、酸蝕處理:將南方紅S.杉種子浸泡於質量濃度為55% 65%硫酸的中2 4小時,取出後用流水衝洗12 36小時； B、浸泡處理:將酸蝕後的南方紅豆杉種子浸泡於預先配置的含有萌發刺激素和細胞分裂素的混合溶液中至少3小時，取出後在清水中浸泡至少3天； C、層積處理:將浸泡後的南方紅豆杉種子進行低溫層積處理或變溫層積處理。
2.根據權利要求1所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特徵在於，在上述的步驟A中， 所述的硫酸的質量濃度為58%-62%，浸泡時間為2.5 3.5小時，流水衝洗時間為20 28小時。
3.根據權利要求1所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特徵在於，在上述的步驟B中，所述的混合溶液為外源生長調節劑，該外源生長調節劑包括GA3溶液、6-BA溶液和愛多收溶液，且外源生長調節劑浸泡時間為20 28小時。
4.根據權利要求3所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特徵在於，所述的GA3溶液的質量濃度為180 220mg.Γ1 ;所述的6-BA溶液的質量濃度為4 6mg.Γ1 ;所述的愛多收溶液稀釋5800 6200倍。
5.根據權利要求4所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特徵在於，所述的GA3溶液的優化質量濃度為200mg.Γ1 ;所述的6-BA溶液的優化質量濃度為5mg.Γ1 ;所述的愛多收溶液優化稀釋倍為6000倍。
6.根據權利要求1所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特徵在於，在上述的步驟B中，所述的混合溶液為混合營養液，該混合營養液包括GA3、6-BA、硼酸、檸檬酸、維生素E、維生素D、多效唑、穀氨酸鈉、甘氨酸、吲哚丁酸、硝酸銨、KN03、PEG，且混合營養液浸泡時間為3.5 4.5小時。
7.根據權利要求6所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特徵在於，所述的混合營養液的質量份數=GA3為0.8 1.2份、6-BA為1.8 2.2份、硼酸為0.8 1.2份、檸檬酸為0.8 1.2份、維生素E為0.8 1.2份、維生素D為0.8 1.2份、多效唑為1.8 2.2份、穀氨酸鈉為3.5 4.5份、甘氨酸為3.5 4.5份、吲哚丁酸為0.8 1.2份、硝酸銨為0.8 1.2份、KNO3為0.8 1.2份、PEG為4.5 5.5份、餘量為水。
8.根據權利要求7所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特徵在於，所述的混合營養液的優化質量份數:GA3為I份、6-BA為2份、硼酸為I份、朽1檬酸為I份、維生素E為I份、維生素D為I份、多效唑為2份、穀氨酸鈉為4份、甘氨酸為4份、吲哚丁酸為I份、硝酸銨為I份、KNO3為I份、PEG為5份、餘量為水。
9.根據權利要求1所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特徵在於，在上述的步驟C中，所述的低溫層積處理的溫度為2 5°C、沙子溼度為65% 75%、層積時間為42 48天。
10.根據權利要求1所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特徵在於，在上述的步驟C中，所述的變溫層積處理過程如下:放置3.5 4.5°C冰箱處理38 42天，每隔4 6天翻動檢查一次，保持種子溼潤；然後取出，篩掉沙子，薄層陰乾，移至20 24°C恆溫室沙藏48 52天；最後，3.5 4.5°C低溫沙藏28 32天。
全文摘要
本發明屬於植物種子萌發技術領域，涉及一種破除南方紅豆杉種子休眠的方法。它解決了現有技術萌發速度慢，出芽率低等技術問題。本方法包括下述步驟A、酸蝕處理將南方紅豆杉種子浸泡於質量濃度為55%～65%硫酸的中2～4小時，取出後用流水衝洗12～36小時；B、浸泡處理將酸蝕後的南方紅豆杉種子浸泡於預先配置的混合溶液中至少3小時，取出後在清水中浸泡至少3天；C、層積處理將浸泡後的南方紅豆杉種子進行低溫層積處理或變溫層積處理。其優點在於省時、有效、經濟地破除休眠方法，以解決其休眠深、萌發難且發芽率低的問題，並為種子種苗市場流通提供標準，保證種子質量，對南方紅豆杉的育種栽培發展具有重大的意義。
文檔編號A01C1/00GK103202127SQ201310089480
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月19日 優先權日2013年3月19日
發明者張春椿, 熊耀康, 俞冰, 張水利, 李效賢, 蔣劍平 申請人:浙江中醫藥大學