一種利用適配子技術檢測鑑別蛇毒種類的方法
2023-05-21 17:31:16 3
專利名稱：一種利用適配子技術檢測鑑別蛇毒種類的方法
技術領域：
本發明屬生物醫學檢驗領域，涉及國內常見毒蛇的蛇傷鑑別檢測方法，特別涉及一種利用消減適配子技術進行蛇毒種屬特異適配子的篩選技術。
背景技術：
毒蛇傷害是一個全球性的公共衛生問題，可導致呼吸麻痺、致命性出血性敗血症、 不可逆性腎功能衰竭和導致永久性殘疾的局部組織嚴重壞死。據統計我國有已知毒蛇4科 28屬63餘種，常見毒蛇包括中華眼鏡蛇、眼鏡王蛇、金環蛇、銀環蛇、尖吻蝮蛇、圓斑蝰蛇、 蝮蛇、竹葉青、海蛇等。抗蛇毒血清是目前國內常用的治療毒蛇咬傷的特效藥物，目前我國常見的抗蛇毒血清包括抗蝮蛇毒血清、抗五步蛇毒血清、抗銀環蛇毒血清、抗眼鏡蛇毒血清等。但是在應用抗蛇毒血清治療蛇傷之前必須根據肇事毒蛇種類選擇正確種類的抗蛇毒血清，才能降低過敏反應的風險，提高毒素拮抗效率獲得理想的療效，否則將導致血清病等嚴重過敏反應的發生，錯失救治的最佳時間。目前我國蛇傷臨床診斷主要依靠病史和臨床表現，缺乏快速、特異的實驗室鑑別蛇毒種類的方法，往往造成治療的盲目性。究其原因，是因為蛇毒成分複雜，且親緣關係較近的蛇毒素存在許多同源蛋白，具有大量相同的抗原位點， 致使尋找種屬特異性單克隆抗體顯得十分困難。而近年來發展起來的適配子篩選技術，能從容量高達IOm的單鏈寡核酸隨機文庫中經過數輪的篩選得到與靶標高特異高親和性結合的適配子。
發明內容
為解決以上技術問題，本發明的目的在於提供一種利用蛇毒種屬特異性的適配子來檢測鑑別蛇毒的方法。本發明目的是這樣實現的
一種利用適配子技術檢測鑑別蛇毒種類的方法，其關鍵在於按如下步驟進行
(1)先構建隨機單鏈DNA文庫和引物，單鏈DNA文庫通過PCR擴增為雙鏈DNA、再通過非對稱PCR及純化得到單鏈DNA文庫；
(2)篩選出純化的單鏈DNA文庫與靶標粗蛇毒相結合的單鏈DNA；再次PCR擴增為雙鏈 DNA、非對稱PCR及純化得到與靶標耜蛇毒相結合的單鏈DNA ；
(3)將步驟(2)得到的單鏈DNA再與需要鑑別的4、種蛇毒反篩得到不相結合的單鏈
DNA ；
(4)按照步驟(2)和步驟(3)交叉循環篩選，得到可與蛇毒蛋白高親和性結合同時不與鑑別蛇毒結合的單鏈DNA適配子，PCR擴增為雙鏈DNA、非對稱PCR及純化得到單鏈DNA適配子庫；
(5)對篩選終池單鏈DNA適配子庫進行親和性檢測篩選出靶標適配子；
(6)獲得的適配子進行修飾增強其穩定性，然後用螢光素、生物素、放射性同位素或膠體金進行標記轉為報告適配子(7)採用酶聯免疫法從蛇傷受害者血、尿、傷口組織及分泌物中檢測相應的蛇毒物質， 從而判斷蛇傷種類，進行相應的抗蛇毒血清救治。上述步驟(4)中按照步驟(2)和步驟(3)交叉循環篩選12輪以上。步驟(1)、(2)和(4)採用不對稱PCR法或生物素鏈親和素磁珠法製備單鏈DNA文庫。步驟(2)、(3)和(4)篩選過程中以硝酸纖維素膜、親和樹脂或微孔板為分離介質。一種利用適配子技術檢測鑑別蛇毒種類的方法，具體按如下步驟進行 一、適配子的篩選
1)、構建隨機單鏈DNA (ssDNA)文庫和引物構建序列長度為78個鹼基的單鏈 DNA (ssDNA)文庫5， -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3，， 其中N代表鹼基A，G, C，T中的任意一個，該文庫的容量約為IO14-IO15,構建上遊引物 5，-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3，，構建下遊引物5，-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3，。隨機單鏈DNA文庫和引物由生物公司合成。2)、單鏈DNA文庫合成雙鏈DNA文庫將單鏈DNA文庫0. μδ,上遊引物lOOpmol、 下遊引物IOpmol、15mmol/l Mgcl2、0. 2mmol/l dNTP、1 XDNA聚合酶反應緩衝液和1個活性單位的DNA聚合酶，加入雙蒸水，使總體積為20μ1 ；然後放入PCR儀中，先進行94°C反應5 分鐘預變性，然後按以下條件循環18次94°C反應30秒，65°C反應30秒，72°C反應30秒， 最後72°C反應5分鐘，得到雙鏈DNA文庫的PCR擴增產物，並用酚氯仿法純化回收。3)、不對稱PCR法製備單鏈DNA文庫步驟2)中回收的DNA為模版0. μδ,上遊引物0. lpmol、下遊引物 10pmol、7. 5mmol/l MgC12、0. 2mmol/l dNTP、IXDNA聚合酶反應緩衝液和1個活性單位的DNA聚合酶，加入雙蒸水，使總體積為20μ1 ；然後放入PCR儀中，先進行94°C反應5分鐘預變性，然後按以下條件循環18次94°C反應30秒，65°C反應30秒， 72°C反應30秒，最後72°C反應5分鐘，得到單鏈DNA文庫的PCR擴增產物並用酚氯仿法純化回收，得到純化的單鏈DNA文庫。4)、篩選循環
①將透析後的IOPg靶標粗蛇毒用PH值9. 6的碳酸緩衝液包被於酶聯板上，37°C作用 3小時，同時設空白對照孔。樣本孔和對照孔用3%的BSA封閉2小時。將步驟5)中純化的單鏈DNA文庫Ing在SELEX結合緩衝液中先與空白對照孔37°C作用40分鐘，反篩去除與BSA結合的單鏈DNA，然後轉移到蛇毒蛋白包被孔與蛇毒蛋白37°C結合40分鐘，用SELEX 衝洗緩衝液洗滌6次，再加入SELEX洗脫液於80°C作用10分鐘，洗脫下與蛇毒蛋白結合的 ssDNA，經酚-氯仿抽提、乙醇沉澱，得到純化的單鏈DNA。按照步驟2)對純化後的ssDNA進行常規PCR反應擴增，而後按照步驟3)進行非對稱PCR反應，酚氯仿法純化回收穫得富集單鏈DNA隨機庫，該文庫作為一下輪篩選的文庫。②將PBS透析後的鑑別蛇毒混合體(需要與之鑑別的4-8種蛇毒混合物)用 PH值9. 6的碳酸緩衝液包被於酶聯板上，37°C作用3小時，同時設空白對照孔。樣本孔和對照孔用3%的BSA封閉2小時。將步驟①中純化的單鏈DNA文庫Ing轉移到蛇毒蛋白包被孔與蛇毒蛋白37°C結合40分鐘，用SELEX衝洗緩衝液洗滌6次，收集洗滌下來的ssDNA，純化得到的單鏈DNA。在把得到的單鏈DNA按照步驟2)常規PCR反應擴增，而後按照步驟3) 進行非對稱PCR反應，酚氯仿法純化回收穫得富集單鏈DNA隨機庫，該文庫作為一下輪篩選的文庫。5)、重複步驟4)12輪單數輪篩選將靶標蛇毒作為篩選靶標，收集結合洗脫ssDNA 用於下一循環；雙數輪篩選使用需要與之鑑別的4-8種蛇毒混合體作為消減篩選靶標，收集未結合洗脫ssDNA用於下一循環。包被的蛇毒蛋白的濃度和用於結合的單鏈DNA濃度隨著篩選輪數的增加而不斷的降低，至第12輪時，包被蛋白的濃度達到每孔0. 05Pg，相應的結合單鏈DNA的濃度為每孔0. 02ng，得到可與蛇毒蛋白高親和性結合同時不與鑑別蛇毒結合的單鏈DNA適配子庫。6)、將步驟5)最終獲得的高親和性單鏈DNA適配子庫按照步驟2)擴增，獲得雙鏈 DNA文庫的PCR擴增產物。用含濃度0. 5μδ/πι1溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠，將雙鏈DNA文庫的PCR擴增產物進行電泳，電泳後將瓊脂糖凝膠置放在螢光檢測板上，將呈橘紅色條帶的雙鏈DNA文庫的PCR擴增產物切下，用TaKaRa公司提供的DNA純化回收試劑盒純化，得到純化的雙鏈DNA。7)、將步驟6)獲得的雙鏈DNA，用TaKaRa公司提供的pMD18_T Simple Vector試劑盒連接到PMD18-T載體上，轉化到大腸桿菌DH5a，氨苄抗性篩選，挑取單個生長菌落進行測序。8)將各單個生長菌落所對應的DNA適配子用生物素標記，量為0. Mg，與每孔10μβ 包被的蛇毒蛋白在SELEX結合緩衝液中37°C結合40分鐘，用SELEX衝洗緩衝液洗滌6次， 加入1 :1000的辣根過氧化物酶標鏈黴親和素，370C，作用30分鐘，用PBST緩衝液洗滌4次， 洗去未與蛇毒蛋白上DNA生物素結合的酶標鏈酶親和素，然後加入四甲基聯苯胺室溫顯色 20分鐘作用，加入2M濃硫酸終止顯色反應，450nm酶聯儀測定OD值，選取OD值最高的DNA 適配子，該適配子即為能與蛇毒蛋白結合的DNA適配子，將該適配子測序獲得序列。二、檢測方法的建立
將由上述過程獲得的適配子進行修飾增強其穩定性，然後用螢光素、生物素、放射性同位素或膠體金進行標記轉為報告適配子，就可採用酶聯免疫法從蛇傷受害者血、尿、傷口組織及分泌物中檢測相應的蛇毒物質，從而判斷蛇傷種類，進行相應的抗蛇毒血清救治。有益效果本發明針對成分複雜的蛇毒，採用消減適配子篩選技術(depletion SELEX)，篩選獲得具有高度蛇毒種屬特異性的適配子，並將適配子轉為報告適配子建立蛇毒快速檢測新方法。蛇傷檢測特異性強與敏感性好等，檢測迅速，被蛇咬傷後，可以馬上進行針對性的治療。
具體實施例方式實施例1:
一種基於適配子技術的中華眼鏡蛇毒鑑別方法，按如下步驟進行 1)、中華眼鏡蛇毒種屬特異性適配子的篩選，構建隨機單鏈DNA (ssDNA)文庫和引物， 將單鏈DNA文庫通過PCR合成雙鏈DNA文庫，再利用不對稱PCR法擴增DNA文庫，PCR擴增產物用酚氯仿法純化回收，得到大量純化的單鏈DNA文庫。2)、中華眼鏡蛇蛇毒篩選循環將中華眼鏡蛇毒透析後包被於酶聯板上，37°C作用 3小時，同時設空白對照孔。樣本孔和對照孔用3%的BSA封閉2小時。將純化的單鏈DNA 文庫Ing在SELEX結合緩衝液中先與空白對照孔37°C作用40分鐘，反篩去除與BSA結合的單鏈DNA，然後轉移到中華眼鏡蛇蛇毒蛋白包被孔與中華眼鏡蛇蛇毒蛋白37°C結合40分鐘，用SELEX衝洗緩衝液洗滌6次，再加入SELEX洗脫液於80°C作用10分鐘，洗脫下與中華眼鏡蛇蛇毒蛋白結合的ssDNA，經酚-氯仿抽提、乙醇沉澱，得到純化的單鏈DNA。對純化後的ssDNA進行常規PCR反應擴增，而後進行非對稱PCR反應，酚氯仿法純化回收穫得富集單鏈DNA隨機庫，該文庫作為一下輪篩選的文庫。3)、鑑別蛇毒反篩循環將鑑別蛇毒混合體(尖吻蝮蛇毒、江浙蝮蛇毒、烙鐵頭蛇毒)用PH值9. 6的碳酸緩衝液包被於酶聯板上，37°C作用3小時，同時設空白對照孔。樣本孔和對照孔用3%的BSA封閉2小時。將步驟2)中純化的單鏈DNA文庫Ing轉移到蛇毒混合體包被孔與混合蛇毒蛋白37°C結合40分鐘，用SELEX衝洗緩衝液洗滌6次，收集洗滌下來的ssDNA，純化得到的單鏈DNA。在把得到的單鏈DNA進行常規PCR反應擴增，而後進行非對稱PCR反應，酚氯仿法純化回收穫得富集單鏈DNA隨機庫，該文庫作為一下輪篩選的文庫。4)、重複步驟2) -3) 12輪單數輪篩選將中華眼鏡蛇毒作為篩選靶標，收集結合洗脫ssDNA用於下一循環；雙數輪篩選使用需要與之鑑別的蛇毒混合體(尖吻蝮蛇毒、江浙蝮蛇毒、烙鐵頭蛇毒)作為消減篩選靶標，收集未結合洗脫ssDNA用於下一循環。包被的蛇毒蛋白的濃度和用於結合的單鏈DNA濃度隨著篩選輪數的增加而不斷的降低，至第12輪時，包被蛋白的濃度達到每孔0. 05μg,相應的結合單鏈DNA的濃度為每孔0. 02ng,得到可與中華眼鏡蛇蛇毒蛋白高親和性結合同時不與鑑別蛇毒(尖吻蝮蛇毒、江浙蝮蛇毒、烙鐵頭蛇毒)結合的單鏈DNA適配子庫。5)、將步驟4)獲得的高親和性單鏈DNA適配子庫進行PCR擴增，獲得雙鏈DNA文庫的PCR擴增產物。用含濃度0. 5μδ/πι1溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠，將雙鏈DNA文庫的PCR 擴增產物進行電泳，電泳後將瓊脂糖凝膠置放在螢光檢測板上，將呈橘紅色條帶的雙鏈DNA 文庫的PCR擴增產物切下，用TaKaRa公司提供的DNA純化回收試劑盒純化，得到純化的雙鏈 DNA。6)、將步驟5)獲得的雙鏈DNA，用TaKaRa公司提供的pMD18_T Simple Vector試劑盒連接到PMD18-T載體上，轉化到大腸桿菌DH5a，氨苄抗性篩選，挑取單個生長菌落進行測序。7)、將各單個生長菌落所對應的DNA適配子用生物素標記，量為0. Mg，與每孔 IOPg包被的中華眼鏡蛇蛇毒蛋白在SELEX結合緩衝液中37°C結合40分鐘，用SELEX衝洗緩衝液洗滌6次，加入1 1000的辣根過氧化物酶標鏈黴親和素，370C，作用30分鐘，用PBST 緩衝液洗滌4次，洗去未與中華眼鏡蛇蛇毒蛋白上DNA生物素結合的酶標鏈酶親和素，然後加入四甲基聯苯胺室溫顯色20分鐘作用，加入2M濃硫酸終止顯色反應，450nm酶聯儀測定 OD值，選取OD值最高的DNA適配子，該適配子即為能與中華眼鏡蛇蛇毒蛋白結合的DNA適配子，將該適配子測序獲得序列。8)、將由上述過程獲得的適配子進行修飾增強其穩定性，然後用螢光素、生物素、 放射性同位素或膠體金進行標記轉為報告適配子，
9)、從蛇傷受害者血、尿、傷口組織及分泌物中檢測相應的蛇毒物質，從而判斷蛇傷種類，進行相應的抗蛇毒血清救治。實施例2:一種基於適配子技術的尖吻蝮蛇毒鑑別方法，按如下步驟進行 1)、尖吻蝮蛇毒種屬特異性適配子的篩選，構建隨機單鏈DNA (ssDNA)文庫和引物，將單鏈DNA文庫通過PCR合成雙鏈DNA文庫，再利用不對稱PCR法擴增DNA文庫，PCR擴增產物用酚氯仿法純化回收，得到大量純化的單鏈DNA文庫。2)、尖吻蝮蛇蛇毒篩選循環將尖吻蝮蛇毒透析後包被於酶聯板上，37°C作用3小時，同時設空白對照孔。樣本孔和對照孔用3%的BSA封閉2小時。將純化的單鏈DNA文庫 Ing在SELEX結合緩衝液中先與空白對照孔37°C作用40分鐘，反篩去除與BSA結合的單鏈 DNA，然後轉移到尖吻蝮蛇蛇毒蛋白包被孔與尖吻蝮蛇蛇毒蛋白37°C結合40分鐘，用SELEX 衝洗緩衝液洗滌6次，再加入SELEX洗脫液於80°C作用10分鐘，洗脫下與尖吻蝮蛇蛇毒蛋白結合的ssDNA，經酚-氯仿抽提、乙醇沉澱，得到純化的單鏈DNA。對純化後的ssDNA進行常規PCR反應擴增，而後進行非對稱PCR反應，酚氯仿法純化回收穫得富集單鏈DNA隨機庫，該文庫作為一下輪篩選的文庫。3)、鑑別蛇毒反篩循環將鑑別蛇毒混合體(中華眼鏡蛇、江浙蝮蛇毒、烙鐵頭蛇毒)用PH值9. 6的碳酸緩衝液包被於酶聯板上，37°C作用3小時，同時設空白對照孔。樣本孔和對照孔用3%的BSA封閉2小時。將步驟2)中純化的單鏈DNA文庫Ing轉移到蛇毒混合體包被孔與混合蛇毒蛋白37°C結合40分鐘，用SELEX衝洗緩衝液洗滌6次，收集洗滌下來的ssDNA，純化得到的單鏈DNA。在把得到的單鏈DNA進行常規PCR反應擴增，而後進行非對稱PCR反應，酚氯仿法純化回收穫得富集單鏈DNA隨機庫，該文庫作為一下輪篩選的文庫。4)、重複步驟2) -3) 12輪單數輪篩選將尖吻蝮蛇毒作為篩選靶標，收集結合洗脫ssDNA用於下一循環；雙數輪篩選使用需要與之鑑別的蛇毒混合體(中華眼鏡蛇毒、江浙蝮蛇毒、烙鐵頭蛇毒)作為消減篩選靶標，收集未結合洗脫ssDNA用於下一循環。包被的蛇毒蛋白的濃度和用於結合的單鏈DNA濃度隨著篩選輪數的增加而不斷的降低，至第12輪時，包被蛋白的濃度達到每孔0. 05μg,相應的結合單鏈DNA的濃度為每孔0. 02ng,得到可與尖吻蝮蛇蛇毒蛋白高親和性結合同時不與鑑別蛇毒(中華眼鏡蛇毒、江浙蝮蛇毒、烙鐵頭蛇毒)結合的單鏈DNA適配子庫。5)、將步驟4)獲得的高親和性單鏈DNA適配子庫進行PCR擴增，獲得雙鏈DNA文庫的PCR擴增產物。用含濃度0. 5μδ/πι1溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠，將雙鏈DNA文庫的PCR 擴增產物進行電泳，電泳後將瓊脂糖凝膠置放在螢光檢測板上，將呈橘紅色條帶的雙鏈DNA 文庫的PCR擴增產物切下，用TaKaRa公司提供的DNA純化回收試劑盒純化，得到純化的雙鏈 DNA。6)、將步驟5)獲得的雙鏈DNA，用TaKaRa公司提供的pMD18_T Simple Vector試劑盒連接到PMD18-T載體上，轉化到大腸桿菌DH5a，氨苄抗性篩選，挑取單個生長菌落進行測序。7)、將各單個生長菌落所對應的DNA適配子用生物素標記，量為0. Mg，與每孔 IOPg包被的尖吻蝮蛇蛇毒蛋白在SELEX結合緩衝液中37°C結合40分鐘，用SELEX衝洗緩衝液洗滌6次，加入1 :1000的辣根過氧化物酶標鏈黴親和素，37°C，作用30分鐘，用PBST 緩衝液洗滌4次，洗去未與尖吻蝮蛇蛇毒蛋白上DNA生物素結合的酶標鏈酶親和素，然後加入四甲基聯苯胺室溫顯色20分鐘作用，加入2M濃硫酸終止顯色反應，450nm酶聯儀測定OD值，選取OD值最高的DNA適配子，該適配子即為能與尖吻蝮蛇蛇毒蛋白結合的DNA適配子， 將該適配子測序獲得序列。8)、將由上述過程獲得的適配子進行修飾增強其穩定性，然後用螢光素、生物素、 放射性同位素或膠體金進行標記轉為報告適配子，
9)、從蛇傷受害者血、尿、傷口組織及分泌物中檢測相應的蛇毒物質，從而判斷蛇傷種類，進行相應的抗蛇毒血清救治。實施例3:
一種基於適配子技術的江浙蝮蛇毒鑑別方法，按如下步驟進行 1)、江浙蝮蛇毒種屬特異性適配子的篩選，構建隨機單鏈DNA (ssDNA)文庫和引物，將單鏈DNA文庫通過PCR合成雙鏈DNA文庫，再利用不對稱PCR法擴增DNA文庫，PCR擴增產物用酚氯仿法純化回收，得到大量純化的單鏈DNA文庫。2)、江浙蝮蛇蛇毒篩選循環將江浙蝮蛇毒透析後包被於酶聯板上，37°C作用3小時，同時設空白對照孔。樣本孔和對照孔用3%的BSA封閉2小時。將純化的單鏈DNA文庫 Ing在SELEX結合緩衝液中先與空白對照孔37°C作用40分鐘，反篩去除與BSA結合的單鏈 DNA，然後轉移到江浙蝮蛇蛇毒蛋白包被孔與江浙蝮蛇蛇毒蛋白37°C結合40分鐘，用SELEX 衝洗緩衝液洗滌6次，再加入SELEX洗脫液於80°C作用10分鐘，洗脫下與江浙蝮蛇蛇毒蛋白結合的ssDNA，經酚-氯仿抽提、乙醇沉澱，得到純化的單鏈DNA。對純化後的ssDNA進行常規PCR反應擴增，而後進行非對稱PCR反應，酚氯仿法純化回收穫得富集單鏈DNA隨機庫，該文庫作為一下輪篩選的文庫。3)、鑑別蛇毒反篩循環將鑑別蛇毒混合體(中華眼鏡蛇、尖吻蝮蛇毒、烙鐵頭蛇毒)用PH值9. 6的碳酸緩衝液包被於酶聯板上，37°C作用3小時，同時設空白對照孔。樣本孔和對照孔用3%的BSA封閉2小時。將步驟2)中純化的單鏈DNA文庫Ing轉移到蛇毒混合體包被孔與混合蛇毒蛋白37°C結合40分鐘，用SELEX衝洗緩衝液洗滌6次，收集洗滌下來的ssDNA，純化得到的單鏈DNA。在把得到的單鏈DNA進行常規PCR反應擴增，而後進行非對稱PCR反應，酚氯仿法純化回收穫得富集單鏈DNA隨機庫，該文庫作為一下輪篩選的文庫。4)、重複步驟2) -3) 12輪單數輪篩選將江浙蝮蛇毒作為篩選靶標，收集結合洗脫ssDNA用於下一循環；雙數輪篩選使用需要與之鑑別的蛇毒混合體(中華眼鏡蛇毒、尖吻蝮蛇毒、烙鐵頭蛇毒)作為消減篩選靶標，收集未結合洗脫ssDNA用於下一循環。包被的蛇毒蛋白的濃度和用於結合的單鏈DNA濃度隨著篩選輪數的增加而不斷的降低，至第12輪時，包被蛋白的濃度達到每孔0. 05μg,相應的結合單鏈DNA的濃度為每孔0. 02ng,得到可與江浙蝮蛇蛇毒蛋白高親和性結合同時不與鑑別蛇毒(中華眼鏡蛇毒、尖吻蝮蛇毒、烙鐵頭蛇毒)結合的單鏈DNA適配子庫。5)、將步驟4)獲得的高親和性單鏈DNA適配子庫進行PCR擴增，獲得雙鏈DNA文庫的PCR擴增產物。用含濃度0. 5μδ/πι1溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠，將雙鏈DNA文庫的PCR 擴增產物進行電泳，電泳後將瓊脂糖凝膠置放在螢光檢測板上，將呈橘紅色條帶的雙鏈DNA 文庫的PCR擴增產物切下，用TaKaRa公司提供的DNA純化回收試劑盒純化，得到純化的雙鏈 DNA。6)、將步驟5)獲得的雙鏈DNA，用TaKaRa公司提供的pMD18_T Simple Vector試劑盒連接到PMD18-T載體上，轉化到大腸桿菌DH5a，氨苄抗性篩選，挑取單個生長菌落進行測序。7)、將各單個生長菌落所對應的DNA適配子用生物素標記，量為0. Mg，與每孔 IOPg包被的江浙蝮蛇蛇毒蛋白在SELEX結合緩衝液中37°C結合40分鐘，用SELEX衝洗緩衝液洗滌6次，加入1 :1000的辣根過氧化物酶標鏈黴親和素，37°C，作用30分鐘，用PBST 緩衝液洗滌4次，洗去未與江浙蝮蛇蛇毒蛋白上DNA生物素結合的酶標鏈酶親和素，然後加入四甲基聯苯胺室溫顯色20分鐘作用，加入2M濃硫酸終止顯色反應，450nm酶聯儀測定OD 值，選取OD值最高的DNA適配子，該適配子即為能與江浙蝮蛇蛇毒蛋白結合的DNA適配子， 將該適配子測序獲得序列。8)、將由上述過程獲得的適配子進行修飾增強其穩定性，然後用螢光素、生物素、 放射性同位素或膠體金進行標記轉為報告適配子，
9)、從蛇傷受害者血、尿、傷口組織及分泌物中檢測相應的蛇毒物質，從而判斷蛇傷種類，進行相應的抗蛇毒血清救治。實施例4:
一種基於適配子技術的烙鐵頭蛇毒鑑別方法，按如下步驟進行 1)、烙鐵頭蛇毒種屬特異性適配子的篩選，構建隨機單鏈DNA (ssDNA)文庫和引物，將單鏈DNA文庫通過PCR合成雙鏈DNA文庫，再利用不對稱PCR法擴增DNA文庫，PCR擴增產物用酚氯仿法純化回收，得到大量純化的單鏈DNA文庫。2)、烙鐵頭蛇蛇毒篩選循環將烙鐵頭蛇毒透析後包被於酶聯板上，37°C作用3小時，同時設空白對照孔。樣本孔和對照孔用3%的BSA封閉2小時。將純化的單鏈DNA文庫 Ing在SELEX結合緩衝液中先與空白對照孔37°C作用40分鐘，反篩去除與BSA結合的單鏈 DNA，然後轉移到烙鐵頭蛇蛇毒蛋白包被孔與江浙蝮蛇蛇毒蛋白37°C結合40分鐘，用SELEX 衝洗緩衝液洗滌6次，再加入SELEX洗脫液於80°C作用10分鐘，洗脫下與烙鐵頭蛇蛇毒蛋白結合的ssDNA，經酚-氯仿抽提、乙醇沉澱，得到純化的單鏈DNA。對純化後的ssDNA進行常規PCR反應擴增，而後進行非對稱PCR反應，酚氯仿法純化回收穫得富集單鏈DNA隨機庫，該文庫作為一下輪篩選的文庫。3)、鑑別蛇毒反篩循環將鑑別蛇毒混合體(中華眼鏡蛇、尖吻蝮蛇毒、江浙蝮蛇) 用PH值9. 6的碳酸緩衝液包被於酶聯板上，37°C作用3小時，同時設空白對照孔。樣本孔和對照孔用3%的BSA封閉2小時。將步驟2)中純化的單鏈DNA文庫Ing轉移到蛇毒混合體包被孔與混合蛇毒蛋白37°C結合40分鐘，用SELEX衝洗緩衝液洗滌6次，收集洗滌下來的ssDNA，純化得到的單鏈DNA。在把得到的單鏈DNA進行常規PCR反應擴增，而後進行非對稱PCR反應，酚氯仿法純化回收穫得富集單鏈DNA隨機庫，該文庫作為一下輪篩選的文庫。4)、重複步驟2) -3) 12輪單數輪篩選將江浙蝮蛇毒作為篩選靶標，收集結合洗脫ssDNA用於下一循環；雙數輪篩選使用需要與之鑑別的蛇毒混合體(中華眼鏡蛇毒、尖吻蝮蛇毒、江浙蝮蛇毒)作為消減篩選靶標，收集未結合洗脫ssDNA用於下一循環。包被的蛇毒蛋白的濃度和用於結合的單鏈DNA濃度隨著篩選輪數的增加而不斷的降低，至第12輪時，包被蛋白的濃度達到每孔0. 05μg,相應的結合單鏈DNA的濃度為每孔0. 02ng,得到可與烙鐵頭蛇蛇毒蛋白高親和性結合同時不與鑑別蛇毒(中華眼鏡蛇毒、尖吻蝮蛇毒、江浙蝮蛇毒)結合的單鏈DNA適配子庫。
5)、將步驟4)獲得的高親和性單鏈DNA適配子庫進行PCR擴增，獲得雙鏈DNA文庫的PCR擴增產物。用含濃度0. 5μδ/πι1溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠，將雙鏈DNA文庫的PCR 擴增產物進行電泳，電泳後將瓊脂糖凝膠置放在螢光檢測板上，將呈橘紅色條帶的雙鏈DNA 文庫的PCR擴增產物切下，用TaKaRa公司提供的DNA純化回收試劑盒純化，得到純化的雙鏈 DNA。6)、將步驟5)獲得的雙鏈DNA，用TaKaRa公司提供的pMD18_T Simple Vector試劑盒連接到PMD18-T載體上，轉化到大腸桿菌DH5a，氨苄抗性篩選，挑取單個生長菌落進行測序。7)、將各單個生長菌落所對應的DNA適配子用生物素標記，量為0. Mg，與每孔 IOPg包被的烙鐵頭蛇蛇毒蛋白在SELEX結合緩衝液中37°C結合40分鐘，用SELEX衝洗緩衝液洗滌6次，加入1 :1000的辣根過氧化物酶標鏈黴親和素，37°C，作用30分鐘，用PBST 緩衝液洗滌4次，洗去未與烙鐵頭蛇蛇毒蛋白上DNA生物素結合的酶標鏈酶親和素，然後加入四甲基聯苯胺室溫顯色20分鐘作用，加入2M濃硫酸終止顯色反應，450nm酶聯儀測定OD 值，選取OD值最高的DNA適配子，該適配子即為能與烙鐵頭蛇蛇毒蛋白結合的DNA適配子， 將該適配子測序獲得序列。8)、將由上述過程獲得的適配子進行修飾增強其穩定性，然後用螢光素、生物素、 放射性同位素或膠體金進行標記轉為報告適配子，
9)、從蛇傷受害者血、尿、傷口組織及分泌物中檢測相應的蛇毒物質，從而判斷蛇傷種類，進行相應的抗蛇毒血清救治。
權利要求
1.一種利用適配子技術檢測鑑別蛇毒種類的方法，其特徵在於按如下步驟進行(1)先構建隨機單鏈DNA文庫和引物，單鏈DNA文庫通過PCR擴增為雙鏈DNA、再通過非對稱PCR擴增並純化得到單鏈DNA文庫；(2)篩選出純化的單鏈DNA文庫與靶標粗蛇毒相結合的單鏈DNA；再次常規PCR和非對稱PCR擴增DNA、純化得到與靶標粗蛇毒相結合的單鏈DNA ；(3)將步驟(2)得到的單鏈DNA再與需要鑑別的4、種蛇毒反篩得到不相結合的單鏈DNA ；(4)按照步驟(2)和步驟(3)交叉循環篩選，得到可與蛇毒蛋白高親和性結合同時不與鑑別蛇毒結合的單鏈DNA適配子，PCR擴增為雙鏈DNA、非對稱PCR擴增並純化得到單鏈DNA 適配子庫；(5)對篩選終池單鏈DNA適配子庫進行親和性檢測篩選出靶標適配子；(6)獲得的適配子進行修飾增強其穩定性，然後用螢光素、生物素、放射性同位素或膠體金進行標記轉為報告適配子；(7)採用酶聯免疫法從蛇傷受害者血、尿、傷口組織及分泌物中檢測相應的蛇毒物質， 從而判斷蛇傷種類，進行相應的抗蛇毒血清救治。
2.根據權利要求1所述一種利用適配子技術檢測鑑別蛇毒種類的方法，其特徵在於 所述步驟(4)中按照步驟(2)和步驟(3)交叉循環篩選12輪以上。
3.根據權利要求1所述一種利用適配子技術檢測鑑別蛇毒種類的方法，其特徵在於 步驟(1)、(2)和(4)採用非對稱PCR法或生物素鏈親和素磁珠法製備單鏈DNA文庫。
4.根據權利要求1所述一種利用適配子技術檢測鑑別蛇毒種類的方法，其特徵在於 步驟(2)、(3)和(4)篩選過程中以硝酸纖維素膜、親和樹脂或微孔板為分離介質。
全文摘要
本發明公開了一種利用適配子技術檢測鑑別蛇毒種類的方法屬生物醫學檢驗領域，涉及一種利用適配子技術檢測蛇毒的方法。本發明針對蛇毒成分複雜，目前蛇傷檢測方法特異性與敏感性差等問題，採用消減適配子篩選技術(depletionSELEX)，篩選獲得具有高度蛇毒種屬特異性的適配子，並將適配子轉為報告適配子建立蛇毒快速檢測新方法。
文檔編號G01N33/53GK102323400SQ20111015234
公開日2012年1月18日 申請日期2011年6月8日 優先權日2011年6月8日
發明者府偉靈, 鄧昆 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院