IRE-1α抑制劑的製作方法
2023-05-21 21:05:36 2
專利名稱：IRE-1α抑制劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及IRE-la抑制劑及其治療應用。
背景技術：
細胞內質網中的蛋白質摺疊應激(protein folding stress)可引發稱為解摺疊蛋白質 效應或UPR的信號轉導級聯反應。需肌醇酶1 (IRE-1 a )是一種關鍵酶，其通過增強分 子伴侶活性來減輕蛋白質摺疊應激，因而保護細胞免遭應激誘導的凋亡。IRE-la的抑 製劑至少可用於治療B細胞自身免疫疾病、某些癌症和一些病毒感染。附圖簡述
圖1.利用6-溴代鄰-香草醛的細胞基IRE-1 a XBP_1_特異性核糖核酸內切酶 抑制的結果。12iiLDMS0是1.2%。圖2.在人骨髓瘤細胞中的細胞基IRE-1 a XBP_1_特異性核糖核酸內切酶抑制的結果。圖3.顯示IRE-1 a抑制劑細胞試驗的PCR產物的瓊脂糖凝膠掃描圖片，顯示了 各種IRE-1 a抑制劑的劑量依賴性抑制細胞XBP-1剪接。XBP-lu、未剪接的XBP_1 ； XBP-ls,剪接的SBP-1; EC50, IRE-1 a抑制劑抑制50%的DTT-誘導細胞XBP-1剪接 時的濃度(P M)。泳道上的數值標出各化合物的濃度(以P M計)。用活性或無活性化 合物處理MM.ls骨髓瘤細胞2小時，然後用DTT處理1小時。利用側接內含子區域的人 XBP-1特異性引物進行RT-PCR。DTT誘導UPR應激(S)導致26個核苷酸的片段被除 去，從而與未經應激細胞(U)(較高條帶)相比，產生較低條帶。EC5(I測定為抑制50% DTT誘導剪接XBP-1的濃度。化合物17-1的EC5(1約為2-3 u M。圖4.顯示IRE-1 a抑制劑可逆抑制細胞中活化形式的IRE-1 a。在HEK 293細 胞中利用10 y M化合物2檢測XBP-1剪接的細胞抑制作用。圖4A採用標準RT-PCR來 顯示加入2mM DTT並維持在培養液中(▲)或在誘導後30分鐘( )或1小時(■) 將DTT洗出後的剪接XBP-1的相對量。用DTT對細胞施加應激時，XBP-1信使RNA 快速轉化成剪接形式。相反，去除應激時，細胞快速降解剪接的XBP-1並替換以未剪接 形式。圖4B顯示在DTT誘導前2小時(■)或在誘導後1小時(▲)將化合物2加入 DTT應激細胞時，與除去DTT應激類似，未剪接形式快速累積，提示該化合物抑制該酶 的活化形式。當將該化合物洗出而維持DTT應激，剪接的XBP-1在完成抑制後的數小 時內增加，提示抑制作用是可逆的(■，X，*) 通過掃描未剪接和剪接的XBP-1條 帶的凝膠測定剪接百分比(如圖3所述)。酶活性以剪接的XBP-1的百分比在Y軸上表 示(計算成剪接含量除以剪接和未剪接XBP-1的總量)。圖5.顯示了 IRE-1 a抑制劑11-28 (實施例11)對多發性骨髓瘤細胞增殖的抑 製作用。將RPMI-8226多發性骨髓瘤細胞以20,000細胞/孔接種在含有1 % FBS和所
9需抗生素的RPMI培養基中。該平板在37°C、95%空氣、5% C02下溫育過夜。第二 天，將化合物11-28或培養基單獨加入各孔，達到終體積為100微升/孔。化合物濃 度為100iiM-0iiM，其中各化合物作4倍稀釋。加入化合物後，該平板在37°C、95% 空氣、5% C02下溫育24小時。按照生產商的說明書，利用普羅麥格公司的CTG測定 (CellTiter-Glo assay, Promega)檢測細胞增殖。圖6.蛋白質印跡(圖6A)和瓊脂糖凝膠(圖6B)顯示用波特佐米(bortezomib) (MG-341 ； VELCADE )處理RPMI8226細胞24小時增加磷酸化IRE-1 a禾P XBP1-剪 接的水平。數值表明波特佐米的濃度(nM)。圖7.顯示通過相對胱冬酶活性(胱冬酶3和胱冬酶7的總活性)反映出利用蛋 白酶體抑制劑MG-132 (N-[(苯基甲氧基)羰基]_L-亮氨醯-N_[ (IS) 甲醯基_3_甲基 丁基]_L-亮氨醯胺)和IRE-1 a /XBP-1特異性抑制劑增強骨髓瘤細胞的凋亡。圖7A， 100nM MG-132 ；圖 7B，200nMMG_132。圖8.小鼠組織中IRE-1 a抑制劑體內試驗的結果。圖8A，衣黴素和IRE_1 a抑 製劑處理的方案。圖8B，顯示IRE-1 a特異性XBP-1剪接在NOD-SCID小鼠的腎、肝 和脾中大部分失活的RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠。圖8C，用衣黴素處理6小時導致顯著 水平的剪接XBP_l(Wu等，2007)。圖8C，顯示用衣黴素腹膜內處理後4小時用IRE_1 a 抑制劑處理的小鼠中剪接XBP-1水平降低的RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠。圖8D，圖示 了圖8B和8C中每組兩隻小鼠的剪接XBP-1相對於總XBP-1的平均相對百分比。圖8B 和圖8C中括號上方的數字是小鼠編號(小鼠3、小鼠4，等等)。圖8D，圖示了圖8B 和8C中每組兩隻小鼠的剪接XBP-1相對於總XBP-1的平均相對百分比。圖9.用選擇的IRE-1 a抑制劑抑制LPS刺激原代鼠B細胞後IgM的分泌。當在 刺激開始時和刺激後24小時加入時，化合物17-1在最低lOOnM的所有測試劑量下均阻斷 IgM分泌。然而，在刺激後40小時加入時，化合物作用不大；在最高劑量也僅有略微抑 制。如以前Iwakoshi等(Nature4，321-29，2003)所述實施B細胞刺激、漿細胞分化和 IgM分泌的方法。利用小鼠CD43微珠(Miltenyi目錄號130-049-801)從BALB/c脾臟分 離原代B細胞，每次處理lxlO6個細胞。在24-孔平板中，在終密度為lxlO6/毫升/孔的 B細胞培養液中用20 u g/ml LPS (Sigma目錄號L4391)刺激純化的B細胞。在指定的時 間點(t = 0、t = 24小時、t = 40小時，等等)加入各種濃度(50 10uM> 2 u M> 0.4 iiM和0.08 iiM)的IRE-1 a抑制劑化合物17-1。37°C，溫育細胞48小時。溫育結 束時，將細胞在平板中以1500rpm離心3分鐘。收集上清液，利用小鼠IgM ELISA試劑 盒(Bethyl Labs目錄號E90-101)定量測定IgM分泌。B細胞培養基包括補加了 NEAA、 HEPES、NaPyr、PSQ 和 3 _ 巰基乙醇的 RPMI+10% FBS。發明詳述本發明提供IRE-la抑制劑化合物及其前藥和藥學上可接受的鹽。本發明還提 供藥物組合物和治療性利用IRE-la抑制劑化合物、其前藥和藥學上可接受的鹽治療解 摺疊蛋白質效應相關疾病的方法。可治療的患者包括具有B細胞自身免疫疾病、某些癌 症和一些病毒感染的那些患者。本發明包括因結構和功能而相關的許多化學化合物以及它們的使用方法。可限 定包括這些化合物中一種到任意數量的它們的各種分組和應用，這些分組和應用構成本發明的各種實施方式。一些實施方式特意包括某些化合物，而其它實施方式特意排除某 些化合物。包括或排除的標準包括特定結構或結構特徵，活性水平或範圍(例如，IC5。 或EC5。)、通過特定給藥途徑給藥的適合性、所治療的疾病，等等。IRE-1 a抑制劑化合物本發明的IRE-1 a抑制劑化合物是直接抑制該酶的芳族和雜芳族羥 醛類。據信，這些化合物通過抑制酶的RNA酶活性而起作用。在本發明的具體實施方式
中，該活性檢測為IRE-1 a對人小-XBP-lmRNA莖-環底物 5' -CAGUCCGCAGGACUG-3『 (SEQ ID NO 1)的體外切割為至少 10、15、20、25、 30、40、50、60或75%。其它底物也可用於檢測切割。參見US 20070105123。在一些實施方式中，化合物在體外試驗中抑制IRE-la的平均IC5(1為約 20 u M (20,000nM)或更低(例如，20000、15000、10000、7500、7250、7000、6750、 6500, 6250, 6000, 5750, 5500, 5250, 5000, 4750, 4500, 4250, 4000, 3750, 3500、 3250、 3000、 2750、 2500、 2250、 2000、 1750、 1500、 1250、 1000、 950、 900、 850、 800、 750、 700、 650、 600、 550、 500、 450、 400、 350、 300、 250、 200、 150、 100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、5、2 或 InM 或更低)。在一些實施方 式中，化合物在體外XBP-1剪接試驗(例如，骨髓瘤細胞)中抑制IRE-la的平均EC5(1 為 80 ii M (80,000nM)或更低(例如，80000、75000、70000、65000、60000、55000、 50000、 45000、 40000、 35000、 30000、 25000、 20000、 15000、 10000、 7500、 7250、 7000, 6750, 6500, 6250, 6000, 5750, 5500, 5250, 5000, 4750, 4500, 4250, 4000, 3750, 3500, 3250, 3000, 2750, 2500, 2250, 2000, 1750, 1500, 1250, 1000、 950、 900、 850、 800、 750、 700、 650、 600、 550、 500、 450、 400、 350、 300、 250、 200、 150、 100、 90、 80、 70、 60、 50、 40、 30、 20、 15、 10、 5、 2 或 InM 或更 低)。IRE-la抑制劑化合物可符合這些標準中的任一種或全部。本領域熟知，這些化合物中的醛基可表示為下示三種等價形式中的任一種
權利要求
1. 一種如結構式(B)所示的直接抑制體外IRE-I α活性的化合物，或其前藥或藥學 上可接受的鹽
2.—種如結構式(A)所示的直接抑制體外IRE-I α活性的化合物，或其前藥或藥學 上可接受的鹽
3.所述雜原子獨立選自氮、氧或硫，其中所述雜芳基是任選苯並稠合的，其中 所述雜芳基任選被獨立選自下組的1、2或3個取代基取代
4. 一種如結構式(D)所示的直接抑制體外IRE-I α活性的化合物，或其前藥或藥學 上可接受的鹽
5.—種如結構式(E)所示的直接抑制體外IRE-I α活性的化合物或其藥學上可接受的
6.—種如結構式(F)所示的直接抑制體外IRE-I α活性的化合物或其藥學上可接受的
7.—種藥物組合物，其包含權利要求1-6中任一項所述的化合物和藥學上可接受的運 載體。
8.一種治療解摺疊蛋白質效應相關疾病的方法，該方法包括給予有此需要的患者如 結構式⑴所示的直接抑制體外IRE-I α活性的化合物或其前藥或藥學上可接受的鹽Rx式中OH取代基位於醛取代基的鄰位；Q是芳族碳環或雜環系統，選自苯、萘、吡啶、吡啶N-氧化物、噻吩、苯並[b]噻吩、苯並[C]噻吩、呋喃、吡咯、噠嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、異噁唑啉、噁唑啉、噻唑 啉、吡唑啉、咪唑啉、芴、聯苯基、喹啉、異喹啉、噌啉、2，3-二氮雜萘、喹唑啉、 喹喔啉、苯並呋喃、吲哚、異吲哚、異苯並呋喃基、苯並咪唑、1，2-苯並異噁唑和咔 唑；R\ R5^n Rz可以存在或不存在，獨立選自氫、芳基、雜芳基、-A" R\ -OH、-OA" Ra、-NO2、-NH2、-NHA「 Ra、_N(A" Ra) (A「 『 Rb)、-NHCOA「 Ra、-NHCOOA 「R\ -NHCONH2> -NHCONHA「 R\ -NHCON(A「 Ra) (A〃 『 Rb)、滷素、-COOH、-COOA 〃 R\ -CONH2、-CONHA 〃 R\ _CON(A〃 Ra) (A 〃 ' Rb)禾Π 卜丫丫 Ra 和 Rb 獨立為氫、-COOH、-COOA、_CONH2、-CONHA> -CONAA'、-NH2 、-NHA、-NAA'、-NCOA、-NCOOA、-OH 或-OA ；Y是C1-Cltl亞烷基或C2-C8亞烯基，其中(a)l、2或3個CH2基團可以為O、S、 SO、S02、NH或NRe所替代，和/或(b) 1-7個H原子可以獨立為F或Cl所替代； A和A'是(a)獨立為Cl-ClO烷基或C2-C8烯基，其中⑴1、2或3個CH2基團可以為O、 S、SO、S02、NH或NRc所替代，和/或(ii) 1_7個H原子可以獨立為F或Cl、芳基或雜芳基所替代；或(b)或者，A和A'—起形成C2-C7亞烷基，其中1、2或3個CH2基團可以為O、 S、SO、S02、NH> NRc> NCORc或NCOORc所替代，從而形成，例如亞烷基二氧基；A"、A"『獨立為(a)不存在，(b) Cl-ClO亞烷基、C2-C8亞烯基或C3-C7環烷 基，其中1、2或3個CH2基團可為O、S、SO、S02、NH或NRc所替代，和/或1_7 個H原子可為F和/或Cl所替代；或(C) 二者可一起形成C2-C7烷基，其中1、2或3 個 CH2 基團可以為 O、S、SO、S02、NH> NRc> NCORc 或 NCOORc 所替代，Rc是Cl-ClO燒基、C3-C7環烷基、C4-C8亞烷基環烷基或C2-C8烯基；其中1、2 或3個CH2基團可以為O、S、SO、S02、NH> NMe> NEt和/或-CH = CH-基團所 替代，1-7個H原子可以為F和/或Cl所替代，和/或1個H原子可以為Ra所替代；芳基是苯基、苄基、萘基、芴基或聯苯基，其中各自可以是未取代的或為以下基團 所單取代、雙取代或三取代滷素、-CF3、-Rf、-ORd、-N (Rd) 2、_N02、_CN、-CO ORd、CON (Rd) 2、-NRdCORe> -NRdCON (Re) 2, _NRdS02A、-CORd、_S02N(Rd)2、 -S(0)mRf、AA' 一起或 _0(芳基)， Rd和Re獨立為H或C1-C6烷基； Rf是C1-C6烷基；雜芳基是具有1-2個N、O和/或S原子的單環或雙環飽和、不飽和或芳族雜環，其 可以是未取代的或為以下基團所單取代或雙取代羰基氧、滷素、Rf、-ORd、-N(Rd) 2 、-N02、-CN、-COORd、-CON (Rd) 2、-NRdCORe> -NRdCON (Re) 2, _NRfS02Re、-C ORd、_S02NRd 和 / 或-S(0)mRf;禾口 m是O、1或2。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，還包括給予誘導或上調IRE-I α表達的治療劑。
10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，還包括給予在IRE-Iα表達時效力降低 的治療劑。
11.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述化合物是權利要求1-4中任一項所 述的化合物。
12.一種治療解摺疊蛋白質效應相關疾病的方法，該方法包括給予有此需要的患者權 利要求5或權利要求6所述的化合物。
13.一種治療解摺疊蛋白質效應相關疾病的方法，該方法包括給予有此需要的患者 直接體外抑制IRE-I α的化合物或其前藥或藥學上可接受的鹽；和蛋白酶體抑制劑。
14.權利要求1-6中任一項所述化合物或如結構式⑴所示的直接抑制體外IRE-Iα 活性的化合物，或其前藥或藥學上可接受的鹽在製備用於治療解摺疊蛋白質效應相關疾 病的藥物中的應用
全文摘要
直接抑制體外IRE-1α活性的化合物，其前藥和藥學上可接受的鹽。這種化合物和前藥可用於治療解摺疊蛋白質效應相關的疾病，可用作單一藥劑或用於組合治療中。
文檔編號C07C47/548GK102015606SQ200880019035
公開日2011年4月13日 申請日期2008年6月9日 優先權日2007年6月8日
發明者D·G·洛納甘, J·B·帕特森 申請人:滿康德股份有限公司