體外排除急性冠狀動脈症候群的診斷方法
2023-05-22 08:18:16
專利名稱：體外排除急性冠狀動脈症候群的診斷方法
技術領域：
本發明涉及在存在胸痛並懷疑有風險的患者中體外排除急性冠狀動脈症候群(ACS)(通常稱為心肌梗死(MI))的診斷方法，根據所述方法，將基於樣品來定量選自肌鈣蛋白、CK-MB和肌紅蛋白的至少一種心臟標記物的濃度與定量D-二聚體的濃度相聯合。
心肌梗死最通常是由於冠狀動脈的突發閉塞性血栓形成而引起的，導致心肌或多或少廣泛的區域的缺血性壞死。這種由於血栓引起的急性冠狀動脈閉塞最通常與粥樣斑裂開或破裂相關。
心肌梗死是在短期或中期具有重大死亡風險的疾病，並構成發病率在全世界仍然很高的絕對的心臟急症。心肌梗死最通常表現為在夜間或休息時，在胸骨後於胸部突然出現的劇烈疼痛。這種疼痛類似於心絞痛。在實踐中，必須儘快將患急性胸痛的患者轉移至急救中心或ED(Emergency Department)，在其中患者在入院後進行一系列檢查和分析，包括患者的病史研究、心電圖和心臟標記物(如肌鈣蛋白和/或CK-MB和/或肌紅蛋白)的含量測定。然而，心臟的酶、CK-MB和肌紅蛋白的含量測定具有對病理狀態無特異性的缺點，在提出診斷之前，執業醫生需要進行其他專門檢查，例如連續性心電圖，成像技術如心臟都卜勒回波描記術和冠狀動脈造影術。不是所有的醫院都能提供這些專門檢查，並且很少是全天24小時的。對於肌鈣蛋白的含量測定，由於在心肌梗死時，在肌鈣蛋白濃度升高之前可能經過數小時，並且由於肌鈣蛋白在血液中僅在胸痛開始6小時之後才可檢測到，因此根據NACB的建議[「NACB Laboratory Medicine Practice GuidelinesCharacteristics and Utilization of Biochemical Markers in ACSand Heart Failure，CLINICALACUTE CORONARY SYNDROMES-Chapter1，2004」]，在第一次肌鈣蛋白含量測定後4至6小時內需要再次進行肌鈣蛋白含量測定，以從具有正常心電圖的患者中排除心肌梗死。
因此，目前實在需要建立非常早期的策略，所述策略用於在他們進入急救中心時排除懷疑具有急性冠狀動脈症候群的患者。新的策略使得能夠限制產生額外費用的另外的酶含量測定和/或補充的檢查，從而防止浪費時間、改善患者舒適度並任選地根據其病理狀態將患者引入的正確的科室。事實上，診斷越早，對患者的處理就越好。在這種方法中，靈敏度和陰性預報值是最重要的參數。
在專利申請US 6,309,888中提出了通過以下研究來區分冠狀動脈症候群的急性和非急性期(1)第一標記物，如經丙二醛修飾的LDL，其超過預定水平的存在表明對存在ACS急性期的非常高的診斷精確度(即ROC或「觀測者操作特徵(Receiver OperatingCharacteristics)」曲線以下的面積為至少0.875)，其後(2)第二標記物，如氧化的LDL，其高於預定水平的存在表明對存在ACS的非常高的診斷精確度，(2』)或第三標記物，如肌鈣蛋白I，其高於預定水平的存在表明對存在ACS急性期的高診斷精確度(即ROC或「觀測者操作特徵」曲線以下的面積為至少0.70)，(2」)或上文定義的第二和第三標記物。
令人吃驚地，申請人發現，基於來自存在胸痛的患者的液體樣品，將定量選自肌鈣蛋白、CK-MB和肌紅蛋白的至少一種心臟標記物的濃度與定量D-二聚體的濃度相聯合，使得能夠以高靈敏度和高陰性預報值(可達約100％)排除急性冠狀動脈症候群的診斷，這使得能夠同時降低檢查費用和時間，和加快澄清區別性診斷的步伐。
因此，本發明的涉及基於來自懷疑具有風險的患者的液體樣品來排除急性冠狀動脈症候群的體外診斷方法，根據所述方法-定量所述樣品中選自肌鈣蛋白、CK-MB和肌紅蛋白的至少一種心臟標記物的濃度，-定量所述樣品中D-二聚體的濃度，-將樣品中所述心臟標記物的濃度與預定的閾濃度進行比較，-將樣品中D-二聚體的濃度與預定的D-二聚體閾濃度進行比較，和
-確定樣品中所述心臟標記物的濃度和D-二聚體的濃度是否分別低於預定的所述心臟標記物閾濃度和預定的D-二聚體閾濃度；應該理解，所述心臟標記物濃度的定量和D-二聚體濃度的定量可依次進行並且不依賴於順序，或者同時進行，如基於定量肌鈣蛋白濃度和定量D-二聚體濃度的實施例而在下文中更詳細解釋的。
根據本發明的方法，當心臟標記物和D-二聚體的濃度低於預定的閾濃度時，就可排除患者患有急性冠狀動脈症候群。
在本發明的一個實施方案中，-定量所述樣品中肌鈣蛋白的濃度，-定量所述樣品中D-二聚體的濃度，-將樣品中肌鈣蛋白的濃度與預定的肌鈣蛋白閾濃度進行比較，-將樣品中D-二聚體的濃度與預定的D-二聚體閾濃度進行比較，和-確定樣品中肌鈣蛋白的濃度和D-二聚體的濃度是否分別低於預定的肌鈣蛋白閾濃度和預定的D-二聚體閾濃度。
根據本發明的方法，可以基於來自存在胸痛的患者的液體樣品來排除ACS診斷，其靈敏度和陰性預報值高於當患者在急救中心時心臟標記物(如肌鈣蛋白)的單獨的起始含量測定的性能水平。
事實上，目前儘管已經改善了新一代肌鈣蛋白測試的性能水平，但靈敏度和陰性預報值並未達到鄰近100％的值。
可以通過本領域技術人員已知的任何用於測定液體樣品中標記物濃度的方法來進行所述心臟標記物和D-二聚體的濃度的定量。優選地，使用至少一種對所述心臟標記物或對D-二聚體具有特異性的抗體，或者至少一種對所述心臟標記物具有特異性的抗體片段，來進行這種定量。優選地，使用至少一種單克隆抗體，例如抗肌鈣蛋白單克隆抗體。優選地，使用至少一種抗D-二聚體抗體或至少一種抗D-二聚體抗體片段來進行D-二聚體的定量。優選地，使用至少一種抗D-二聚體單克隆抗體。
特別地，術語「抗體片段」指天然抗體的F(ab)2、Fab、Fab』或sFv片段[Blazar等人，1997，Journal of Immunology 1595821-5833，和Bird等人，1988，Science 242423-426]。
在說明書的以下部分中以及在權利要求書中，「抗體」這一通稱用於不加區分地表示單克隆抗體、單特異性多克隆抗體或抗體片段。
在本發明方法的一個實施方案中，定量樣品中心臟標記物(優選肌鈣蛋白)的濃度，然後定量樣品中D-二聚體的濃度。
在本發明方法的第二個實施方案中，定量樣品中D-二聚體的濃度，然後定量樣品中心臟標記物(如肌鈣蛋白)的濃度。
在本發明方法的第三個實施方案中，同時定量樣品中心臟標記物(如肌鈣蛋白)的濃度和D-二聚體的濃度。在此實施方案中，(i)可以將相應於上文所給出的定義的至少一種抗心臟標記物抗體(例如抗肌鈣蛋白抗體)和至少一種抗D-二聚體抗體固定在同一固相上，所述固相可以由管、細帶或錐形漏鬥構成(參見如由申請人銷售的VIDASHIV DUO(參考號30 114)測試原則)，或者(ii)將至少一種抗心臟標記物抗體(例如抗肌鈣蛋白)固定在一固相上，將至少一種抗D-二聚體抗體固定在另一固相上，所述抗體相應於上文給出的定義，並且所述固相可以由管、細帶、錐形漏鬥或顆粒構成。
本發明還涉及用於定量液體樣品中選自肌鈣蛋白、CK-MB和肌紅蛋白的至少一種心臟標記物濃度的試劑以及用於定量液體樣品中D-二聚體濃度的試劑的用途，所述試劑用於排除急性冠狀動脈症候群的體外診斷。
在本發明的一個實施方案中，所述用於定量所述心臟標記物濃度的試劑為至少一種相應於前面所給出的定義的抗體，和所述用於定量D-二聚體濃度的試劑為至少一種相應於前面所給出的定義的抗體。優選地，試劑之一為抗肌鈣蛋白抗體，另一試劑為抗D-二聚體抗體。
液體樣品為可能含有所述心臟標記物和所述D-二聚體的人體的任何液體樣品。優選地，其選自血清、血漿和血液。
肌鈣蛋白是橫紋肌的蛋白質組分之一。它由參與肌肉收縮的三個亞基I、T和C形成。肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T使得能夠區分心肌壞死和骨骼肌損傷。肌鈣蛋白的三種亞型之一，肌鈣蛋白Ic，顯示無交叉反應的心臟特異性。在本發明的方法中，定量肌鈣蛋白T的濃度或肌鈣蛋白I的濃度，優選定量肌鈣蛋白Ic的濃度。
肌酸激酶(CK)是由稱為M和B的兩個亞基組成的二聚體，這兩個亞基相組合而給出三種同工酶CK-BB、CK-MB和CK-MM。這三種同工酶位於細胞質中，每種的分子量約為82,000道爾頓。正常成人血清中的CK主要由同工酶CK-MM組成，僅有痕量的CK-MB。以在大多數CK含量測定中的檢測極限，血清中一般不存在同工酶CK-BB。在血清中檢測到顯著量的CK-MB通常指示具有ACS。然而，在患有除ACS以外的病症的患者血清中也發現了CK-MB。
肌紅蛋白是來自肌細胞血紅素的低分子量蛋白質。它構成了不可逆的細胞壞死的標記物，其血清水平在梗死開始後在早期升高。其非常短的半衰期使得其能夠密切反映梗死的進展。在正常受試者群體中，血肌紅蛋白水平(myoglobinémie)為6至85ng/ml。診斷閾值設定在70和90ng/ml之間。在MI病程中，肌紅蛋白在第2和第4小時之間出現，峰值在第9和第12小時之間出現。在峰值後7至20小時它仍可檢測到。假陰性的比例取決於入院與胸痛開始之間的時間間隔，在第4小時以前為45％至67％。肌紅蛋白存在於生物體的所有橫紋肌中。因此，假陽性是由於心臟復甦、外部電震、肌內注射和某些肌病。升高一般相對不顯著，這種情況經常使得能夠鑑定它們。在腎機能不全的情況下和在引起腎小球濾過作用降低的任何狀況(如進行性心機能不全)中肌紅蛋白水平也升高。年齡、體重和性別對血肌紅蛋白水平幾乎沒有影響。同樣，鍛鍊後血肌紅蛋白水平一般保持正常。
D-二聚體是纖維蛋白降解的產物，具有非常異質的組成的可溶性片段，由兩種同時發生的現象而產生-在凝血酶與凝血因子XIIIa的作用之後，纖維蛋白原凝固成穩定的纖維蛋白，-通過纖溶酶將纖維蛋白凝塊消化成釋放進血液循環的可溶性片段。凝塊裂解的終產物是D-二聚體。
在血栓形成狀態的所有標記物中，D-二聚體是能真正證明存在穩定的纖維蛋白的唯一標記物。
所述心臟標記物(特別是肌鈣蛋白)和D-二聚體可以使用本領域技術人員所熟知的各種免疫測定原則來進行定量，例如ELISA、ELFA、乳膠凝集、比濁法、顆粒比濁法(turbidimétrie avec desparticules)、濁度法、顆粒濁度法(néphélométrie avec desparticules)或其他適當方法。這些原則和其他方法描述於例如「Laborund Diagnose」，L.Thomas(編者)，TH-Books VerlagsgesellschaftmbH，Frankfurt，1998，第60章；或者「Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，-An introduction toRadioimmunoassay and Related Techniques」T.Chard(編者)，Elsevier，Amsterdam，1987。
因此，基於選自ELISA、ELFA、比濁法、濁度法、顆粒比濁法、顆粒濁度法和乳膠凝集的測試，通過免疫測定法彼此獨立地進行樣品中所述心臟標記物(特別是肌鈣蛋白)濃度的定量以及D-二聚體濃度的定量。
閾濃度值可以由本領域技術人員基於熟知的方法對心臟標記物(如肌鈣蛋白)和D-二聚體各自進行定義。例如，對於D-二聚體可以應用以下方法對於來自大量例如通過成像而被診斷為ACS陽性的患者的樣品以及大量來自ACS陰性個體的樣品測定D-二聚體濃度；基於各種不同的閾值對得到的結果進行評估，並保留使得能夠排除ACS陰性而不排除ACS陽性的閾濃度值。閾濃度值可以根據用於D-二聚體含量測定的技術和試劑盒而變化。此方法也可應用於心臟標記物。
對於肌鈣蛋白的具體情況，按照國際推薦來確定閾值，並且必須相應於參考對照群體的第99百分位數[「NACB Laboratory MedicinePractice GuidelinesCharacteristics Utilization ofBiochemical Markers in ACS and Heart Failure，CLINICALACUTECORONARY SYNDROMES-第1章，2004」]。閾濃度值也可以根據用於肌鈣蛋白含量測定的技術和試劑盒而變化。
本發明的優選但非限制性的實施方案是如上文所述用於在懷疑具有風險的患者中排除急性冠狀動脈症候群的體外診斷的方法，其中採用0.1μg/l的閾濃度值，在諸如VIDAS儀器的裝置上，使用夾心免疫酶方法來測試肌鈣蛋白，優選肌鈣蛋白Ic。
本發明的另一個優選但非限制性的實施方案是如上文所述用於在懷疑具有風險的患者中排除急性冠狀動脈症候群的體外診斷的方法，其中採用250ng/ml的閾濃度值，在諸如VIDAS儀器的裝置上，使用夾心免疫酶方法來測試D-二聚體。
通過在6個月中對於來自急救中心的119名胸痛患者所進行的前瞻性研究驗證了如上文所述的用於排除ACS的體外診斷的方法。本發明的方法使得能夠以非常高的靈敏度和非常高的陰性預報值來排除心肌壞死診斷，所述靈敏度和陰性預報值高於當患者在急救中心時單獨的肌鈣蛋白含量測定的性能水平。
下文更詳細地並基於唯一的附圖
描述了本發明的方法，該唯一的附圖顯示了用於評估肌鈣蛋白Ic和D-二聚體的組合用途並用於將患者診斷為排除在ACS之外的算法。這些詳細內容無論如何不應理解為以任何方式限制了本發明。
實施例材料和方法在急救中心中選擇了存在胸痛的119名連續的患者(88男，31女)。在該研究中平均年齡為59歲，上下差距為13歲。對所有患者製作心電圖。在VIDAS儀器(bioMérieux)上，在不同的時間，用VIDASD-Dimer New試劑盒(bioMérieux)和VIDASTroponin I(TNI)試劑盒(bioMérieux)來測試採集自這些患者的新鮮血漿樣品。
在該研究中，時間T0相應於胸痛的出現，時間T1相應於患者到達急救中心時第一樣品的採集，時間T2相應於T1加上6小時。根據新的國際推薦(正常群體的第99百分位數)，肌鈣蛋白I的閾值設置為0.1μg/l以排除心肌梗死。確定D-二聚體的最佳閾值以排除心肌梗死。使用Analyse-It軟體建立D-二聚體的ROC(「觀測者操作特徵」)曲線，以預測心肌梗死。用於排除心肌梗死的D-二聚體ROC曲線給出250ng/ml的最佳閾值(尤登指數(Index de Youden)14.3％，靈敏度88.5％，特異性25.8％；曲線下面積0.60)。
在唯一的附圖中描述了用於評估肌鈣蛋白Ic和D-二聚體的組合使用的算法，其中DDi＝D-二聚體，TnI＝肌鈣蛋白I，MI＝心肌梗死，UA＝不穩定型心絞痛，SA＝穩定型心絞痛。
從該圖中可以看出，如果在時間T1處肌鈣蛋白Ic的濃度高於0.1μg/l並且如果在時間T1處D-二聚體的濃度低於250ng/ml，則不能排除心肌梗死。如果在時間T1處肌鈣蛋白Ic的濃度低於0.1μg/l並且如果在時間T1處D-二聚體的濃度低於250ng/ml，則按照本發明方法可以排除心肌梗死。
靈敏度和特異性
討論26名患者(22％)被診斷為MI陽性。在這些患者中，僅有一名在時間T1處具有陰性的肌鈣蛋白和D-二聚體。然而，關於在T1處為肌鈣蛋白和D-二聚體陰性的其他25名患者，他們的肌鈣蛋白在T2處仍為陰性。使用上文定義的算法，一旦得到在時間T1處所進行的肌鈣蛋白和D-二聚體含量測定的結果，就可在MI方面將群體的21％(25/119)從急救中心排除。
與僅使用肌鈣蛋白得到的結果相比，與肌鈣蛋白陰性結果相聯合的D-二聚體陰性結果(＜250ng/m1)改善了在時間T1處的診斷靈敏度，從46.2％至96.2％。使用這兩種測試的組合，在時間T1處獲得的靈敏度與使用單獨肌鈣蛋白含量測定在時間T2處獲得的靈敏度相等。
肌鈣蛋白與D-二聚體的含量測定的聯合是這樣一種組合，其允許以非常高的靈敏度和陰性預報值，在急救中心中非常早地排除懷疑具有MI風險的患者。
權利要求
1.基於來自懷疑具有風險的患者的液體樣品來排除急性冠狀動脈症候群的體外診斷方法，根據所述方法-定量所述樣品中選自肌鈣蛋白、CK-MB和肌紅蛋白的至少一種心臟標記物的濃度，-定量所述樣品中D-二聚體的濃度，-將樣品中所述心臟標記物的濃度與預定的閾濃度進行比較，-將樣品中D-二聚體的濃度與預定的D-二聚體閾濃度進行比較，和-確定樣品中所述心臟標記物的濃度和D-二聚體的濃度是否分別低於預定的所述心臟標記物閾濃度和預定的D-二聚體閾濃度。
2.權利要求1的方法，根據所述方法-定量所述樣品中肌鈣蛋白的濃度，-定量所述樣品中D-二聚體的濃度，-將樣品中肌鈣蛋白的濃度與預定的肌鈣蛋白閾濃度進行比較，-將樣品中D-二聚體的濃度與預定的D-二聚體閾濃度進行比較，和-確定樣品中肌鈣蛋白的濃度和D-二聚體的濃度是否分別低於預定的肌鈣蛋白閾濃度和預定的D-二聚體閾濃度。
3.權利要求2的方法，根據所述方法-定量所述樣品中肌鈣蛋白的濃度，然後-定量所述樣品中D-二聚體的濃度，-將樣品中肌鈣蛋白的濃度與預定的肌鈣蛋白閾濃度進行比較，-將樣品中D-二聚體的濃度與預定的D-二聚體閾濃度進行比較，和-確定樣品中肌鈣蛋白的濃度和D-二聚體的濃度是否分別低於預定的肌鈣蛋白閾濃度和預定的D-二聚體閾濃度。
4.權利要求2的方法，根據所述方法-定量所述樣品中D-二聚體的濃度，然後-定量所述樣品中肌鈣蛋白的濃度，-將樣品中肌鈣蛋白的濃度與預定的肌鈣蛋白閾濃度進行比較，-將樣品中D-二聚體的濃度與預定的D-二聚體閾濃度進行比較，和-確定樣品中肌鈣蛋白的濃度和D-二聚體的濃度是否分別低於預定的肌鈣蛋白閾濃度和預定的D-二聚體閾濃度。
5.權利要求2的方法，根據所述方法-同時定量所述樣品中肌鈣蛋白的濃度和D-二聚體的濃度，-將樣品中肌鈣蛋白的濃度與預定的肌鈣蛋白閾濃度進行比較，-將樣品中D-二聚體的濃度與預定的D-二聚體閾濃度進行比較，和-確定樣品中肌鈣蛋白的濃度和D-二聚體的濃度是否分別低於預定的肌鈣蛋白閾濃度和預定的D-二聚體閾濃度。
6.權利要求1或權利要求2的方法，其中所述液體樣品選自血清、血漿和血液。
7.權利要求1的方法，其中通過免疫測定法彼此獨立地進行樣品中所述心臟標記物濃度的定量和D-二聚體濃度的定量。
8.權利要求2的方法，其中通過免疫測定法彼此獨立地進行樣品中肌鈣蛋白濃度的定量和D-二聚體濃度的定量。
9.權利要求7的方法，其中基於選自ELISA、ELFA、比濁法、濁度法、顆粒比濁法、顆粒濁度法和乳膠凝集的測試，彼此獨立地進行樣品中所述心臟標記物濃度的定量和D-二聚體濃度的定量。
10.權利要求8的方法，其中基於選自ELISA、ELFA、比濁法、濁度法、顆粒比濁法、顆粒濁度法和乳膠凝集的測試，彼此獨立地進行樣品中肌鈣蛋白濃度的定量和D-二聚體濃度的定量。
11.用於定量液體樣品中選自肌鈣蛋白、CK-MB和肌紅蛋白的至少一種心臟標記物濃度的試劑以及用於定量液體樣品中D-二聚體濃度的試劑在排除急性冠狀動脈症候群的體外診斷中的用途。
12.權利要求11的用途，其中所述用途為用於定量液體樣品中肌鈣蛋白濃度的試劑以及用於定量液體樣品中D-二聚體濃度的試劑在排除急性冠狀動脈症候群的體外診斷中的用途。
13.權利要求11的用途，其中所述試劑之一為至少一種心臟標記物的至少一種抗體，所述試劑中另一為至少一種抗D-二聚體抗體。
14.權利要求12的用途，其中所述試劑之一為至少一種抗肌鈣蛋白抗體，所述試劑中另一為至少一種抗D-二聚體抗體。
15.權利要求11至14中任一項的用途，其中所述液體樣品選自血清、血漿和血液。
全文摘要
本發明涉及用於體外排除急性冠狀動脈症候群(ACS)的診斷方法，根據該方法，將定量在樣品中選自肌鈣蛋白、CK－MB和肌紅蛋白的至少一種心臟標記物的濃度與定量D－二聚體的濃度相聯合；還涉及用於定量至少一種所述心臟標記物的濃度的試劑和用於定量D－二聚體的濃度的試劑在排除急性冠狀動脈症候群的體外診斷中的用途。
文檔編號G01N33/68GK101040187SQ200580034742
公開日2007年9月19日 申請日期2005年10月10日 優先權日2004年10月11日
發明者E·博納富瓦, G·洛維 申請人:拜奧默裡克斯公司