一種聯產香葉醇和橙花醇的基因工程菌及其構建方法和應用的製作方法

2023-05-22 08:20:31

一種聯產香葉醇和橙花醇的基因工程菌及其構建方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種聯產香葉醇和橙花醇的基因工程菌及其構建方法和應用，屬於基因工程【技術領域】。本發明在基因工程菌中表達了乙醯輔酶A醯基轉移酶/羥甲基戊二醯輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二醯輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構酶、香葉酯二磷酸合成酶，以及香葉醇合成酶或磷酸酶。本發明利用基因工程手段在大腸桿菌體內成功建立了合成香葉醇和橙花醇的代謝途徑，可直接將葡萄糖生物轉化為香葉醇和橙花醇。
【專利說明】一種聯產香葉醇和橙花醇的基因工程菌及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種聯產香葉醇和橙花醇的基因工程菌及其構建方法和應用，屬於基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]香葉醇(反_3，7-甲基-2，6-辛二烯-1-醇，Geraniol，又稱櫳牛兒醇)及其同分異構體橙花醇(順_3，7- 二甲基-2，6-辛二烯醇，nerol)是一種非環單萜醇類化合物，是玫瑰油、馬丁香油和香茅油等香精油的主要成分之一。香葉醇和橙花醇及其酯可用於香精和食用香精，是玫瑰系香精的主劑，還可廣泛應用於藥物、菸草、食品配料。此外，還可用作天然低毒防蟲劑，一類新型的化學防癌製劑。目前橙花醇的全球年需求量在5000噸左右，其中我國的需求量也不低於500噸，而全世界的生產能力只有3000噸左右。
[0003]香葉醇和橙花醇天然存在於天竺葵、芸香草、香茅、玫瑰花等50多種植物中。從天然植物中提取出揮髮油，仍是市場上的主要來源。但是，由於人工培植受氣候影響較大，且隨著人力成本的上升，天然香葉醇的數量和成本難以穩定，供應不能得到保證。
[0004]工業上生產香葉醇和橙花醇是以月桂烯為原料，月桂烯的一級氯化物與乙酸鈉共熱，得香葉醇和橙花醇的乙酸酯混合物。然後將此粗酯皂化，再蒸餾得約含60%櫳牛兒醇和40%橙花醇的混合物，仔細分餾可得高品級的香葉醇。黃宇平等以芳樟醇為原料，合成出香葉醇和橙花醇。以檸檬醛為原料製備橙花醇香葉醇的合成方法已有許多報導，例如催化氫化法，醇鋁法，硼氫化鈉法。尹顯洪對硼氫化鈉法進行改進研究，以水和苯作混合溶劑，替代純有機溶劑。採用相轉移催化方法，提高反應速率。但是，化學法存在環境汙染、條件苛刻等問題，且合成的產品雜質多，影響了香葉醇的品質及下遊應用。

【發明內容】

[0005]本發明要解決的問題是提供一種以葡萄糖為底物合成香葉醇和橙花醇的基因工程菌。
[0006]所述基因工程菌是在能夠表達香葉基焦磷酸的微生物中導入了香葉醇合成酶基因或磷酸酶基因得到的基因工程菌。
[0007]所述微生物為常用於分子生物學改造的微生物，優選大腸桿菌。
[0008]所述基因工程菌共表達了乙醯輔酶A醯基轉移酶/羥甲基戊二醯輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二醯輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構酶、香葉酯二磷酸合成酶，以及香葉醇合成酶或磷酸酶。
[0009]所述乙醯輔酶A醯基轉移酶/羥甲基戊二醯輔酶A還原酶來源於釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),或細菌，或其它生物體，優選糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)ο
[0010]所述3-輕-3-甲基戍二醯輔酶A合酶來源於:釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),或細菌,或其它生物體，優選糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。
[0011]所述甲輕戍酸激酶來源於釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),或細菌,或其它生物體，優選釀酒酵母。
[0012]所述甲輕戍酸-5-磷酸激酶來源於釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),或細菌，或其它生物體，優選釀酒酵母。
[0013]所述甲輕戍酸-5-二磷酸脫羧酶來源於釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),或細菌，或其它生物體，優選釀酒酵母。
[0014]所述異戍烯焦磷酸異構酶來源於釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),或細菌，或其它生物體，優選釀酒酵母。
[0015]所述香葉酯二磷酸合成酶來源於大腸桿菌(Escherichia coli),或北美冷杉(Abiesgrandis)其它生物體,優選北美冷杉。
[0016]所述香葉醇合成酶來源於甜羅勒(Sweet Basil),或細毛樟(Cinnamomumtenuipilum),或其它生物體。優選來源於甜羅勒的香葉醇合成酶，其核苷酸序列如GenBank: AY362553.1 所不。
[0017]所述磷酸酶來源於酵母，或細菌，或其它生物體，優選釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。優選釀酒酵母的憐脂酸憐酸酶 DPPl (NCBI ReferenceSequence:ΝΜ_001180592.1)，或來源於釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶LPPl (NCBI ReferenceSequence:NM_001180811.3)，或來源於大腸桿菌的ADP-核糖焦磷酸酶基因EcNudF(GenBank:U22009.1 )，或 來源於大腸桿菌的鹼性磷酸酶(phoA)，或來源於枯草芽胞桿菌的憐酸酶 phoE (GenBank: CP003783.1 )，或來源於克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)的喊性憐酸酶 phoA (GenBank:AF453253.1)。
[0018]本發明還提供一種構建所述基因工程菌的方法，是在能夠表達香葉基焦磷酸的微生物中導入了香葉醇合成酶基因或磷酸酶基因。
[0019]所述構建方法主要包括下述步驟:
[0020](I)將乙醯輔酶A醯基轉移酶基因/羥甲基戊二醯輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二醯輔酶A合酶基因以及香葉酯二磷酸合成酶基因克隆到質粒pACYCDuet-Ι，構建重組質粒 pACY-mvaE-mvaS_GPPS2。
[0021]所述乙醯輔酶A醯基轉移酶基因/羥甲基戊二醯輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戍二醯輔酶A合酶基因優選來源於糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。所述香葉酯二磷酸合成酶基因來源於北美冷杉(Abiesgrandis )。
[0022](2)將甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶基因以及異戊烯焦磷酸異構酶基因克隆到pTrcHiS2B得到重組質粒pTrc-low。
[0023]所述甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶基因、異戍烯焦磷酸異構酶基因優選來源於釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0024](3)將編碼香葉醇合成酶或磷酸酶或焦磷酸酶的基因克隆到質粒pACY-mvaE-mvaS-GPPS2 上。
[0025]本發明首次證明磷酸酶可以催化GPP合成香葉醇和橙花醇。
[0026]本發明還提供了一種生產香葉醇和橙花醇的的方法，是在能夠表達香葉基焦磷酸的微生物中導入香葉醇合成酶基因或磷酸酶基因，利用基因工程菌發酵生產香葉醇和橙花醇。
[0027]在微生物中共表達乙醯輔酶A醯基轉移酶/羥甲基戊二醯輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二醯輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構酶、香葉酯二磷酸合成酶，以及香葉醇合成酶或磷酸酶；利用重組菌發酵生產香葉醇和橙花醇。
[0028]優選在微生物中共表達乙醯輔酶A醯基轉移酶/羥甲基戊二醯輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二醯輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構酶、香葉酯二磷酸合成酶和磷酸酶；利用重組菌發酵生產香葉醇和橙花醇。
[0029]所述磷酸酶是來自釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶DPP1，編碼該酶的核苷酸序列如NCBIReference Sequence:ΝΜ_001180592.1所示；或是來自釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶LPP1，編碼該酶的核苷酸序列如NCBI Reference Sequence:NM_001180811.3所示；或是來源於大腸桿菌的ADP-核糖焦磷酸酶基因EcNudF，其核苷酸序列如GenBank:U22009.1所示；或是來源於大腸桿菌的鹼性磷酸酶基因phoA，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；或是來源於枯草芽胞桿菌的磷酸酶phoE，其核苷酸序列如GenBank:CP003783.1所示；或是來源於克雷伯氏肺炎菌的鹼性磷酸酶phoA,其核苷酸序列如GenBank:AF453253.1所示。
[0030]本發明提出利用廉價的、可再生資源葡萄糖為原料，通過生物催化劑直接製備香葉醇和橙花醇。該路線原料廉價、可持續供應，具有規模化發展的潛力。與傳統的製備工藝相比，利用微生物催化合成菔烯的路線具有如下的優勢:(1)使用的原料為木質纖維素降解獲得的葡萄糖，是可再生資源。(2)整個過程是在常溫常壓下進行，能耗低。(3)與從植物中提取法相同，生物法合成的香葉醇和橙花醇是天然產品，市場需求度高。(4)以葡萄糖為原料，通過工程菌一步發酵獲得香葉醇和橙花醇，具備產業化生產潛力。因此，利用生物催化手段製備香葉醇和橙花醇將成為今後工業發展的必然趨勢。此外，大腸桿菌具有生長速度快、發酵周期短、遺傳背景清楚、易於工程化操作、可利用廉價的可再生資源等特點，因此大腸桿菌作為生物催化劑已成為近年來生產生物基化學品的有效手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1是質粒pLWG2構建示意圖。
[0032]圖2是質粒pLWG3構建示意圖。
[0033]圖3是質粒pLWG4構建示意圖。
[0034]圖4是質粒pLWG5構建示意圖。
[0035]圖5香葉醇和橙花醇混合標準品GC-MS流出曲線。
[0036]圖6橙花醇分子碎片質譜圖。
[0037]圖7香葉醇分子碎片質譜圖。
[0038]圖8工程大腸桿菌LWG2合成出的香葉醇GC-MS圖。
[0039]圖9工程大腸桿菌LWG3的GC-MS圖。
[0040]圖10工程大腸桿菌LWG4的GC-MS圖。
[0041 ]圖11香葉醇和橙花醇混合標準品的GC檢測圖。
[0042]圖12工程大腸桿菌LWG5合成出的橙花醇和香葉醇的GC檢測圖。[0043]圖13工程大腸桿菌LWG6合成出的橙花醇和香葉醇的GC檢測圖。
【具體實施方式】
[0044]本發明利用基因工程手段以大腸桿菌為模式菌株，在其體內成功建立了合成香葉醇和橙花醇的代謝途徑，可直接將葡萄糖生物轉化為香葉醇和橙花醇。
[0045]橙花醇和香葉醇的檢測方法:取發酵液Iml然後12000X Imin離心，取上清500 μ I並加入等體積乙酸乙酯於渦旋振蕩器上混勻5min，然後靜置lOmin，取上層有機相進行過濾後放置在液相小瓶中待測。檢測條件=GC-MS儀器型號:Angilent7890 ;分離柱型號:DB-5 ;離子源:EI ;進樣量:0.01ml ;檢測器:四級杆；柱溫:50°C起步以10°C /min的速度升溫至280°C，保溫5min ;樣品檢測:取液相小瓶中液體進行檢測。GC儀器型號:SP_6890分離柱形號:HP-1NNOWAX進樣量:Iul檢測器:氫火焰檢測器(FID)柱溫:50°C起步以10°C /min的速度升溫至250°C，保溫5min樣品檢測:取上層有機相進行檢測。
[0046]質粒:
[0047]pYJM26,即 pACY-mvaE-mvaS_GPPS2,是攜帶有來源於幾腸球菌(Enterococcusfaecalis)的乙醯輔酶A醯基轉移酶基因/羥甲基戊二醯輔酶A還原酶基因(mvaE)(GenBank N0.AAG02438)，3-羥 _3_ 甲基戊二醯輔酶 A 合酶基因(mvaS) (GenBankN0.AAG02439)；以及來源於北美冷杉(Abiesgrandis)的香葉酯二磷酸合成酶基因(GPPS2) (GenBank N0.AF513112.1)的 pACYCDuet-Ι。pYJM26 的構建方法參見 JianmingYang, et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis ofalpha-pinene.Biotechnology for Biofuels，2013，6:60。
[0048]pYJM14，即 pTrc-low，是攜帶有來源於釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羥戊酸激酶基因(ERG12)NCBI Reference Sequence:NM—001182715.1，甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8)NCBI Reference Sequence:NM—001182727.1，甲羥戊酸 _5_ 二磷酸脫羧酶基因(ERG19)GenBank:X97557.1，異戊烯焦磷酸異構酶基因(IDIl)NCBIReference Sequence:NM—001183931.1 的 pTrcHis2B。該質粒的構建方法參見 JianmingYang, et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis ofalpha-pinene.Biotechnology for Biofuels，2013，6:60。
[0049]表1引物序列
[0050]
【權利要求】
1.一種聯產香葉醇和橙花醇的基因工程菌，其特徵在於，是在能夠表達香葉基焦磷酸的微生物中導入了香葉醇合成酶基因或磷酸酶基因得到的基因工程菌。
2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特徵在於，所述基因工程菌共表達了乙醯輔酶A醯基轉移酶/羥甲基戊二醯輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二醯輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構酶、香葉酯二磷酸合成酶，以及香葉醇合成酶或磷酸酶。
3.根據權利要求2所述的基因工程菌，其特徵在於，所述香葉醇合成酶來源於甜羅勒，編碼該酶的核苷酸序列如GenBank:AY362553.1所示。
4.根據權利要求2所述的基因工程菌，其特徵在於，所述磷酸酶是來自釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶DPP1，編碼該酶的核苷酸序列如NCBI Reference Sequence:ΝΜ_001180592.1所示；或是來自釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶LPPl，編碼該酶的核苷酸序列如NCBI ReferenceSequence:NM_001180811.3所示；或是來源於大腸桿菌的ADP-核糖焦磷酸酶基因EcNudF，其核苷酸序列如GenBank:U22009.1所示；或是來源於大腸桿菌的鹼性磷酸酶基因phoA,其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；或是來源於枯草芽胞桿菌的磷酸酶phoE，其核苷酸序列如GenBank:CP003783.1所示；或是來源於克雷伯氏肺炎菌的鹼性磷酸酶phoA，其核苷酸序列如 GenBank:AF453253.1 所不。
5.一種構建權利要求1所述基因工程菌的方法，是在能夠表達香葉基焦磷酸的微生物中導入了香葉醇合成酶基因或磷酸酶基因。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，具體步驟如下: (1)將乙醯輔酶A醯基 轉移酶基因/羥甲基戊二醯輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二醯輔酶A合酶基因以及香葉酯二磷酸合成酶基因克隆到質粒pACY⑶uet-Ι，構建重組質粒 pACY-mvaE-mvaS_GPPS2 ； 所述乙醯輔酶A醯基轉移酶基因/羥甲基戊二醯輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二醯輔酶A合酶基因來源於糞腸球菌(Enterococcus faecalis),所述香葉酯二磷酸合成酶基因來源於北美冷杉(Abiesgrandis)； (2)將甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因以及異戍烯焦磷酸異構酶基因克隆到pTrcHis2B得到重組質粒pTrc_low ； 所述甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶基因、異戍烯焦磷酸異構酶基因優選來源於釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)； (3)將編碼香葉醇合成酶或磷酸酶或焦磷酸酶的基因克隆到質粒pACY-mvaE-mvaS-GPPS2 上。
7.—種生產香葉醇和橙花醇的的方法，其特徵在於，在能夠表達香葉基焦磷酸的微生物中導入香葉醇合成酶基因或磷酸酶基因，利用基因工程菌發酵生產香葉醇和橙花醇。
8.根據權利要求7所述方法，其特徵在於，在微生物中共表達乙醯輔酶A醯基轉移酶/羥甲基戊二醯輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二醯輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構酶、香葉酯二磷酸合成酶，以及香葉醇合成酶或磷酸酶；利用重組菌發酵生產香葉醇和橙花醇。
9.根據權利要求8所述方法，其特徵在於，在微生物中共表達乙醯輔酶A醯基轉移酶/羥甲基戊二醯輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二醯輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5- 二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構酶、香葉酯二磷酸合成酶和磷酸酶；利用重組菌發酵生產香葉醇和橙花醇。
10.根據權利要求9所述方法，其特徵在於，所述磷酸酶是來自釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶DPP1，編碼該酶的核苷 酸序列如NCBI Reference Sequence:ΝΜ_001180592.1所示；或是來自釀酒酵母的磷脂酸磷酸酶LPP1,編碼該酶的核苷酸序列如NCBI ReferenceSequence:NM_001180811.3所示；或是來源於大腸桿菌的ADP-核糖焦磷酸酶基因EcNudF，其核苷酸序列如GenBank:U22009.1所示；或是來源於大腸桿菌的鹼性磷酸酶基因phoA,其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；或是來源於枯草芽胞桿菌的磷酸酶phoE，其核苷酸序列如GenBank:CP003783.1所示；或是來源於克雷伯氏肺炎菌的鹼性磷酸酶phoA，其核苷酸序列如 GenBank: AF453253.1 所不。
【文檔編號】C12N15/74GK103898037SQ201410086945
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月11日 優先權日:2014年3月11日
【發明者】鹹漠, 劉煒, 田寧, 蔣昱東 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所