複合膠原止血材料的製備方法
2023-05-22 08:07:21
專利名稱：複合膠原止血材料的製備方法
技術領域：
本發明是將膠原進行修飾，及修飾後膠原再與中草藥製成複合材料，縮 短複合材料的止血時間，適用醫用生物材料領域的止血材料範疇。
技術背景出血給外科手術和人類生活帶來的諸多風險和危害，尋求理想有效的止 血劑一直是國內外研究的熱點。繼阿富汗、伊拉克戰爭及反恐怖主義在世界範圍內展開之後，美國軍方研製出快速止血劑，(止血時間為30s)，目前國 內外止血劑的優劣以止血時間為評價標準，這對止血材料的性能又提出更高 的要求。隨著醫學技術水平的不斷提高，止血材料和方法有了很大發展。近 年來，國內外已開發出許多止血劑，常用的有明膠海綿，纖維蛋白膠，氧化 纖維素，凝血酶等，與傳統的止血材料和方法如紗布、結紮等相比，止血效果明顯好，但速度還不是很快，且它們還分別存在一定的缺點或副作用明 膠可能增加傷口的感染率，尤其是汙染的傷口，且其附粘力差較易脫落，如 用於內臟止血需縫合固定，此外由於其止血作用須依賴機體的凝血因子參與， 故在伴有凝血機制障礙時，其止血效果往往不理想；纖維蛋白膠是血液製品， 有傳播血源性傳染病如肝炎或AIDS的危險，且在使用中不宜直接注入血管 內，以防血栓形成或產生過敏反應，此外對動脈、較大靜脈出血的止血作用 不佳；氧化纖維素的酸性可能引起神經纖維變性，且它有很強的吸水性，若 受潮後將影響其止血作用；凝血酶雖能明顯促進血小板的戮附、聚集，但價 格較昂貴；而另外一種有效的止血劑一膠原止血劑則不存在上述缺陷，且與 上述諸者相比，其止血時間短，效果好，副作用小且較經濟，是一種理想的 止血劑。發明內容目前國內普遍使用的醫用膠原其平均止血時間為90s左右，與國外止血劑 (美國軍方止血劑止血時間為30s)的止血時間相比尚存在很大差距，因此國內 快速止血劑的研究又成為熱點課題。膠原蛋白存在狀態的多樣性及其止血效果研究的複雜性，膠原的止血性 能仍然是主要課題。目前國內使用的膠原止血材料基本未經過修飾，此外， 由於膠原的止血依賴於正常的凝血機制，故對於接受抗凝治療或有凝血功能 障礙的患者而言其止血效果往往不理想。鑑於此，本發明在膠原提取的基礎 上，擬採用低溫化學修飾並將修飾後膠原與其它止血藥物進行複合的方法來 增強和改善膠原的止血性能。本發明提供了步驟l)膠原棉網的製備將牛二層皮製成灰皮，加入質量百分濃度為2-4。/。的浸灰劑Ca(OH)2，以 及10倍於灰皮質量的水進行浸灰，室溫反應24-48h後，充分水洗；再用質量百 分濃度為4-8。/。的脫灰劑NH4Cl或(NH4)2S04，以及5倍於灰皮的水進行脫灰，室溫反應4-10h後，充分水洗；破碎；用質量百分濃度為3。；的胃蛋白酶進行酶水解48-72h;離心，轉速為10000-20000rpm;用NaOH調節pH值至7，採用質量 百分濃度為4。/。的NaCl進行鹽析，室溫靜置24h以上；二次離心，轉速為 10000-20000rpm;用0.5mol/L的醋酸，進行酸溶解，10°C以下冷凍乾燥製成膠 原棉網；步驟2)膠原修飾配製溶液配製質量百分比濃度為2 4%的甲醛，乙醛和戊二醛溶液之一， 用鹽酸和氫氧化鈉調節溶液pH值為7 9，同時配製pH二8的磷酸鈉或者磷酸 氫鈉緩衝液；修飾將膠原棉網浸泡於上述配製的醛溶液中，反應溫度範圍為25~35°C， 浸泡時間為48 96h;漂洗用磷酸鹽溶液衝洗；置於乙醇溶液中以滅除細菌； l(TC以下冷凍乾燥得到修飾膠原膜；步驟3)膠原複合材料製備配置質量百分比濃度為2~4%能將血漿中可溶纖維蛋白催化成不溶纖維蛋 白的中草藥溶液，調節pH5 7，將修飾後的膠原膜浸漬在藥物溶液中，反應溫 度為23 3,(TC，浸泡時間為6 24h，置於冷凍乾燥機中1(TC以下冷凍，乾燥， 得到複合膠原止血材料。止血性能提高說明膠原具有促進血小板凝血和血漿結塊的作用，與其它常用止血劑相比，止血率高，效果好，副作用小且較經濟，是一種非常理想的止血材料；但目 前我國使用的膠原基本未經過修飾，與國外修飾過的相比止血時間過長，因 此本發明有必要對天然膠原進行化學修飾，並與中草藥複合，以提高膠原復 合材料止血性能。膠原的修飾膠原同其它蛋白質一樣，也是由胺基酸排列組成，而胺基酸屬於兩性電 解質，即在同一分子中，既含有鹼性的氨基(-NH2)，又含有酸性的羧基(扁COOH)。膠原的活性氨基可與醛中的羰基發生反應,0 卩 Rr'—C —h + H;jN—ch-COOH :^=^ R'—f — m —COOH + H2H可以看出，修飾劑醛對膠原側鏈上疏水的活性氨基起到了一定程度的去 除作用，而親水的活性羧基數量未發生變化，相對的數目卻有所增加，這使 得膠原的親水性能得到增強，從而提高了膠原複合材料止血性能。修飾後膠原與中草藥複合植物中草藥兼具有止血和改善凝血機制的功效，且該藥經濟廉價，無毒 無副作用。其止血機理為誘致血小板聚集及其成分的釋放，包括腺核苷酸 和鈣的釋放，將血漿中可溶的纖維蛋白原轉變為不溶的纖維蛋白塊，從而達 到局部止血的作用。膠原膜在植物中草藥溶液中充分浸漬時，由於分子間的 作用力與擴散、滲透作用使得藥物分子進入到膠原三螺旋結構的空隙中，故 在止血過程中會產生協同強化的效果，從而進一步增強了膠原的止血性能。本發明的效益本發明從皮革副產物中提取高純度膠原，在此基礎上對 其止血性能進行應用基礎研究，採用膠原提取~~^化學修飾""^與植物中 草藥複合的工藝路線有自主地開發複合膠原止血劑。蛋白質修飾技術現已應 用於提高膠原蛋白生物材料的機能和止血性能。對膠原進行定量可控的化學修飾，研製出新一代止血材料。在提高生物醫用材料科技含量的基礎上，擴 大了我國醫用生物材料市場份額，為我國人民的生活健康質量提供保證。
圖l醛類修飾膠原的紅外圖譜 圖2複合膠原的紅外圖譜 圖3膠原複合材料示意圖其中，表示膠原分子； 一表示膠原棉網結構；O表示草藥分子具體實施方式
對膠原側鏈氨基修飾而言，醛是較為適用且效果非常好的修飾劑。本發 明分別選用甲醛、乙二醛、戊二醛為修飾劑，對膠原的氨基進行修飾，修飾 後的膠原再與中草藥複合製成止血材料，此複合止血材料止血時間大大縮短。 冷凍乾燥的溫度均為1(TC以下。例l:戊二醛修飾膠原中草藥複合步驟l)膠原棉網的製備將牛二層皮製成灰皮，稱取10g，破碎。加入質量百分濃度為2%的浸灰劑Ca(OH)2，水100ml，浸灰，在室溫反應24h後，充分水洗，再用質量百分濃度 為4。/。的脫灰劑NH4Cl，水50ml，進行脫灰，室溫反應6h;充分水洗；絞碎； 用質量百分濃度3l的胃蛋白酶水解48h，離心，轉速為10000rpm;用NaOH調 節pH值至7，採用質量百分濃度為4y。的NaCl鹽析，靜置24h; 二次離心，轉速 為10000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml進行酸溶解，冷凍乾燥製成膠原棉網。 步驟2)膠原修飾配製質量百分比濃度為2M的戊二醛溶液，用鹽酸和氫氧化鈉調節溶液pH 值為7，將膠原棉網浸泡於上述戊二醛溶液中，反應溫度為25。C，浸泡48h;同時配製pH二8的磷酸鈉緩衝液漂洗；置於乙醇溶液中以滅除細菌；然後冷凍乾燥，得到修飾膠原棉網。戊二醛屬於雙醛，是兩羰基之間有三個C原子相連，其化學分子式為H H^\ 」 這三個碳原子產生了鄰近基團效應，使得羰基具有很大活性，基 本上相當於兩個單醛同時在發揮作用，戊二醛主要與膠原中的賴氨酸和羥賴氨酸發生反應，但由於戊二醛分子在在pl^7時的擴散、滲透好，故與膠原分 子的接觸和反應較為充分、完全；而另一方面，與醛基反應的氨基等活性基 團在鹼性條件下能發生較好的解離，有利於與戊二醛進行反應，達到去除氨 基的效果。如圖1所示，膠原膜在3386cm"附近有一個強而寬的吸收峰，該峰對應 於膠原蛋白中醯胺鍵中N—H鍵的伸縮振動特徵吸收峰；在1700 1300cm—1 間分別出現三個吸收峰，它們是蛋白質中的醯胺I帶1656cm—1， C二O鍵伸縮 振動峰、醯胺II帶1542cm—1， N—H彎曲和C一N伸縮振動的混頻峰及醯胺 III帶1387 cm—1， C一N鍵伸縮振動峰，這些是蛋白質的IR中最特徵的吸收峰。對比膠原膜和戊二醛修飾膠原膜，可以看出經過醛修飾後，在3386cm" 位置的峰向短波方向移動，這主要與膠原蛋白中NH鍵及H鍵有關。當醛插 入膠原三股螺旋內部後，在一定程度上破壞了螺旋之間的氫鍵，但同時醯胺 帶中的〔:=0和所生成的水分子又形成了更多的氫鍵，因此峰向短波方向移 動；此外，修飾後膠原中的三個醯胺帶減弱了，這表明醛的滲入使膠原中醯 胺鍵的振動受到了遏制，即修飾反應發生在醯胺鍵的位置；但這三個峰依然 存在，說明經過戊二醛修飾後的膠原均未發生變性。此時戊二醛對膠原的修 飾效果最佳，修飾原的止血性能最佳。修飾率80%。步驟3)膠原複合材料製備配置質量百分比濃度為2%的中草藥(北京中藥廠XB030020109 ，成分 為C44.9%、 H6.4%、 N0.8%、以及微量的無機元素P、 Ca等)溶液，調節pH至 5，將修飾後的膠原膜浸漬在藥物溶液中，反應溫度為23"C，浸泡6h，冷凍幹 燥，得到膠原複合材料。由圖2可以看出，膠原經過與藥物複合之後，其N—H伸縮振動峰及三 個醯胺帶的峰在複合膠原的圖譜中均對應出現，而N—H峰向長波方向發生 了移動，表明該複合過程在一定程度上破壞了膠原螺旋之間的氫鍵，導致其 分子間作用力發生了變化，草藥分子進入了修飾膠原棉網中如圖3所示，並 於膠原的分子形成物理結合，故在止血過程中會產生膠原及草藥的協同強化 效果，從而進一步增強了膠原的止血性能。膠原複合材料的止血時間為51S。例2:戊二醛修飾膠原中草藥複合 步驟l)膠原棉網的製備將牛二層皮製成灰皮，稱取10g，破碎。加入質量百分濃度為3%的浸灰劑Ca(OH)2，水100ml，浸灰，在室溫反應36h後，充分水洗，再用質量百分濃度 為6。/。的脫灰劑NH4Cl，水50ml，進行脫灰，室溫反應6h;充分水洗；絞碎； 用質量百分濃度3。；的胃蛋白酶水解60h，離心，轉速為15000rpm;用NaOH調 節pH值至7，採用質量百分濃度為4。/。的NaCl鹽析，靜置24h; 二次離心，轉速 為15000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml進行酸溶解，冷凍乾燥製成膠原棉網。步驟2)膠原修飾配製質量百分比濃度為2。/。的戊二醛溶液，用鹽酸和氫氧化鈉調節溶液pH 值為7，將膠原棉網浸泡於上述戊二醛溶液中，反應溫度為25。C，浸泡96h; 同時配製pH二8的磷酸氫鈉緩衝液漂洗；置於乙醇溶液中以滅除細菌；然後 冷凍乾燥，得到修飾膠原棉網，修飾率為85%。步驟3)膠原複合材料製備配置質量百分比濃度為2。/。的中草藥溶液，調節pH至5，將修飾後的膠原 膜浸漬在藥物溶液中，反應溫度為28'C，浸泡12h，冷凍乾燥，得到膠原複合 材料。由圖2可以看出，膠原經過與藥物複合時間加長之後，其N—H伸縮振 動峰及三個醯胺帶的峰在複合膠原的圖譜中均對應出現，而N—H峰向長波 方向發生了移動比例1移動明顯，複合過程在破壞了膠原螺旋之間的氫鍵， 導致其分子間作用力發生了變化，草藥分子進入了修飾膠原棉網中如圖3所 示，並於膠原的分子形成物理結合更完全，從而進一步增強了膠原的止血性 能。膠原複合材料的止血時間為45S。例3:乙二醛修飾膠原中草藥複合 步驟l)膠原棉網的製備將牛二層皮製成灰皮，稱取10g，破碎。加入質量百分濃度為3%的浸灰劑 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，在室溫反應48h後，充分水洗，再用質量百分濃度 為8。/。的脫灰齊l」(NH4)2S04，水50ml，進行脫灰，室溫反應10h;充分水洗；絞碎;用質量百分濃度3^。的胃蛋白酶水解72h，離心，轉速為20000rpm;用NaOH調 節pH值至7，採用質量百分濃度為4M的NaCl鹽析，靜置24h; 二次離心，轉速 為20000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml進行酸溶解，冷凍乾燥製成膠原棉網。 步驟2)膠原修飾配製質量百分比濃度為3%的乙二醛溶液，用鹽酸和氫氧化鈉調節溶液pH 值為8，將膠原棉網浸泡於上述戊二醛溶液中，反應溫度為32。C，浸泡96h;同時配製pH二8的磷酸鈉緩衝液漂洗；置於乙醇溶液中以滅除細菌；然後冷凍乾燥，得到修飾膠原棉網。乙二醛與戊二醛不同，它也屬於雙醛，且為最簡單的雙醛，分子式為C2H202，化學分子式為h"h即少了3個C。乙二醛主要與精氨酸的胍基NH(H2N一I一NH一)發生反應，但產物不是很穩定；此外有關研究表明在胍基反應中，精氨酸的去除率約為83%，而賴氨酸的損失在20%以上，表明胍基 反應專一性不強，因此乙二醛還能與少量賴氨酸中的s—氨基發生反應。當乙 二醛濃度為3%時，達到去除氨基的效果。如圖1所示，膠原膜在3386cm"附近有一個強而寬的吸收峰，該峰對應 於膠原蛋白中醯胺鍵中N—H鍵的伸縮振動特徵吸收峰；在1700 1300cm—1 間分別出現三個吸收峰，它們是蛋白質中的醯胺I帶1656cm"， C:O鍵伸縮 振動峰、醯胺II帶1542cm—1， N—H彎曲和C一N伸縮振動的混頻峰及醯胺 III帶1387 cm"， C一N鍵伸縮振動峰，這些是蛋白質的IR中最特徵的吸收峰。 可以看出經過醛修飾後，在3386cm"位置的峰向短波方向移動，這主要與 膠原蛋白中NH鍵及H鍵有關。當醛插入膠原三股螺旋內部後，在一定程度 上破壞了螺旋之間的氫鍵，但同時醯胺帶中的C二O和所生成的水分子又形成 了更多的氫鍵，因此峰向短波方向移動；此外，修飾後膠原中的三個醯胺帶 減弱了，這表明酸的滲入使膠原中醯胺鍵的振動受到了遏制，即修飾反應發 生在醯胺鍵的位置；但這三個峰依然存在，說明經過乙二醛修飾後的膠原均 未發生變性。此時乙二醛與戊二醛對比強度較弱，修飾率為75%。步驟3)膠原複合材料製備配置質量百分比濃度為3%的中草藥溶液，調節pH至6，將修飾後的膠原 膜浸漬在藥物溶液中，反應溫度為3(TC，浸泡9h，冷凍乾燥，得到膠原複合 材料。由圖2可以看出，膠原經過與藥物複合之後，其N — H伸縮振動峰及三個醯胺帶的峰在複合膠原的圖譜中均對應出現，而N—H峰向長波方向發生了移動，表明該複合過程在一定程度上破壞了膠原螺旋之間的氫鍵，導致其分子間作用力發生了變化，草藥分子進入了修飾膠原棉網中如圖3所示，並於膠原的分子形成物理結合，故在止血過程中會產生膠原及草藥的協同強化效果，從而進一步增強了膠原的止血性能。膠原複合材料的止血時間為57S。例4:甲醛修飾膠原中草藥複合 步驟l)膠原棉網的製備將牛二層皮製成灰皮，稱取10g，破碎。加入質量百分濃度為4%的浸灰劑 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，在室溫反應48h後，充分水洗，再用質量百分濃度 為8。/。的脫灰劑(NH4)2S04，水50ml，進行脫灰，室溫反應10h;充分水洗；絞碎； 用質量百分濃度3。；的胃蛋白酶水解72h，離心，轉速為20000rpm;用NaOH調 節pH值至7，採用質量百分濃度為4。/。的NaCl鹽析，靜置24h; 二次離心，轉速 為20000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml進行酸溶解，冷凍乾燥製成膠原棉網。步驟2)膠原修飾配製質量百分比濃度為4%的甲醛溶液，用鹽酸和氫氧化鈉調節溶液pH 值為9，將膠原棉網浸泡於甲醛溶液中，反應溫度為35。C，浸泡96h;同時配製pH二8的磷酸鈉緩衝液漂洗；置於乙醇溶液中滅菌處理；然後冷凍乾燥，得到修飾膠原棉網。.甲醛是最h簡單的單醛，其分子較小，只含有一個羰基，分子式為HCHO，化學分子式為h〉^。甲醛分子較小，在更多情況下會先與膠原蛋白中賴氨 酸的s—氨基發生反應生成亞胺中間體，然後再跟酪氨酸反應形成分子間交聯[52，從而形成穩定、堅固的網格結構。有助於增強膠原吸水性能。如圖1所示，膠原膜在3386cm'1附近有一個強而寬的吸收峰，該峰對應於膠原蛋白中醯胺 鍵中N—H鍵的伸縮振動特徵吸收峰；在170(M300cm"間分別出現三個吸收 峰，它們是蛋白質中的醯胺I帶1656crn'1， C-O鍵伸縮振動峰、醯胺II帶 1542cm'1， N—H彎曲和C一N伸縮振動的混頻峰及醯胺III帶1387 cm: C 一N鍵伸縮振動峰，這些是蛋白質的IR中最特徵的吸收峰。可以看出經過 醛修飾後，在3386cm"位置的峰向短波方向移動，這主要與膠原蛋白中NH鍵及H鍵有關此時甲醛與乙二醛對比移動較小。當醛插入膠原三股螺旋內部 後，在一定程度上破壞了螺旋之間的氫鍵，但同時醯胺帶中的C二O和所生成 的水分子又形成了更多的氫鍵，因此峰向短波方向移動；此外，修飾後膠原 中的三個醯胺帶減弱了，這表明醛的滲入使膠原中醯胺鍵的振動受到了遏制， 即修飾反應發生在醯胺鍵的位置；但這三個峰依然存在，說明經過甲醛修飾 後的膠原均未發生變性。此時甲醛與乙二醛對比強度較弱，修飾率為70%。步驟3)膠原複合材料製備配置質量百分比濃度為4%的中草藥溶液，調節pH至7，將修飾後的膠原 膜浸漬在藥物溶液中，反應溫度為3(TC，浸泡24h，冷凍乾燥，得到膠原複合 材料。由圖2可以看出，膠原經過與藥物複合之後，其N—H伸縮振動峰及三 個醯胺帶的峰在複合膠原的圖譜中均對應出現，而N—H峰向長波方向發生 了移動，表明該複合過程在一定程度上破壞了膠原螺旋之間的氫鍵，導致其 分子間作用力發生了變化，草藥分子進入了修飾膠原棉網中如圖3所示，並 於膠原的分子形成物理結合，故在止血過程中會產生膠原及草藥的協同強化 效果，從而進一步增強了膠原的止血性能。膠原複合材料的止血時間為60S。
權利要求
1、一種複合膠原止血材料的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟步驟1)膠原棉網的製備將牛二層皮製成灰皮，加入質量百分濃度為2-4％的浸灰劑Ca(OH)2，以及10倍於灰皮質量的水進行浸灰，室溫反應24-48h後，充分水洗；再用質量百分濃度為4-8％的脫灰劑NH4Cl或(NH4)2SO4，以及5倍於灰皮的水進行脫灰，室溫反應4-10h後，充分水洗；破碎；用質量百分濃度為3‰的胃蛋白酶進行酶水解48-72h；離心，轉速為10000-20000rpm；用NaOH調節pH值至7，採用質量百分濃度為4％的NaCl進行鹽析，室溫靜置24h以上；二次離心，轉速為10000-20000rpm；用0.5mol/L的醋酸，進行酸溶解，10℃以下冷凍乾燥製成膠原棉網；步驟2)膠原修飾配製溶液配製質量百分比濃度為2～4％的甲醛，乙醛和戊二醛溶液之一，用鹽酸和氫氧化鈉調節溶液pH值為7～9，同時配製pH＝8的磷酸鈉或者磷酸氫鈉緩衝液；修飾將膠原棉網浸泡於上述配製的醛溶液中，反應溫度範圍為25～35℃，浸泡時間為48～96h；漂洗用磷酸鹽溶液衝洗；置於乙醇溶液中以滅除細菌；10℃以下冷凍乾燥得到修飾膠原膜；步驟3)膠原複合材料製備配置質量百分比濃度為2～4％能將血漿中可溶纖維蛋白催化成不溶纖維蛋白的中草藥溶液，調節pH5～7，將修飾後的膠原膜浸漬在藥物溶液中，反應溫度為23～30℃，浸泡時間為6～24h，置於冷凍乾燥機中10℃以下冷凍，乾燥，得到複合膠原止血材料。
全文摘要
複合膠原止血材料的製備方法屬於醫用生物材料領域。止血時間成為止血材料優劣評價的標準，提高膠原材料止血性能仍然是主要研發重點。本發明首先用醛類對可溶性膠原進行化學修飾，製成修飾膠原棉網。由於改善了膠原的親水性，因此提高了其止血性能。另外，選擇了能將血漿中可溶纖維蛋白催化成不溶纖維蛋白的中草藥，配製成溶液；將修飾膠原的棉網在藥物溶液中充分浸漬。由於修飾膠原和草藥的分子鍵作用與擴散、滲透，使藥物分子進入到膠原三螺旋結構中，成為複合膠原止血材料。這種材料在正、異常凝血情況下均在修飾基礎上得到了明顯的提高和改善，其止血時間為45S-60S，超過目前國內醫用膠原止血材料及日本同類醫用膠原止血材料。
文檔編號A61L15/16GK101224311SQ20081005738
公開日2008年7月23日 申請日期2008年2月1日 優先權日2008年2月1日
發明者劉晶冰, 張文熊, 欣 李, 長南康正 申請人:北京工業大學