Cd146分子的檢測方法及其應用的製作方法
2023-05-21 15:50:06
專利名稱：Cd146分子的檢測方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子檢測領域，更具體地，本發明涉及血管內皮粘附分子CD146的新的檢測方法及其應用。
背景技術：
血管內皮細胞是連續被覆在全身血管內膜的一層細胞群。它不僅是血液和組織的屏障，而且具有控制血管通透性，調節組織與血液的物質交換，抑制血管壁細胞遊走等多種功能。血管內皮細胞結構與功能的變化或損傷引起多種重要疾病。血管內皮細胞也是在腫瘤、感染、自身免疫疾病、心血管疾病和移植免疫排斥反應中最早受到影響的靶細胞。血管內皮細胞的變化不僅增加血管通透性，而且改變白細胞、血小板以及腫瘤細胞的黏附和遷移。這些病理變化在炎症過程中起著重要作用。
炎症過程的一個重要特徵就是血液中單核細胞黏附於血管內皮，隨後滲出並遷移至炎症組織。在這一過程中，單核細胞與血管內皮細胞的粘附分子扮演著重要角色。
血管內皮細胞受體或黏附分子是一類表達於細胞膜表面的糖蛋白。它們大多數都是跨膜蛋白質，參與血管內皮細胞與循環細胞和血管壁基質以及平滑肌細胞的相互作用。這些粘附分子在血管內皮細胞上的動態表達(如缺失、增高、突變)不僅直接影響細胞遷移及細胞信號傳導等重要生命活動，而且與疾病的發生和發展密切相關。因此，細胞黏附分子可作為一種標誌分子用於疾病的診斷和治療。
自身免疫疾病是指機體針對自身抗原而發生免疫反應致使組織損傷而引發的疾病。在自身免疫疾病的發病過程中，免疫反應處於一種失控狀態，機體產生一些對內皮具有刺激甚至毒性的因子，破壞血管內皮細胞的整體平衡，改變血管內皮細胞與循環細胞的相互作用，導致血管損傷乃至病變。有報導表明黏附分子及其受體如選擇素、整合素、ICAM、VCAM、CD43、VMA等參與這一系列病理過程。值得關注的是這些黏附分子不但以膜蛋白的形式存在，同時還以可溶性的形式存在於人體的體液中。在一些自身免疫疾病中，可溶性黏附分子如ICAM-1、selectin、VCAM-1等的含量明顯高於正常人，其動態表達與疾病進程密切相關。儘管目前對於可溶性黏附分子表達水平升高的病理機制還不清楚，但通常認為這是血管損傷及功能障礙的標誌，並在一定程度上反應了疾病進程。通過檢測這些可溶性黏附分子的含量對於診斷伴有血管損傷的疾病尤其是自身免疫疾病具有重要的臨床意義。
CD146是一個新的血管內皮黏附分子，又名MUC18、Me1-CAM，屬於免疫球蛋白基因超家族成員。除了在少數正常組織和某些惡性腫瘤細胞上有表達外，CD146主要表達於血管內皮細胞，尤其是在增生活躍的腫瘤血管上高表達。由於CD146分子在血管上的這種動態表達特性，使它在血管內皮病變的研究中倍受關注。目前，CD146已經被認為是血管內皮細胞和循環內皮細胞的標誌分子(Blann，Woywodt et al.2005)，因而在伴有內皮損傷、脫落現象的某些疾病中可作為疾病進程的參考指標。另有研究表明CD146分子還表達於單核細胞，有報導在激活的T淋巴細胞上也有高表達。像其它很多黏附分子一樣，體內CD146分子以細胞膜和可溶形式(soluble CD146，sCD146)存在。(Neidhart，Wehrli et al.1999；Bardin，Moal et al.2003)分別報導sCD146在風溼性關節炎滑液以及慢性腎衰竭患者的血清中的表達水平明顯高於正常人。
目前用於檢測sCD146的方法為雙抗夾心ELISA。雖然用這種方法能夠檢測到sCD146的存在，但在應用時存在較多的局限性。例如，該方法繁瑣，靈敏度較低，最低檢測量為10ng/ml，僅限於血液檢測，不能用於腦脊髓液等樣品的檢測。因此，發展新的檢測技術，是研究和應用sCD146分子作為自身免疫疾病標誌分子的關鍵。
發明內容
針對上述研究背景，本發明的一個目的是提供一種檢測CD146分子的方法，其特徵在於將抗CD146抗體固定在矽晶片上，將待測樣品流過CD146抗體晶片表面，樣品中可溶性CD146分子與晶片上的特異抗體反應信號通過光學橢偏光顯微成像檢測系統，分析樣品中CD146的含量。
在一個實施方案中，所述樣品是來自自身免疫疾病患者的血液、尿液、腦脊液或關節腔滑液。所述自身免疫疾病包括系統性血管炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症以及格林巴利綜合症。優選所述抗CD146抗體為小鼠抗人CD146單克隆抗體AA98。
本發明還有一個目的是提供一種檢測CD146分子的方法，其特徵在於用流式細胞技術檢測CD146在人受試者外周血白細胞膜上的動態表達。更具體地，所述流式細胞技術檢測包括採用微量全血間標法用抗CD146抗體標記外周血白細胞，通過流式細胞儀區分外周血白細胞的三個細胞亞群即中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞，分別圈門分析CD146分子在三種細胞中表達情況。在一個實施方案中，所述人受試者是自身免疫疾病患者。所述自身免疫疾病患者包括系統性血管炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症以及格林巴利綜合症患者。
本發明另一方面涉及CD146分子在製備診斷自身免疫疾病的試劑盒中的應用。所述自身免疫疾病包括系統性血管炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症以及格林巴利綜合症。
以下詳細描述本發明。
1.蛋白質光學晶片檢測sCD146的臨床應用本發明主要是克服現有方法的局限性，提高sCD146檢測系統的靈敏度和方便性，縮短檢測時間而發展的無標記檢測體液sCD146的新技術。這一檢測系統是基於先進的光學橢偏光顯微成像技術的蛋白質光學晶片，解決了sCD146檢測靈敏度的問題。光學橢偏光成像技術是近年來發展起來的一種基於單分子膜層的無標記檢測技術，它將傳統的光學橢偏技術、CCD攝像、計算機採集和圖像處理技術理想的結合在一起。通過分析蛋白晶片上樣品橢偏圖像的灰度值來確定其濃度。本發明將這一靈敏的技術應用到sCD146的檢測，從而彌補目前商用試劑盒的不足。建立一種敏感適用、易於操作針對自身免疫性疾病的新的診斷方法。
本發明與傳統的ELISA方法相比較，其優越性在於(1)靈敏度高，本方法直接檢測結合在抗體上的目標蛋白，沒有任何中間步驟，分析軟體可以分析到痕量樣品的灰度值，使得檢測的靈敏度很高。並且可以排除非特異性幹擾，重複性好。由於該檢測方法是基於樣品的物理學特性來檢測，檢測結果主要與相互作用的兩個分子的結合動力學常數有關，所以可以排除其他幹擾，使得結果重複性更好；(2)樣品用量少，樣品用量僅在10微升以上即可滿足檢測；(3)樣品無需任何標記物，因此不存在二抗交差的問題更不會因為顯色過程所帶來的問題而對結果的判斷產生影響；(4)檢測速度快，包被抗體後只需一步反應(抗原與抗體反應)就可以觀察結果。由於檢測薄膜厚度所以會受待檢測分子分子量的限制，如分子量很小或者過大就不適合應用本方法。本發明中所涉及的sCD146分子量在100KDa左右，正是適合光學橢偏顯微成像技術檢測的範圍。
2.流式細胞技術檢測CD146的臨床應用本發明首次發現自身免疫疾病患者外周血白細胞膜表面CD146分子的動態表達與疾病活動期和緩解期相關。因此，檢測CD146分子的表達情況，能夠為自身免疫疾的診斷及預後評價提供新的信息和指標。本發明採用微量全血間標法檢測外周血白細胞CD146表達。流式細胞技術是一種自動分析細胞並具有分選功能的高新技術，具有高速度、高靈敏度、高精度及高解析度、分選純度高和收穫率高及多參數同時分析等特點，已經被廣泛地應用於臨床診斷中。本發明採用的微量全血間標法，充分利用了流式細胞儀的優點，同時樣品用量少(僅需抗凝的全血200μl左右)，在進行其他檢測的血液中取一點即可，避免了患者檢查中的多次抽血。
本發明涉及上述兩種檢測CD146的新方法，其意義在於(1)首次發現sCD146在自身免疫疾病臨床診斷和預後中的意義。例如系統性血管炎患者在治療前後體液中sCD146的表達水平有明顯的變化；(2)利用了先進的無標記蛋白質光學晶片檢測sCD146，檢測的靈敏度達到0.1ng/ml水平，比現有檢測手段提高100倍，可以檢測到用現有方法無法檢測的樣本如腦脊液，擴大了sCD146的檢測範圍。另外，本方法是無標記檢測技術簡便易行，在臨床診斷中有很大的應用潛力。(3)本發明首次發現了CD146分子在系統性血管炎患者的外周血白細胞膜表面的表達。該研究結果首次在國際上發現CD146在系統性血管炎等自身免疫性疾病患者外周血白細胞中激活，並且與活動期相關，隨治療過程表達下調，而血漿中sCD146的水平升高，可作為臨床診斷的新指標，並為進一步研究風溼性疾病發病機制提供了新的方向。
下面結合附圖對理解本發明作進一步的詳細描述，但並非對本發明作限定。
圖1.24通道CD146蛋白質光學晶片，圖中箭頭所指為sCD146濃度(ng/ml)，橫向(從左至右)相鄰兩通道為同一濃度兩次重複，其中包括兩個未包被抗體、未加樣品的空白通道(圖中黑色的通道)；圖2.sCD146標準曲線，A.sCD146濃度範圍0.13～83.2ng/ml；B.sCD146濃度範圍0.13～7.0ng/ml；圖3.流式細胞儀分析病人外周血白細胞細胞群，通過前向散射光(FSC-Height)和側向散射光(Side Scatter)把病人外周血白細胞分為3個細胞群體，其中R1為中性粒細胞；R2為單核細胞；R3為淋巴細胞；圖4.CD146在患者白細胞上動態表達，不同血管炎患者中性粒細胞以及淋巴細胞表達CD146；圖5.比較分析病人活動期和延緩期外周血白細胞CD146的表達。A.中性粒細胞活動期及緩解期CD146的表達；B.淋巴細胞在活動期及緩解期CD146的表達。橫坐標1活動期；2緩解期；圖6.標準曲線。標準品倍比稀釋，分別為800、400、200、100ng/ml，以樣品稀釋液取標準品作為0ng/ml。經計算R2＝0.9987，線性回歸非常好；圖7.系統性血管炎患者血清中sCD146水平。與健康對照相比僅MPA具有顯著性差異(P＜0.01)；圖8.治療前後sCD146水平變化。與治療前相比，12例患者中的10例在治療後sCD146水平明顯升高了。通過配對t檢驗統計分析，治療前後sCD146含量在0.05水平上有顯著性差異。
具體實施例方式
下面結合附圖對理解本發明作進一步的詳細描述，但並非對本發明作限定。
本發明所用的主要試劑及儀器如表1所示。
表1.主要試劑及儀器
實施例1無標記檢測技術光學橢偏光成像系統檢測sCD146鑑於商用試劑盒檢測sCD146最低值為10ng/ml，不能用於如腦脊髓液、關節炎滑液等樣品中sCD146的檢測。因此，我們採用蛋白質光學晶片來解決這個問題。其特徵在於，將純化的抗CD146單克隆抗體AA98(見中國發明專利申請「高效廣譜抑制腫瘤生長和轉移的新型抗體」，專利號99107586.2；及參考文獻(Yan，Lin et al.Blood，2003))固定在活化的矽晶片上(24通道)，將待測樣品流過固定有抗體的晶片表面，使抗原抗體充分反應，抗原抗體的特異性反應信號通過橢偏光系統檢測，利用軟體分析拍攝圖片的灰度，並與標準樣品對比確定待測樣品中sCD146的含量。
1.樣品來源及臨床資料被檢測樣品來自安貞醫院神經內科，已經明確診斷為多發硬化、格林巴利綜合症患者的腦脊髓液。
2.具體步驟1)矽片活化處理矽片(約7×34mm大小)，先用弱鹼混合液(H2O∶30％H2O2∶25％NH4OH＝5∶1∶1(V/V))在80℃下清洗5分鐘，除去表面有機汙染物以及離子型汙染物，同時提高表面矽醇基量，使矽片表面親水，得到親水性基底。再用矽烷溶液二氯二甲基矽烷∶C2HCl3＝1∶4在室溫下浸泡5分鐘後，無水乙醇和三氯乙烯清洗矽片2～3次。最後通過二氯二甲基矽烷與表面的矽醇基反應，將-Si(CH3)2基團共價結合到二氧化矽膜上，甲基末端暴露在外並形成緊密的一層，從而使矽片表面呈強疏水性。
2)包被抗體純化的抗體AA98以250ug/ml濃度，每個通道50ul包被活化的矽晶片，室溫孵育45分鐘，在矽晶片表面形成一層單分子膜層。每個晶片24通道。
3)PBST(PBS加0.05％Tween20)洗三次4)封閉非特異結合位點加入50ul1％BSA/PBS封閉非特異性結合位點，室溫孵育45分鐘。
5)樣品孵育將已知sCD146濃度的血清樣品梯度稀釋用來繪製標準曲線，稀釋後的濃度分別為0.13、0.64、1.3、2.6、5.2、10.4、20.8、41.6、83.2ng/ml。待測腦脊液稀釋20倍，上樣量50μl，PBS取代樣品作為陰性對照。每個樣品設兩次重複。
6)PBST洗去非特異性結合，三次重複。蒸餾水衝洗後用氮氣吹乾以備觀察。
7)橢偏光學顯微鏡成像系統觀察。
8)軟體統計結果軟體分析灰度值，根據稀釋標準血清中sCD146濃度繪製標準曲線。
9)根據標準曲線計算出待測樣品的濃度。
3.結果分析1)利用蛋白質光學晶片可以檢測sCD146，結合圖像如圖1所示。從圖上可以看出不同濃度sCD146通道的灰度差異肉眼可見。
2)利用已知sCD146濃度的血清製作標準曲線。稀釋後sCD146的濃度0.13～83.2ng/ml，繪製標準曲線如圖2.A.所示。經計算得出該方法檢測範圍在0.1～2.5ng/ml內符合線性，2.5ng/ml接近飽和。取sCD146濃度範圍0.13～7.0ng/ml作圖所得到的標準曲線(R2＝0.9965)，如圖2.B.所示。
3)分析格淋巴利綜合症、多發硬化症患者腦脊髓液中sCD146含量。處於活動期患者腦際髓液中sCD146含量在十幾納克左右，在多發硬化患者中最高達到24ng/m，。處於緩解期患者僅0.2ng/ml，詳細數據如表2所示表2.患者腦脊髓液sCD146含量
注GBS格林巴利綜合症；MS多發硬化症；CSF腦脊髓液實施例2檢測病人外周血白細胞膜CD146表達的臨床意義1.樣品來源及臨床資料所有患者均為臨床資料完整的2004年4月至2005年4月北京協和醫院內科住院患者。其中系統性血管炎共58例，男性31例，女性27例；系統性紅斑狼瘡(SLE)患者15例。大動脈炎(TA)11例，韋格納肉芽腫(WG)16例，顯微鏡下多血管炎(MPA)19例，變應性肉芽腫性血管(CSS)炎6例。TA、PAN、WG、MPA、CSS患者均符合1990年美國風溼病學會(ACR)系統性血管炎的分類標準；系統性紅斑狼瘡符合1982年ACR的分類標準。所有患者在明確診斷或入院時採血樣，活動期的患者在治療2-4周後再次採血。18例患者(SLE4例，BD2例，TA2例，WG5例，PAN2例，MPA6例，CSS 2例)在明確診斷且為活動期時及治療好轉後兩個時間點分別進行了檢測。同時20名健康志願者採血作為對照。
2.具體實施步驟外周血白細胞CD146的表達採用微量全血間標法，樣本的處理步驟如下1)取肝素抗凝全血200ul，加入AA98mAb(雜交瘤培養上清)，陰性對照組加入鼠IgG無關抗體，置冰浴40min。
2)以含0.5％BSA的PBS 2ml洗滌3次，1500rpm離心3min，棄上清3)加入羊抗鼠二抗-FITC(PBS 1∶500稀釋)，置冰上孵育30min，避光4)加入2ml紅細胞裂解液，溫和振搖2min，避光5min，離心5min(1000rpm/min)5)以含0.5％BSA的PBS洗2次，1500rpm離心5min，棄上清6)每管加0.5ml不含BSA的PBS或1％多聚甲醛重懸細胞，置4℃冰箱避光待測7)上機前用＞100目的尼龍網過濾8)上機檢測。每個樣本收集104個細胞，採用前向角(ForwordScatter，FSC)和側向角(Side Scatter，SSc)對細胞群的大小、顆粒等物理形態進行選擇分析。正常人的外周血白細胞大致分為中性粒細胞(PMN)、單核細胞(Mono)和淋巴細胞(LYM)共3群細胞。然後分別以三群細胞設門，根據側向角檢測FITC的螢光強度。以陽性細胞的百分率作為檢測結果。
3.結果分析通過流式細胞以將外周血白細胞清晰地分為三個群體，中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞，如圖3所示。本研究主要對中性粒細胞和淋巴細胞進行分析，單核細胞CD146的變化趨勢與中性粒細胞和淋巴細胞一致。
分析患者活動期和緩解期白細胞表面CD146動態表達。不同類型的血管炎患者，同一個患者所處不同的疾病期，其外周血白細胞表面CD146的表達量都有很大的差異。圖4所示為選取其中三個患者，分析CD146分子在中性粒細胞及淋巴細胞上的動態表達。從中可以看出不同類型的患者CD146表達差異很大，大血管炎TA患者表達量與健康對照相比沒有顯著性差異低於10％；較之健康人小血管炎差異顯著(WGP＜0.00；MPAP＜0.05；CSSP＜0.05；SLEP＜0.01)，表達量均在20％以上。分析總結見表3。活動期與緩解期的淋巴細胞CD146的陽性率為16.7±3.6％，治療後為3.0±0.7％(P＝0.003)；二者的比較見圖5。
從這些結果不難看出CD146在外周血白細胞上的表達與疾病所處的階段有很好的相關性，隨著治療的作用，病人的狀況也得到緩解，CD146的表達也隨之下降。
表3.流式細胞術檢測系統性血管炎外周血白細胞CD146的動態表達
注TA大動脈炎；WG韋格納肉芽腫；MPA顯微鏡下多血管炎；CSS變應性肉芽腫性血管炎；SLE系統性紅斑狼瘡。與正常對照相比，活動期CD146的表達有顯著性差異，而治療後處於緩解期這種顯著性差異消失了。
實施例3ELISA檢測sCD146在自身免疫疾病患者血清中的含量
1.樣品來源及臨床資料所有患者共計67例均為臨床資料完整的2004年4月至2005年4月北京協和醫院內科住院患者。患者診斷均符合1990年美國風溼病學會(ACR)系統性血管炎的分類標準。系統性紅斑狼瘡(SLE)患者符合1982年ACR的分類標準。患者具體情況見表3。12其中包括2例BD，4例CSS，4例MPA，1例SLE，1例WG。例患者在明確診斷且為活動期時及治療好轉後兩個時間點分別進行了檢測。
2.具體實施步驟1)血清的採集早晨空腹抽取血液2ml，凝集30分鐘左右後離心，2000rpm×5分鐘後收取血清，分裝後凍存於-70℃冰箱備用。
2)sCD146的檢測採用夾心ELISA方法分別檢測血漿sCD146水平，操作步驟按照試劑盒說明書要求實施。檢測的敏感性分別是10ng/ml。數據於全自動酶標儀上測量吸光值(單波長，492nm)。每份樣品做復孔。
3)根據標準品梯度製作出標準曲線，並根據計算公式計算出每個樣品中sCD146的含量。
表4.系統性血管炎患者的一般情況
注健康Y平均年齡在33±9的正常人；健康O平均年齡在59±11的正常人。M女性；F男性。
3.結果分析1)標準曲線R2＝0.9987具有很好的線性回歸。
2)相對於正常人僅MPA患者sCD146水平有顯著性差異(P＜0.01)，與MPA中性粒細胞上CD146表達趨勢相吻合。
3)另外在12例治療組中10名患者sCD146水平再經過治療後水平都上升了，經配對t檢驗統計分析顯示在0.05水平上，相對於治療前具有顯著性差異。這與實施例二中治療後外周血白細胞上的表達下降恰好相反。
參考文獻Bardin，N.，V.Moal，et al.(2003).″Soluble CD 146，a novel endothelialmarker，is increased in physiopathological settings linked to endothelialjunctional alteration.″Thromb Haemost90(5)915-20.
Blann，A.D.，A.Woywodt，et al.(2005).″Circulating endothelial cells.Biomarker of vascular disease.″Thromb Haemost93(2)228-35.
Neidhart，M.，R.Wehrli，et al.(1999).″Synovial fluid CD146(MUC18)，amarker for synovial membrane angiogenesis in rheumatoid arthritis.″ArthritisRheum42(4)622-30.
Yan，X.，Y.Lin，et al.(2003).″A novel anti-CD146 monoclonal antibody，AA98，inhibits angiogenesis and tumor growth.″Blood102(1)184-91.
權利要求
1.一種檢測可溶性CD146分子的方法，其特徵在於將抗CD146抗體固定在矽晶片上，將待測樣品流過CD146抗體晶片表面，樣品中可溶性CD146分子與晶片上的特異抗體反應信號通過光學橢偏光顯微成像檢測系統，分析樣品中CD146的含量。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品是來自自身免疫疾病患者的血液、尿液、腦脊液或關節腔滑液。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述自身免疫疾病包括系統性血管炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症以及格林巴利綜合症。
4.根據權利要求1-3中任何一項所述的方法，其中所述抗CD146抗體為小鼠抗人CD146單克隆抗體AA98。
5.一種檢測CD146分子的方法，其特徵在於用流式細胞技術檢測CD146在人受試者外周血白細胞膜上的動態表達。
6.根據權利要求5的方法，其中所述流式細胞技術檢測包括採用微量全血間標法用抗CD146抗體標記外周血白細胞，通過流式細胞儀區分外周血白細胞的三個細胞亞群即中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞，分別圈門分析CD146分子在三種細胞中表達情況。
7.根據權利要求5或6的方法，其中所述受試者是自身免疫疾病患者。
8.根據權利要求7的方法，其中所述自身免疫疾病患者包括系統性血管炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症以及格林巴利綜合症患者。
9.CD146分子在製備診斷自身免疫疾病的試劑盒中的應用。
10.根據權利要求9的應用，其中所述自身免疫疾病包括系統性血管炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症以及格林巴利綜合症。
全文摘要
本發明提供了一個新的自身免疫疾病相關靶分子CD146，建立了新的自身免疫疾病臨床診斷方法，包括(1)利用蛋白質晶片和光學橢偏光顯微成像技術製備CD146抗體光學晶片來檢測病人體液中的CD146含量是一種靈敏、快速的無標記檢測方法；(2)流式細胞技術檢測病人外周血白細胞膜上CD146的表達情況。上述發明可應用於系統性血管炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症以及格林巴利綜合症等自身免疫性疾病的診斷、判斷疾病進程以及預後評價。
文檔編號G01N33/577GK1916632SQ20051009063
公開日2007年2月21日 申請日期2005年8月18日 優先權日2005年8月18日
發明者閻錫蘊, 張佰茹, 張瑩, 勒剛 申請人:中國科學院生物物理研究所