水蛭酶解丙酮粉腸溶劑及其製備方法與應用的製作方法

2023-05-21 12:41:51 1

專利名稱：：水蛭酶解丙酮粉腸溶劑及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種水蛭酶解丙酮粉腸溶劑及其製備方法與應用。
背景技術：
：中風(apoplexy),是以突然暈倒、不省人事，伴口角歪斜、語言不利、半身不遂，或不經昏僕僅以口歪、半身不遂為臨床主症的疾病。因發病急驟，症見多端，病情變化迅速，與風之善行數變特點相似，故名中風、卒中。本病發病率和死亡率較高，常留有後遺症；近年來發病率不斷增高，發病年齡也趨向年輕化，因此，是威脅人類生命和生活質量的重大疾患。現代研究表明，我國中風死亡率已躍居世界第2位，並且還有上升趨勢。中風治療費用高，治癒率低，對個人、家庭及社會危害極大。因此預防中風發生比治療中風意義更大。這正如仲景之所言"上工不治已病治未病。"水蛭(Leech)是一味藥性平和，祛瘀力強而不傷正的活血化瘀藥，具有多種活性成分。水蛭始載於《神農本草經》"主逐惡血，瘀血，月閉，破血瘕積聚，無子，利水道。"《本草綱目》"鹹走血，苦勝血。水蛭之鹹苦，以除蓄血，乃肝經血分藥，故能通肝經聚血。"現代臨床上用單味水蛭或配伍複方，使用煎劑、散劑、膠囊劑等劑型，通過內服給藥治療心腦血管疾病療效顯著。但傳統的炮製提取、製備工藝方法，使得部分成分分解或無法提取出來，造成有效成分損失、藥效波動，亟待研發穩定且活性高的水蛭製劑以滿足現代醫療需求。
發明內容針對上述現有技術，本發明提供了一種水蛭酶解丙酮粉腸溶劑，其穩定性好，活性高，水蛭的有效成分損失少，最大程度地保留住了水蛭的藥用價值。本發明還提供了其製備方法，並公開了其在製備治療/預防中風的藥物中的應用。本發明是通過以下技術方案實現的—種水蛭酶解丙酮粉腸溶劑，是以水蛭乾燥全體或鮮活水蛭為原料，通過以下製備方法得到的1)取水蛭乾燥全體粉碎成20-150目粉末，加入6-16倍重量的水，勻漿；或者取水蛭鮮活全體，加入l-6倍重量的水，勻漿；2)取上述勻漿液，調節pH至7-9，按每lg水蛭幹藥材加入2000-20000U酶的比例加入胰蛋白酶或以胰蛋白酶為主要成分的複合酶，控制溫度40-6(TC，酶解2-12小時；3)酶解完後，冷卻酶解液至室溫，向酶解液中加入l-5倍體積的丙酮，冷藏沉澱4-12小時，過濾，濾液減壓乾燥，得水蛭酶解丙酮粉；4)向上述水蛭酶解丙酮粉中添加藥用輔料，製備成腸溶製劑。所述腸溶製劑為腸溶片劑、腸溶膠囊劑、腸溶滴丸劑中的任一種。所述步驟(3)中丙酮用乙醇、甲醇或乙酸乙酯等有機溶劑替代。所述步驟(4)具體為將水蛭酶解丙酮粉與藥用輔料製備成顆粒或片劑後，再使用腸溶材料進行包衣，得到腸溶製劑。所述的水蛭酶解丙酮粉腸溶劑可以用來製備治療/預防中風的藥物。本發明的發明人在近年來國內外學者對水蛭化學、藥理和臨床研究的基礎上，通過提取、分離和純化得到較高純度抗凝血水蛭肽(AHT)，並對其體外抗自由基氧化作用，體內腦缺血藥理藥效作用進行了初步研究，並申請了發明專利一種水蛭提取物及其製備方法與應用(專利申請號200810138936.5)。但在後期研究過程中，發現該水蛭提取物活性治療活性隨純度的提高反而降低，且經胃蛋白酶處理後活性也顯著降低。因此便用胰蛋白酶處理，製得水蛭酶解丙酮粉腸溶劑，通過實驗研究表明，水蛭酶解丙酮粉在預防中風作用最高。具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明實施例1:水蛭酶解丙酮粉的製備取水蛭乾燥全體粉碎成80目粉末，加入10倍重量的水，勻漿；取勻漿液，調節pH至8.2，按每lg水蛭幹藥材加入8000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制溫度5(TC，酶解5小時，冷卻至室溫；酶解完後，向上述酶解液中加入4倍體積的丙酮冷藏沉澱6小時，過濾，濾液減壓乾燥，得水蛭酶解丙酮粉。實施例2:水蛭酶解丙酮粉腸溶膠囊的製備取水蛭酶解丙酮粉、澱粉、糊精混合均勻後，加入適量濃度乙醇，製作軟材，18目篩制粒，4(TC乾燥，16目篩整粒，加入硬脂酸鎂混合均勻後，裝入腸溶膠囊即得水蛭酶解丙酮粉腸溶膠囊。實施例3:水蛭酶解丙酮粉腸溶片劑的製備取水蛭酶解丙酮粉100g，與10g澱粉混合均勻後，採用5%澱粉漿製作軟材，18目篩制粒，4(TC乾燥，16目篩整粒，加入羥甲基澱粉鈉混合均勻後，壓片。將聚醋酸乙烯苯二甲酸酯、鄰苯二甲酸二乙酯、滑石粉加入到適量丙酮/乙醇混合液中，密閉，攪拌2小時，然後對上述片劑進行包衣，包衣完成後，於4(TC乾燥2小時，得水蛭酶解丙酮粉腸溶片劑。實驗1:水蛭酶解丙酮粉腸溶膠囊預防中風的實驗1.1藥物與試劑受試藥依據本發明提供的方法製備的水蛭酶解丙酮粉陽性對照藥血塞通注射液，規格100mg:2ml，黑龍江珍寶島製藥有限公司，批號:20080702;試劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，水合氯醛，多聚甲醛，肝素，均為sigma進口分裝；蛋白定量(考馬斯亮蘭法)試劑盒，MDA試劑盒；SOD試劑盒；GSH試劑；ATPase(Na-K-ATPase;Na+-Mg2+-ATPase)酶試劑盒，NO試劑盒；LDH試劑以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；批號均為20090502;HE染色試劑盒，碧雲天生產。1.2動物Wistar大鼠180隻，雌雄各半，體重250-280g，由山東大學實驗動物中心提供，合格證編號SCXK(魯)-2003004。1.3實驗方法1.3.1動物分組取Wistar大鼠60隻，隨機分為6組，假手術組，模型組、血塞通20mgig-1組、水蛭酶解丙酮粉16mg'kg—\8mg'kg—\4mgkg—1組，每組10隻，雌雄各半。1.3.2動物造模和給藥實驗第l至10d，除假手術組外其餘5組大鼠採用飢餓、疲勞、寒溼、驚慌憂恐、高脂飲食等複合造模方法製作氣虛血瘀證大鼠中風模型；實驗第lld，除假手術組外其餘5組大鼠採用雙側頸總動脈結紮法製作急性不全性腦缺血模型，其中假手術組僅分離雙側頸總動脈並縫合傷口但不進行結紮；除假手術組外其餘5組大鼠分離雙側頸總動脈後用微型無損動脈夾夾閉雙側頸總動脈，3h後鬆開動脈夾使其動脈恢復血流，然後縫合傷口消毒。其中預防治療組於造模每日9:00予血塞通或者水蛭酶解丙酮粉腹腔注射給藥，頸部手術後不再給藥。1.3.3腦組織勻漿液製備大鼠再灌注24h，斷頭處死，立即於冰浴上取出大腦皮層，稱取0.5g前腦組織，置於4.5ml預冷為4t:的生理鹽水中充分勻槳，4t:3000rpm離心10min，上清即為10%腦組織勻漿液，上清液以考馬斯亮藍法測定蛋白含量，分裝後按照下表條件貯存待測。1.3.4超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基，後者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現紫紅色，用可見分光光度計測其吸光度。當被測樣品中含有SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低於對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力。1.3.5丙二醛(MDA)含量的測定過氧化脂質降解產物中的MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產物，在532nm處有最大吸收峰，通過公式可計算出MDA含量。1.3.6乳酸脫氫酶(LDH)含量的測定LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2，4-二硝基苯肼反應生成丙酮酸二硝基苯腙，在鹼性溶液中呈棕紅色，440nm測其吸光度即可計算出LDH含量。I.3.7穀胱甘肽-過氧化物酶(GSH)活力的測定GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸陰離子呈現穩定的黃色，412nm測其吸光度即可計算出GSH含量。1.3.8—氧化氮(NO)含量的測定5NO在體內代謝很快轉化為N02—和N03—，而N02-進一步轉化為N03—，利用硝酸還原酶特異性將NO3—還原為NO2—，通過顯色在550nm處光吸收值測定其濃度。1.4實驗結果1.4.1水蛭酶解丙酮粉對氣虛血瘀證大鼠中風模型大鼠腦組織SOD的影響如表1所示，與假手術組比較，模型組的SOD含量明顯降低，差異有統計學意義(P〈0.01)，腦缺血再灌注後腦組織SOD含量顯著降低。與模型組比較，水蛭酶解丙酮粉各劑量組腦組織勻漿液SOD含量均有所升高，其中中、高劑量組的含量有顯著性差異(P<0.05和0.01)，呈劑量依賴性拮抗SOD降低。表1水蛭酶解丙酮粉對氣虛血瘀證大鼠中風模型大鼠腦組織SOD活性的影響tableseeoriginaldocumentpage6與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。與假手術組比較，AAP〈0.011.4.2水蛭酶解丙酮粉對氣虛血瘀證大鼠中風模型大鼠腦組織MDA的影響結果如表2所示，模型組MDA含量顯著高於假手術組(P〈0.01)，表明缺血再灌注後腦組織脂質過氧化反應強烈，伴有腦組織自由基聚集以及抗氧化酶活性的降低，水蛭酶解丙酮粉中、高劑量組能明顯降低MDA含量，與模型組相比差異有顯著性(P〈0.05禾口0.01)。表2水蛭酶解丙酮粉對氣虛血瘀證大鼠中風模型大鼠腦組織MDA含量影響tableseeoriginaldocumentpage6與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。與假手術組比較，AAP〈0.011.4.3水蛭酶解丙酮粉對氣虛血瘀證大鼠中風模型大鼠腦組織LDH的影響結果如表3所示，模型組LDH含量顯著高於假手術組(P〈0.01)，表明缺血再灌注後腦組織細胞受損傷程度嚴重，水蛭酶解丙酮粉低、中、高劑量組能明顯降低LDH含量，與模型組相比差異有顯著性(P<0.05和0.01)。表3水蛭酶解丙酮粉對氣虛血瘀證大鼠中風模型大鼠腦組織LDH含量影響組別LDH(U/mg,t)假手術組2509.23±204,22模型組5710,26土521,85厶A血塞通組204941.19±39§.l*水蛭鷗解丙酮粉45291,09±367.73*水蛭酶解丙酮粉84881,08土371,11*水蛭酶解丙觀粉164250.96±361,54**與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。與假手術組比較，AAP〈0.011.4.4水蛭酶解丙酮粉對氣虛血瘀證大鼠中風模型大鼠腦組織GSH的影響結果如表4所示，模型組的GSH活性顯著下降，與假手術組有顯著差異(P<0.01)，表明缺血再灌注後腦組織GSH活性受到很大影響，水蛭酶解丙酮粉高劑量組能明顯升高腦組織中GSH含量，與模型組相比差差異有顯著性(P<0.05);表4水蛭酶解丙酮粉對氣虛血瘀證大鼠中風模型大鼠腦組織GSH含量影響組別細GSH(mg/gprot)假手術組j^T開U'r乂na:血塞通組水蛭n解丙醒粉水蛭,解丙,粉水蛭酶解丙麗粉20481663.37土3.8347.16士5.93厶厶4S.47土4.6657,25土5.9.760.10±4.8^與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。與假手術組比較，AAP〈0.011.4.5水蛭酶解丙酮粉對氣虛血瘀證大鼠中風模型大鼠腦組織NO的影響結果如表5所示，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織一氧化氮含量顯著升高(P<0.01);與模型組相比，水蛭酶解丙酮粉三個劑量組及陽性藥血塞通均可顯著降低腦組織一氧化氮。表5水蛭酶解丙酮粉對氣虛血瘀證大鼠中風模型大鼠腦組織NO含量影響tableseeoriginaldocumentpage8與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。與假手術組比較，AAP〈0.01以上研究結果表明，模型組腦組織MDA，LDH含量較假手術組明顯增高，SOD顯著下降，一氧化氮含量升高，水蛭酶解丙酮粉各劑量組對氣虛血瘀證大鼠中風模型具有較好的預防作用。權利要求一種水蛭酶解丙酮粉腸溶劑，其特徵在於，是以水蛭乾燥全體或鮮活水蛭為原料，通過以下製備方法得到的1)取水蛭乾燥全體粉碎成20-150目粉末，加入6-16倍重量的水，勻漿；或者取水蛭鮮活全體，加入1-6倍重量的水，勻漿；2)取上述勻漿液，調節pH至7-9，按每1g水蛭幹藥材加入2000-20000U酶的比例加入胰蛋白酶或以胰蛋白酶為主要成分的複合酶，控制溫度40-60℃，酶解2-12小時；3)酶解完後，冷卻酶解液至室溫，向酶解液中加入1-5倍體積的丙酮，冷藏沉澱4-12小時，過濾，濾液減壓乾燥，得水蛭酶解丙酮粉；4)向上述水蛭酶解丙酮粉中添加藥用輔料，製備成腸溶製劑。2.根據權利要求1所述的一種水蛭酶解丙酮粉腸溶劑，其特徵在於所述腸溶製劑為腸溶片劑、腸溶膠囊劑、腸溶滴丸劑中的任一種。3.—種權利要求1所述的水蛭酶解丙酮粉腸溶劑的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟1)取水蛭乾燥全體粉碎成20-150目粉末，加入6-16倍重量的水，勻漿；或者取水蛭鮮活全體，加入l-6倍重量的水，勻漿；2)取上述勻漿液，調節pH至7-9，按每lg水蛭幹藥材加入2000-20000U酶的比例加入胰蛋白酶或以胰蛋白酶為主要成分的複合酶，控制溫度40-6(TC，酶解2-12小時；3)酶解完後，冷卻酶解液至室溫，向酶解液中加入l-5倍體積的丙酮，冷藏沉澱4-12小時，過濾，濾液減壓乾燥，得水蛭酶解丙酮粉；4)向上述水蛭酶解丙酮粉中添加藥用輔料，製備成腸溶製劑。4.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於所述步驟(3)中丙酮用乙醇、甲醇或乙酸乙酯替代。5.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於所述步驟(4)具體為將水蛭酶解丙酮粉與藥用輔料製備成顆粒或片劑後，再使用腸溶材料進行包衣，得到腸溶製劑。6.權利要求1所述的水蛭酶解丙酮粉腸溶劑在製備治療/預防中風的藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種水蛭酶解丙酮粉腸溶劑，是以水蛭乾燥全體或鮮活水蛭為原料，通過以下製備方法得到的1)取水蛭，勻漿；2)取勻漿液，調節pH至7-9，按每1g水蛭幹藥材加入2000-20000U酶的比例加入胰蛋白酶或以胰蛋白酶為主要成分的複合酶，控制溫度40-60℃，酶解2-12小時；3)酶解完後，冷卻酶解液至室溫，向酶解液中加入1-5倍體積的丙酮，冷藏沉澱4-12小時，過濾，濾液減壓乾燥，得水蛭酶解丙酮粉；4)向上述水蛭酶解丙酮粉中添加藥用輔料，製備成腸溶製劑。本發明的水蛭酶解丙酮粉腸溶劑可以作為治療/預防中風的藥物應用。文檔編號A61P9/10GK101690733SQ200910018600公開日2010年4月7日申請日期2009年10月10日優先權日2009年10月10日發明者吉愛國,宋淑亮,梁浩,王允山申請人:山東大學威海分校