目標核酸序列的擴增方法和用於該方法的探針的製作方法

2023-05-22 01:36:41 4

專利名稱：目標核酸序列的擴增方法和用於該方法的探針的製作方法
技術領域：
本發明涉及在糹果針存在下擴增目標核酸序列的方法和用於 該方法的探針。而且，本發明還涉及在糹果針存在下擴增目標核 酸序列的幹擾的抑制方法、以及目標核酸序列的分析方法。
背景技術：
近年來，作為檢測基因的多態性和突變的方法，分析由目
標核酸序列與檢測用探針所形成的雙鏈核酸的熔解溫度(Tm: melting temperature )的方法得到實用化。這種方法由於通過例 如前述雙鏈的熔解曲線的分析而進行，因此#L稱為熔解曲線分 析或Tm分析。Tm —般按以下方式定義。當加熱含有雙鏈DNA 等雙鏈核酸的溶液時，260nm處的吸光度上升。這是因為，雙 鏈核酸中兩條鏈間的氫4建由於加熱而解開，解離成單《連核酸(核 酸的熔解)。而且，當所有的雙鏈核酸解離而形成單《連核酸時， 其吸光度呈現出加熱開始時的吸光度(僅雙鏈核酸時的吸光度) 的約1.5倍左右，由此可以判斷熔解結束。基於這種現象，所謂 熔解溫度Tm ( °C ) —般定義為吸光度達到吸光度總上升量的50 %時的溫度。
單核香酸多態性是由於檢測對象位點的單核苦酸的置換 (點突變)而產生的。因此，為了分析前述檢測對象位點是哪 種多態性，需要判斷單核苷酸的差異。因此，在前述的Tm分析 中，根據Tm值的差異來分析這種單核苷酸的差異。以下進行具 體說明。而且，方便起見，將檢測對象位點的多態性稱為突變 型和野生型。
雙鏈核酸的同源性越高則Tm值越高，同源性越4氐則Tm值越低。因此，例如，在設計與含有突變型的一全測對象位點的目 標核酸序列完全互補的檢測用探針(以下，稱為"突變型探針") 時，前述突變型探針和檢測對象位點為突變型的目標序列形成 的雙鏈核酸的Tmmut值，顯示出比前述突變型糹笨針和4企測對象位
點為野生型的目標序列所形成的雙《連核酸的TmwuJ直更高的 值。通過利用該性質的Tm分析，如下所述，可以分析多態性。 首先，作為評價基準，預先確定使用前述突變型探針時的前述 Tmmut值和TmwUd值。然後，使檢測對象位點的鹼基未知的分析 對象的目標核酸序列與前述突變型探針形成雙鏈核酸，對形成 的雙鏈核酸實施加熱處理，測定表示伴隨溫度上升的雙《連核酸 的解離的吸光度等信號值。然後，製成表示伴隨溫度變化的信 號值的變動的熔解曲線，確認預先確定的Tnimut值和Tmwnd值的 任一個中是否存在峰。其結果是，在Tmmut值附近存在峰時，由 於與前述突變型糹笨針100%匹配，可以判斷目標核酸序列中的檢 測對象位點為突變型的多態性。另一方面，在TmwUd值附近存 在峰時，由於與前述突變型探針有l個石成基錯配，因此可以判斷 目標核酸序列中的檢測對象位點是野生型的多態性。而且，還 可以判斷多態性是純合性還是雜合性。也就是說，在分析一對 等位基因的多態性時，當Tm，t值附近和Tmwnd值附近這兩處都 存在峰時，可以判斷為雜合性，另一方面，只在Tm咖t值附近存 在峰時，可以判斷為突變型的純合性，只在TmwUd值附近存在 峰時，可以判斷為野生型的純合性。而且，在使用與含有野生 型的檢測對象位點的目標核酸序列完全互補的檢測用探針(以 下，稱為"野生型探針")時，作為評價基準，如果預先設定前 述野生型探針和檢測對象位點為野生型的目標序列所形成的雙 鏈核酸的Tmwud值以及前述野生型探針和檢測對象位點為突變 型的目標序列所形成的雙鏈核酸的Tmmut值，則可以同樣判斷。而且，野生型探針的情況下，前述野生型探針和檢測對象位點
為野生型的目標序列所形成的雙鏈核酸的Tmwud值，顯示出比
前述野生型探針和檢測對象位點為突變型的目標序列所形成的
雙鏈核酸的Tm,t值更高的值。
此外，在這種利用Tm分析來進行的多態性的分析方法中， 為了更為簡化，在前述檢測用探針的存在下進行前述目標核酸 序列的擴增反應，直4妻使用前述擴增反應後的反應液，而進行 信號值的測定。如果通過這種方法，可以省略在擴增反應後向 前述反應液中另外添加前述4全測用揮:4十的工序，因此可以實現 簡化。而且，如果在前述反應液中預先添加;險測用4笨4f"，例如 可以維持前述反應液的密閉狀態，因此可以防止汙染。
專利文獻l:日本特開2005-58107號公報

發明內容
但是，在不存在探針下進行擴增反應後，向該反應液中添 加探針並進行Tm分析的方法，以及在探針存在下進行擴增反應 並使用該反應液而進行Tm分析的方法中，已知例如即4吏才莫板核 酸和探針相同，在後者的方法中發現了發生如下問題的情況。 也就是說，問題在於，即使使用多態性為已知的目標核酸序列， 即，使用已知在Tmwi!d值和Tmmut值中哪一個處出現峰的目標核 酸序列時，也由於峰小而難以判斷，或者看不到峰。尤其是， 在已知是雜合性的試樣時，理論上認為在Tmwud值和Tmmut值處 都能看見同等程度的峰，但實際上卻發現難以判斷與前述探針 完全互補的目標序列的峰(例如，使用突變型探針時，Tmmut 值的峰)這樣的情況。
因此，本發明的目的在於提供即使在探針存在下也能擴 增目標核酸序列的擴增方法、抑制前述探針對擴增的幹擾的方法、和目標核酸序列的分析方法、以及用於上述方法的4果針。
為了實現前述目的，本發明的擴增方法的特徵在於，其為 一種在探針存在下擴增模板核酸中的目標核酸序列的方法，其 包括在能與前述目標核酸序列雜交的探針的存在下，通過由引 物起始的延伸反應而擴增前述目標核酸序列的工序，作為前述
探針，使用下述探針由前述探針和與前述探針互補的互補鏈 所形成的雙鏈核酸的熔解溫度顯示為前述延伸反應的反應溫度 以下的探針。本發明中，以下也將目標核酸序列稱為目標序列。
本發明的擴增幹擾的抑制方法的特徵在於，其為 一 種在探 針存在下擴增模板核酸中的目標核酸序列時，抑制前述目標核 酸序列的擴增中的幹擾的方法，前述目標核酸序列的擴增方法 是本發明的擴增方法。
本發明的分析方法的特徵在於，其為使用能與目標核酸序 列雜交的^t笨針的前述目標核酸序列的分析方法，其具有下述 (A)和(B )工序
(A) 通過本發明的擴增方法，在前述探針存在下，擴增 才莫^1核酸中的前述目標核酸序列的工序；
(B) 前述(A)工序後，改變前述(A)工序的反應液的 溫度，測定表示獲得的擴增產物和前述探針形成的雙鏈核酸的 熔解狀態的信號值的工序。
另外，本發明的探針的特徵在於，其為在前述本發明的擴 增方法中使用的探針，其是在前述探針和與前述探針互補的互 補鏈形成雙鏈核酸時，前述雙鏈核酸的熔解溫度顯示為前述延 伸反應的反應溫度以下的探針。
本發明人在糹笨針存在下進行擴增反應並^f吏用該反應液進行 Tm分析時，為了弄清楚前述問題所發生的原因，進行了積極的 研究。結果發現，在前述擴增反應前在反應液中預先添加的探針，在擴增反應時會與模板核酸雜交，例如，可能會干擾引物 的退火和由退火的引物起始的延伸。這樣一來，可認為，如果 引物與模板核酸的退火和由引物起始的延伸受到幹擾，雖然存 在目標序列，但其擴增並不充分，因此結果是會發生難以檢測
峰這樣的問題。因此，本發明人發現，通過設計出該Tm值與延 伸反應溫度滿足前述關係的探針，可以避免前述問題。其理由 如下。
在使用探針的多態性分析中，為了提高分析精度，通常將 探針設計成與目標序列特異性雜交。為了這樣使探針特異性雜 交，一般採取使探針長度相對變長的方法。但是，前述探針相 對越長，其Tm值(即，例如，與和前述探針完全互補的序列所 構成的雙鏈核酸的Tm值)相對更高，因此一旦形成雙鏈，如果
不在更高的溫度下探針就難以從模板解離。因此，本發明人發 現，難以檢測峰的以往的問題原因是為了核酸擴增後的多態 性的Tm分析而設計成與目標核酸特異性雜交的探針，在核酸擴 增時與模板核酸雜交，幹擾了引物的退火和由退火的引物起始 的延伸反應。於是，本發明人想到，使探針的鹼基序列為Tm 值、即前述揮:針和與前述糹笨針互補的互補4連(例如，完全互補 的互補鏈)形成的雙鏈核酸的Tm值顯示為前述延伸反應溫度以 下的鹼基序列，以使得至少在核酸擴增中的延伸反應時，探針 難以與模板核酸雜交。根據本發明，即使在探針存在下擴增目 標序列，在前述延伸反應的反應溫度下，前述探針也不易與模 板核酸雜交。因此，目標序列的核酸擴增不易因探針而受到幹 擾，具體而言，例如，引物與模板核酸的退火和由前述引物起 始的延伸反應不易受到幹擾，其結果是，能夠充分進行前述目 標序列的擴增。尤其是，在與和前述探針完全互補的互補鏈的 Tm值、以及與和前述探針只有一個鹼基不同的互補鏈Tm值中，
10由於前者的值高，因此認為目前與只有一個鹼基不同的目標序 列相比，完全互補的目標序列更容易受到探針的影響。但是， 通過本發明的糹笨針可以避免這種問題，因此例如如前所述，即
使是雜合性的模板核酸，也能夠實現同樣的擴增效率，Tm分析 中也同樣能夠檢測出峰。因此，根據本發明，例如能夠在Tm分 析中以比以往更高的可靠度判斷有無峰。因此，本發明可以說 在基因分析的領域中是一種極為有用的技術。
另外，給在探針存在下進行核酸擴增時的Tm分析造成的問 題及其原因是由本發明人初次獲得的見解。而且，如前所述， 雖然有為了使探針與目標序列特異性雜交而將探針的Tm值設 定得相對較高，但本發明這樣，為了避免探針對核酸擴增所造 成的影響，而根據其Tm值與延伸反應的溫度關係設計探針，這 是由本發明首次提出的。


圖l是表示比較例中的Tm分析結果的圖。 圖2是表示本發明的實施例中的Tm分析結果的圖。 圖3是表示本發明的實施例中的Tm分析結果的圖。
具體實施例方式
<擴增方法〉
本發明的擴增方法，如前所述，其特徵在於，其為在探針 存在下擴增才莫^^反核酸中的目標核酸序列的方法，其包括在前述
列的工序，
作為前述探針，使用本發明的探針、即由前述探針和與前 述探針互補的互補鏈所形成的雙鏈核酸的熔解溫度顯示為前述延伸反應的反應溫度以下的探針。以下，將本發明中使用的前 述探針稱為本發明的探針。本發明的擴增方法中，前述探針優
選為由前述糹採4十和與前述揮:針完全互補的互補鏈所形成的雙
鏈核酸的熔解溫度顯示為前述延伸反應的反應溫度以下的探針。
這樣一來，通過在本發明的探針的存在下進行核酸擴增反 應，如前所述，例如抑制了引物與模板核酸的退火以及由發生 退火的引物起始的延伸中的幹擾，能夠進行目標序列的擴增。 而且，本發明的擴增方法的特徵在於，其使用滿足前述條件的 探針，核酸擴增方法的種類和條件等沒有任何限制。
而且，本發明中，為了對所使用的探針進行規定，而將前
述探針的性質規定為由前述探針和與前述探針完全互補的互 補鏈形成雙鏈核酸時，"由前述探針和與前述探針完全互補的互 補鏈所形成的雙《連核酸的熔解溫度顯示為前述延伸反應的反應 溫度以下"。也就是說，前述所謂"完全互補的互補鏈"始終是用 於規定所使用的探針的性質的條件，在使用時，並不作為前述 探針和與其完全互補的互補鏈形成雙《連核酸的條件。這樣，在
本發明中，例如使前述探針和與前述引物完全互補的互補鏈形 成雙鏈核酸的工序並不是必需的。此外，例如，在後述的目標 核酸序列的分析方法等中，在使擴增反應後的擴增產物和前述 探針形成雙鏈時，前述探針雜交的對象不限於與前述探針完全 互補的互補鏈，前述探針也可以與具有1個鹼基或數個鹼基錯配 的互補4連雜交。
本發明中，以下，將與前述探針完全互補稱為"完全匹配"， 將與前述探針完全匹配的互補鏈稱為"完全匹配互補鏈"，將由 前述探針和前述完全匹配互補鏈所形成的雙《連核酸稱為"完全 匹配的雙鏈核酸"，將前述完全匹配的雙鏈核酸的Tm值稱為"Tmper值"。而且，將除了 一個鹼基(或多個鹼基)外與前述探
針完全互補稱為"錯配"，將與前述探針錯配的互補鏈稱為"錯配 互補鏈"，將由前述探針和前述錯配互補鏈所形成的雙鏈核酸稱
為"錯配的雙鏈核酸"，將前述錯配的雙鏈核酸的Tm值稱為 "TmMis值"。此外，本發明中，通過核酸擴增方法擴增的序列可 以是目標序列和與其互補的序列，也可以是包括含有前迷目標 序列的區域的序列和與其互補的序列。
本發明的探針例如只要是前述完全匹配的Tmper值與前述
延伸反應溫度的關係滿足"Tmper值《延伸反應溫度(。C )"的探
針即可，其鹼基序列和鹼基數沒有任何限定。核酸擴增中，通
常包括以下3個步驟雙鏈核酸的熔解(向單鏈核酸的解離)、 引物與單鏈核酸退火、和由發生退火的引物起始的互補鏈的延 伸反應。前述延伸反應中，退火是前提，在核酸擴增中，例如 退火溫度和延伸反應一般設定在相同溫度。此時，本發明中的 "延伸反應溫度"例如還可以替換為退火溫度。
本發明的探針的鹼基序列可被設計為例如，在設定了延 伸反應的反應溫度的情況下，Tm值在前述延伸反應溫度以下。 考慮Tm值的探針的設計方法沒有特別限制，可以採用以往的公 知方法。探針的序列和Tm值，可以通過例如以往公知的 MELTCALC軟體(http: 〃www.meltcalc.com/)和田比鄰法(Nearest Neighbor Method )等確定。對於使用這種軟體等設計的探針， 優選例如在實際進行核酸擴增的條件下確認Tmper值。而且，本 發明的探針不僅例如如前所述根據延伸反應溫度而確定鹼基序 列，還根據前述4笨針的Tmpe/f直設定前述延伸反應溫度，從而使 其具備本發明的條件。也就是說，本發明的探針只要是探針的 Tmper值和延伸反應溫度最終滿足式"Tmper值《延伸反應溫度"
即可，用於滿足前式的方法例如可以調整前述探針的鹼基序列，
13也可以調整延伸反應溫度。由前述探針和前述完全匹配互補鏈所形成的雙鏈核酸的Tmper值只要滿足"Tmper值 < 延伸反應溫度(°C)"即可。TmPer值與延伸反應溫度之差例如為o。c以上(約o。c以上)，其上限沒有特別限制，例如，優選為0-30。C,更優選為0 20。C，進一 步優選為0 10。C,特別優選為0-2t:。前述^~配互補《連與前述#:針的同源性比前述完全匹配互補 鏈的同源性低，因此TniMis值比Tmper值低(TmMis值司制)、 Cy3和Cy5 ( Amersham Pharmacia乂^司制)、TAMRA ( Molecular probe公司制)等螢光色素。在一個反應系中使用2種以上本發明的揮:針時，例如，優選 用不同的螢光物質(在不同波長下進行檢測的螢光物質)標記 各探針。前述螢光物質的組合例如只要能在不同條件下檢測即 可，沒有特別限定，可以例舉例如太平洋藍(Pacific Blue)(檢 觀'J >皮長450 ~ 480nm ) 、 TAMRA (才企觀'J ;皮長585 ~ 700nm )禾口 BODIPYFL ( 4全測波長515 ~ 555nm)的組合等。此外，5，末端用螢光色素標記的標記探針，例如為了預防 擴增反應中探針自身延伸，也可以在其3，末端上進一步添加磷本發明中，作為前述核酸擴增方法，沒有特別限制，可以例舉例如PCR (聚合酶鏈式反應)法、NASBA(依賴核酸序列 的擴增，Nucleic acid sequence based amplification) 法、TMA (轉錄介導的擴增，Transcription-mediated amplification ) 法、 SDA(鏈置換擴增，Strand Displacement Amplification )法等， 這其中優選PCR法。以下，以PCR法為例，對本發明進行說明， 但不限於此。作為使用本發明的試樣，例如只要含有作為模板的核酸即 可，沒有特別限制。作為具體例子，例如可以例舉全血、口腔 內細胞(例如，口腔黏膜)、指曱或毛髮等體細胞、生殖細胞、 痰、羊水、石蠟包埋組織、尿、胃液(例如，胃洗液)等、以 及它們的懸浮液等。核酸擴增的反應液中的試樣的添加比例沒有特別限制。作 為具體例子，在前述試樣為生物試樣(例如，全血試樣)時， 前述反應液中的添加比例的下限例如優選為0.01體積％以上， 更優選為0.05體積％以上，進一步優選為0.1體積％以上。而且， 前述添加比例的上限也沒有特別限定，4旦例如優選為2體積％以 下，更優選為1體積％以下，進一步優選為0.5體積％以下。此外，如後所述，對核酸擴增的反應液進行光學檢測時， 尤其是用標記糹笨針進行光學衝全測時，前述反應液中的全血試樣 等生物試樣的添加比例例如優選設定為O.l ~ 0.5體積％ 。 PCR 反應中，通常為了核酸變性(向單鏈核酸的解離)而實施熱處 理，但通過這種熱處理，試樣中所含的糖和蛋白質等變性，存 在產生不溶性的沉澱物和渾濁等的擔憂。因此，在通過光學方 法確認擴增產物的有無和多態性時，這種沉澱物和渾濁的發生 可能會對測定精度產生影響。然而，反應液中的全血試樣的添加比例如果設定在前述範圍內，雖然機理並不清楚，但例如由 於可以充分防止由於變性產生的沉澱物等所造成的影響，因此 可以提高光學方法的測定精度。此外，由於全血試樣中的雜質 所導致的對PCR的幹擾也被充分抑制，因此可以進一步提高擴
增效率。
此夕卜，前述反應液中的全血試樣的比例不 <義可以用前述體
積比例(例如，0.1 ~ 0.5體積％ )表示，還可以用血紅蛋白(以 下，稱為"Hb")的重量比例來表示。此時，前述反應液中的全 血試樣的比例換算成Hb量，例如優選在0.565 ~ 113g/L的範圍， 更優選在2.825 ~ 56.5g/L的範圍，進一步優選在5.65 ~ 28.25g/L 的範圍。此外，前述反應液中的全血試樣的添加比例例如可以 滿足前述體積比例和Hb重量比例這兩者，也可以滿足其中任一 者。
作為全血，例如可以是溶血的全血、未溶血的全血、抗凝 固全血、含凝固成分的全血等中的任意一種。
本發明中，試樣中所含的模板核酸例如是DNA。前述DNA 例如可以是生物試樣等試樣中原本所含的D N A ，也可以是通過 核酸擴增而擴增的擴增產物DNA。後者的情況下，可以例舉由 前述試樣中原本所含有的RNA (總RNA、 mRNA等)通過逆轉 錄反應而生成的cDNA。
本發明的擴增產物的製造方法中，例如，優選在核酸擴增 開始前，在前述反應液中進一步添力口白蛋白。通過添力口這種白 蛋白，例如可以進一步降低由前述沉澱物和渾濁的產生而造成 的影響，而且還可以進一步提高擴增效率。
前述反應液中的白蛋白的添力o比例例如為0.01 ~ 2重量％ 的範圍，優選為0.1~1重量％,更優選為0.2~ 0.8重量％ 。作為 前述白蛋白，沒有特別限制，可以例舉例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、馬血清白蛋白等， 這些物質可以^使用其中任一種，也可以一起^f吏用兩種以上。下面，關於本發明的擴增產物的製造方法，列舉一個例子 進行說明，所述例子為以DNA作為模板核酸，在本發明的探 針的存在下，通過採用用於擴增目標核酸的引物的PCR,對全 血試樣擴增目標核酸。而且，本發明的特徵在於使用本發明的 探針，其它構成及條件沒有任何限定。首先，製備PCR反應液。前述反應液中的糹罙針的添加比例 沒有特別限定，例如優選在前述反應液中4姿10 ~ 400nmol/L的範 圍添加，更優選為20 ~ 200nmol/L。此外， -使用螢光物質作為4果 針的標記時，例如，為了調整檢測的螢光強度，可以一起使用 與標記探針序列相同的未標記揮:針，該未標記^罙針可以在其3， 末端上添加磷酸。此時，標記探針和未標記探針的摩爾比例如 優選為1: 10 ~ 10: 1。前述反應液中的引物的添加比例沒有特別限定，例如優選 按O.l ~ 2jimol/L添加，更優選為0.25 ~ 1.5|imol/L，特別優選為 0.5 ~ l|amol/L。而且，作為引物，可以4吏用由正向引物和反向 引物所構成的一對引物對，此時，優選在前述範圍內添加兩條 引物。正向引物(F)和反向引物(R)的添加比例(摩爾比F: R)沒有特別限定，例如，優選為l: 0.25~1: 4,更優選為l: 0.5-1: 2。而且，引物和引物對例如可以是l種，也可以是2 種以上。本發明中，所使用的引物例如可以才艮據l個反應液中所 擴增的目標序列的數目而適當使用。前述反應液中的全血試樣的比例沒有特別限定，優選為前 述範圍。全血試樣可以直接添加在反應液中，也可以預先用水 或緩衝液等溶劑稀釋之後再添加到反應液中。預先稀釋全血試 樣時，其稀釋率沒有特別限制，例如，可以設定為反應液中的18最終的全血添加比例在前述範圍內，例如為100 ~ 2000倍，優選 為200 ~ IOOO倍。
前述反應液中的其它組成成分沒有特別限制，可以例舉以 往公知的成分，其比例沒有特別限定。作為前述組成成分，可 以例舉例如DNA聚合酶、核苷酸(三磷酸核苷(dNTP))和溶 劑。jt匕夕卜，3o前戶斤述，前述反應液l尤選還含有白蛋白。而且， 在前述反應液中，各組成成分的添加順序沒有任何限制。
作為前述DNA聚合酶，沒有特別限制，例如可以使用以往 公知的耐熱性細菌來源的聚合酶。作為具體例子，可以是水生 棲熱菌(TTzwww "《wa"'cw)來源的DNA聚合酶(美國專利第 4,889，818號和第5,079，352號)(商品名Taq聚合酶)、嗜熱棲熱 菌(772ermw f/zwmop/n7w )來源的DNA聚合酶(WO 91/09950 )
(rTth DNA聚合酶)、強烈火球菌(/鵬'o纖)來源 的DNA聚合酶(WO 92/9689 ) ( Pfu DNA聚合酶Stratagene公 司制)、嗜熱球菌(7Tzwmococcw/"or"/")來源的DNA聚合酶
(EP隱A 455 430 )(商才示Vent: New England Biolabs7>司制)、超 嗜熱古菌(TTzermococcw Aod"A:"raews")來源的DNA聚合酵(商 品名KODDNA聚合酶)等能夠商業獲得的聚合酶，這其中優選 水生棲熱菌(T72^mws a《w"〃cw )來源的耐熱性DNA聚合酶。
前述反應液中的DNA聚合酶的添加比例沒有特別限定，例 如為l 100U/mL,優選為5 50U/mL,更優選為20 ~ 30U/mL。 而且，DNA聚合酶的活性單位(U) —般被定義為以活化鮭 魚精子DNA作為模板引物，以活性測定用反應液中74。C下30分 鍾內將全部10nmol的核苷酸吸收到酸不溶性沉澱物的活性為 1U。前述活性測定用反應液的組成例如為25mmol/L TAPS緩衝 液(pH9.3， 25°C)、 50mmol/LKCl、 2mmol/L MgCl2、 lmmol/L 琉基乙醇、200[imol/L dATP、200|imol/:L dGTP 、 200jamol/;L dTTP、100|imol/L [ a-32P ] dCTP、 0.25mg/mL活化鮭魚精子DNA。作為前述三磷酸核苷，通常可以例舉dNTP ( dATP、 dCTP、dGTP、 dTTP、和/或dUTP)。前述反應液中的dNTP的添加比例沒有特另'J限定，例如為0.01 ~ lmmol/L ， 優選為0.05 ~0.5mmol/L, 更Y尤選為0.1 ~ 0.3mmol/L。作為前述溶劑，可以例舉例如Tris-HCl、三(羥曱基)甲基甘氨酸(Tricine)、 MES、 MOPS、 HEPES、 CAPS等緩衝液，可以使用市售的PCR用緩衝液和市售的PCR試劑盒的緩沖液等。而且，前述PCR反應液還可以含有甘油、肝素、甜菜石威、 KC1、 MgCl2、 MgS04、 DMSO等，它們的添加比例例如只要設 定在不幹擾PCR反應的範圍內即可。前述反應液的總體積沒有特別限制，例如可以根據所使用 的機器(熱循環儀)、和管或晶片等容器等而適當確定，但通常 為l 500[iL,優選為10 ~ IOOjiL。然後，進行PCR。 PCR通常以(1)雙鏈核酸向單鏈核酸的 解離、(2)引物與單鏈核酸退火、(3)退火的引物的延伸(聚 合酶反應)這3個步驟為1個循環。各步驟中的溫度條件沒有特 別限制，如前所述，前述(3 )的延伸反應溫度只要在前述探針 的Tmper值以上即可。前述(1 )的解離步驟可以例舉例如，90~ 99。C下1 ~ 120秒、， <尤選92~ 95。C下l ~ 60秒、，前述(2)的退火 步驟可以例舉例如40~ 70。C下l ~ 300秒，優選50~ 70。C下5 60 秒，前述(3)的延伸步驟可以例舉例如50 80。C下l ~ 300秒， 優選50~ 75。C下5 ~ 60秒的條件，但並不限於此。P C R的循環數沒有特別限定，但例如優選為3 0個循環以上， 其上限沒有特別限定，例如為總計100個循環以下，優選為70 個循環以下，更優選為50個循環以下。如上所述，在本發明的探針的存在下，能夠擴增目標序列。 根據該方法，如前所述，引物與模板核酸的退火和由退火的引 物起始的延伸不易受到探針幹擾，因此即使在前述目標序列含 有與前述探針完全匹配的互補鏈和錯配的互補鏈中的任 一 者的 情況下，也可以以比以往更優異的效率進4亍擴增。而且，本發 明的擴增方法也可以稱為目標序列的擴增產物的製造方法。
本發明的擴增方法還可以進一步包括4全測由前述擴增反應 而獲得的目標序列的擴增產物的工序。由此，也可以檢測擴增 產物的有無、以及目標序列的多態性。對於這種實施方式，下 面將其作為本發明的目標序列的分析方法的一個方式來說明。
<目標序列的分析方法〉
本發明的目標序列的分析方法，如前所述，其特徵在於， 其為使用能與目標核酸序列雜交的探針進行的前述目標核酸序
列的分析方法，其具有下述(A)和(B)工序
(A) 通過本發明的擴增方法，在前述探針的存在下，擴 增前述目標核酸序列的工序；
(B) 前述(A)工序後，改變前述(A)工序的反應液的 溫度，測定表示獲得的擴增產物與前述探針形成的雙鏈核酸的 熔解狀態的信號值的工序。
根據本發明的目標序列的分析方法，例如可以進行前述目 標序列的擴增的有無、和前述目標序列中多態性的判斷等。而 且，本發明的分析方法的特徵在於，利用本發明的擴增方法來 擴增目標序列，也就是說在本發明的探針存在下擴增目標序列， 例如，其它構成和條件等沒有任何限定。
本發明的目標序列分析方法例如優選進一步具有下述(C) 工序。這樣，通過確認伴隨前述反應液的溫度變化的信號值的 變動，可以判斷如前所述的前述目標序列的擴增的有無和多態性。
(C)根據伴隨溫度變化的前述信號值的變動而分析前述 目標序列的工序。
本發明中，前述(C)工序優選為採用表示伴隨溫度變化 的信號值的變動的熔解曲線進行的熔解曲線分析。熔解曲線一 般是顯示出各溫度與表示試樣的熔解狀態的信號值或信號值的 微分值(以下，稱為"信號微分值")之間關係的圖。如果使用 這種熔解曲線，可以容易地通過例如目視而判斷例如Tmper值和
Tm廳值處有無峰。
由於前述熔解曲線容易判斷信號的變化量，因此優選為表 示前述溫度與信號微分值之間關係的圖。前述信號微分值例如 可以用"dF/dT，，表示，也可以用"-dF/dT，，表示。dF表示信號值的 變化量，dT表示溫度的變化量。信號的發生由於試樣的熔解而 受到抑制時，在用"dF/dT"表示信號微分值的熔解曲線中，峰為 波谷型，在用"-dF/dT，，表示信號微分值的熔解曲線中，峰為山 型。而且，由於試樣的熔解而發生信號時，在用"dF/dT"表示信 號微分值的熔解曲線中，峰為山型，在用"-dF/dT"表示信號微 分值的熔解曲線中，峰為波谷型。前述信號例如可以由於試樣 的非熔解而發生，由於試樣的熔解而導致信號發生被抑制，相 反，也可以由於試樣的非熔解而導致信號發生被抑制，由於前 述試樣的熔解而導致發生信號。信號在試樣的熔解和非熔解下 都發生，而且，在用前述任一式表示信號微分值時，峰的大小 可以用信號微分值的絕對值的大小來評價。
通過本發明的分析方法分析前述目標序列的多態性時，例 如，所謂前述目標序列是指具有發生多態性的檢測對象位點的 序列，本發明的探針為與其互補的序列。而且，前述(C)工 序中，根據前述信號值的變動，可以分析前述目標序列的4全測
22對象位點的多態性。如前所述，探針為突變型探針時，如果在 Tmper值(即Tmmut值)附近檢測到峰，則可以判斷多態性為突
變型，如果在TmMis值(即Tm^d值)附近檢測到峰，則可以判 斷多態性為野生型。而且，如果只在一者的Tm值處^^測到峰， 則可以判斷為純合性的多態性，如果在兩者的Tm值處均檢測到 峰，則可以判斷為雜合性的多態性。而且，本發明中，方便起 見，將檢測對象位點的多態性稱為突變型和野生型，但這並不 限制本發明。
前述(B)工序中，表示前述擴增產物和前述探針形成的 雙鏈核酸的熔解狀態的信號值的測定，如前所述，可以測定 260nm處的吸光度，也可以測定標記物質的信號。前者例如優 選在本發明的#:針為未標記探針時採用。後者例如優選在本發 明的揮:針為用標記物質標記的標記糹笨針時採用。作為前述標記 探針，可以例舉例如單獨顯示信號且由於形成雜交體而不顯示 信號的標記探針，或者單獨不顯示信號且由於形成雜交體而顯 示信號的標記探針。如果是前述的探針，在與目標序列形成雜 交體(雙鏈核酸)時不顯示信號，而探針由於加熱游離時則顯 示信號。此外，如果是後者的探針，通過與目標序列形成雜交 體(雙鏈核酸)而顯示信號，而探針由於加熱游離時則信號減 少(消失)。因此，通過在信號特有的條件(吸收波長等)下檢 測這種標記物質所產生的信號，與前述260nm處的吸光度測定 一樣，也可以進行雜交體的熔解的進行和Tm值的確定等。
本發明中，如前所述，能夠在同一反應液中對2個以上的目 標序列進行分析，或者對l個目標序列中的2個以上的檢測對象 位點的多態性進行分析等。這種情況下，前述(A)工序的核 酸擴增的反應液中，可以#4居所分析的目標序列和^r測對象位 點，預先添加例如2種以上的本發明的探針。這樣，在使用2種以上的探針時，優選它們分別被可以在不同條件下^全測的不同 標記物質標記。這樣，通過使用不同的標記物質，即使是同一 反應液，通過改變片全測條件，也可以分別分析各目標序列和各 4企測對象位點。
下面，就本發明的分析方法，以使用標記探針作為本發明 的探針為例進行說明，但本發明並不限於此。此外，只要沒有 特別說明，可以與本發明的擴增方法同樣進行。
首先，與前述一樣，製備含有標記探針和用於擴增目標序
列的引物的PCR反應液，進行PCR,進行前述目標序列的擴增。 前述反應液例如含有本發明的探針、引物、DNA聚合酶、dNTP 和含有才莫^反核酸的試樣等。此外，前述反應液還可以含有能夠
在核酸擴增中4吏用的各種添加劑。
然後，直接使用前述PCR反應液，進行獲得的擴增產物的 解離(例如，雙鏈DNA等向單鏈核酸的解離)、和解離出的單 鏈核酸與前述標記探針的雜交。這例如可以通過前述反應液的 溫度變化來進行。
前述解離工序中的加熱溫度只要是能夠解離前述擴增產物 的溫度即可，沒有特別限定，例如是85 95。C。加熱時間也沒 有特別限定，通常為1秒 10分鐘，優選為1秒 5分鐘。
解離出的單鏈核酸與前述標記探針的雜交，例如可以在前 述解離工序後，通過降低前述解離工序中的加熱溫度來進行。 溫度條件沒有特別限定，但在確認前述目標序列是否與前述探 針完全匹配時，優選低於前述標記探針的Tmper值。此外，在確 認目標序列是否與前述探針錯配時，以及在確認是完全匹配還 是錯配時，優選比TmMis值低。前述雜交的溫度沒有特別限定， 例如一般為40 ~ 50°C。
然後，改變前述反應液的溫度，測定表示前述擴增產物與前述標記探針的雜交產物的熔解狀態的信號值。具體而言，例
如，加熱前述反應液(前述單鏈DNA與前述標記探針的雜交產 物)，測定伴隨溫度上升的信號值的變動。如前所述，在使用末 端的C鹼基被標記的探針(鳥噤呤猝滅探針)時，在與單鏈DNA 雜交的狀態下，螢光減少(或猝滅)，解離的狀態下，發出螢光。 因此，例如可以緩緩加熱螢光減少(或捽滅)的雜交產物，測 定伴隨溫度上升的螢光強度的增加。
測定螢光強度的變動時的溫度範圍沒有特別限定，例如起 始溫度為室溫 85。C,優選為25 70。C，終止溫度例如為40 105°C。而且，溫度的上升速度沒有特別限定，例如為O.l ~ 20°C/ 秒，優選為0.3 ~ 5"/秒。
然後，根據前述信號的變動，進行目標序列的分析。此時， 對本發明的探針，預先測定Tmper值和TmMis值。然後，根據得 到的螢光強度，計算各溫度下每單位時間的螢光強度變化量， 確認前述Tmper值和TmMis值的任 一 者處是否顯示出最大的絕對 值。具體而言，例如，製成由溫度與"-d螢光強度增加量/dT"而 繪製成的熔解曲線，確認在前述Tmper值和TmMis值的任 一 者處 是否存在表示最低值的波谷型的峰。此外，例如，在製成由溫 度和"d螢光強度增加量/ d T"繪製成的熔解曲線時，確認在前述 Tmp^值和TmMis值的任一者處是否存在表示最高值的山型的 峰。其結果是，如果在前述Tmper值附近可看到峰，則可以判斷 前述目標序列與前述探針完全匹配，如果在前述TmMis值附近可 看到峰，則可以判斷前述目標序列與前述揮:4i^晉配。而且，如 果前述探針是突變型檢測用的話，完全匹配則可以判斷多態性 為突變型，錯配則可以判斷多態性為野生型，相反，如果前述 探針是野生型檢測用的話，完全匹配則可以判斷多態性為野生 型，錯配則可以判斷多態性為突變型。此外，與鳥嘌呤猝滅探針相反，使用在與單鏈DNA雜交的 狀態下發出螢光、在解離的狀態下螢光減少(或猝滅)的探針 時，緩緩加熱發出螢光的雜交產物，測定伴隨溫度上升的螢光 強度的減少。
此外，本發明中，例如，可以測定雜交體形成時的信號變 動來代替如前所述糹是高含有前述探針的反應液的溫度來測定伴 隨溫度上升的信號變動的方法。也就是說，在降低含有前述4罙 針的反應液的溫度而形成雜交產物時，可以測定伴隨前述溫度 下降的信號變動。
作為具體例子，在使用單獨顯示信號且由於形成雜交體而
不顯示信號的標記探針(例如，鳥嘌呤猝滅探針)時，在單鏈 DNA和探針解離的狀態下發出螢光，而由於溫度下降形成雜交 體時，前述萸光則減少(或猝滅)。因此，例如可以〗吏前述反應 液的溫度緩緩下降，測定伴隨溫度下降的螢光強度的減少。另 一方面，在使用單獨不顯示信號且由於形成雜交體而顯示信號 的標記探針時，在單鏈DNA與探針解離的狀態下不發出螢光， 而由於溫度下降形成雜交體時，則發出螢光。因此，例如可以 使前述反應液的溫度緩緩下降，測定伴隨溫度下降的螢光強度 的增力口 。

本發明的擴增幹擾的抑制方法，如前所述，其特徵在於， 其為在探針存在下的目標序列的擴增中，抑制前述目標序列的 擴增的幹擾的方法，前述目標序列的擴增方法是本發明的擴增 方法。本發明的特徵在於，在探針存在下的目標序列的擴增中 進行本發明的擴增方法，即在本發明的探針存在下擴增目標序 列，其它構成和條件沒有任何限制。而且，本發明可以與前述 本發明的擴增方法同樣進行。
26<探針〉
本發明的探針如前所述，其特徵在於，其為在本發明的擴增方法或本發明的擴增幹擾的抑制方法中使用的探針，其是由前述探針和與前述探針互補的互補鏈所形成的雙鏈核酸的熔解溫度顯示為前述延伸反應的反應溫度以下的探針。前述探針優選為，由前述#笨針和與前述探針完全互補的互補鏈所形成的雙鏈核酸的炫解溫度顯示為前述延伸反應的反應溫度以下。具體內容如本發明的擴增方法中所述。本發明的探針可以在本發明的抑制方法、擴增方法和分析方法中使用。

本發明的擴增用試劑的特徵在於，其為在本發明的擴增方法、抑制方法或分析方法中使用的試劑，其含有本發明的探針。本發明的擴增用試劑只要含有本發明的探針即可，其它構成沒有任何限定。本發明的擴增試劑例如還可以進一步含有用於擴
增目標序列的引物、DNA聚合酶等聚合酶、dNTP等。
本發明的擴增用試劑的形態沒有特別限制，例如可以是液體試劑，也可以是使用前懸浮於溶劑中的乾燥試劑。此外，本發明的探針和前述引物等其它成分的含量沒有特別限定。本發明的擴增用試劑例如可以是擴增用試劑盒，例如，各試劑可以
收納於相同容器或各自的容器中。此外，前述擴增用試劑盒優選還配備有使用說明書。<探針的設計方法〉
本發明的探針的設計方法的特徵在於，其為在探針存在下擴增模板核酸中的目標核酸序列的方法中使用的前述探針的設計方法，將前述探針設計為由前述探針和與前述糹果針互補的互補鏈所形成的雙鏈核酸的熔解溫度顯示為前述延伸反應的反應溫度以下。本發明中，優選將前述探針i殳計為由前述糹笨針和
27與前述探針完全互補的互補鏈所形成的雙鏈核酸的熔解溫度顯示為前述延伸反應的反應溫度以下。本發明的i殳計方法，具體可以與前述本發明的擴增方法中說明的方法同樣進行。而且，本發明也可稱為探針的製造法，包括如前所述設計探針的工序。
下面，就本發明，以實施例為例進行說明，^旦本發明並不限於此。
實施例1
使用試劑盒(商品名QIAamp DNA Mini kit; QIAGEN^>司制)，從呈現出雜合性的多態性CYP2C9 * 3的待測者的血液中純化基因組。用TE ( 10mmol/L Tris-HCl、 lmmol/L EDTA )將純化基因組稀釋為1/10 (體積)。將該稀釋的純化基因組lfiL添加到下述組成的PCR試劑49fiL中，用熱循環4義進行PCR。 PCR的條件為，95。C下處理60秒後，以雙鏈的解離處理l秒和延伸反應處理15秒作為1個循環而重複50個循環。前述解離處理的溫度為95°C ,延伸反應處理(包括退火處理)的溫度為規定溫度(52°C、 58。C或60。C)。然後，PCR反應後，再將前述反應液進行95。C下1秒、40。C下60秒處理，然後將溫度的上升速度設為1。C/3秒，從40。C開始加熱到95。C,測定經時的螢光強度的變化。測定波長為515~ 555nm (螢光色素BODIPY FL的檢測)。
(PCR反應液單位fiL)
蒸餾水 27.610 x Gene Taq緩衝液(無Mg) * 5
10%NaN3 0.2
5U/pL Gene Taq FP* 0.25
80%甘油 9.37
100mmol/L MgCl2 0.752.5mmol/L dNTP 4100pmol/L CYP2C9 F引物 0.5lOO^mol/L CYP2C9 R引物 0.2100|imol/L CYP2C"3用探針 0.04
20% BSA_1
合計49^L
氺商品名Gene T叫FP: NIPPON GENE CO.， LTD.制(引物對)
CYP2C9 * 3 F引衝勿(序歹'J號1 )
5'-gagcccctgcatgcaa-3'
CYP2C9 * 3 R引物 (序歹'J號2 )
5'-gatactatgaatttggggacttcgaa-3'
(突變型檢測用探針)CYP2C9 * 3 4笨4十(序歹寸號3 )5'-gggagaagGtcaAGgTatc畫(BODIPY FL ) -3'突變型4企測用的CYP2C9 * 3用探針和與前述糹果針完全互補的互補鏈形成的雜交體(完全匹配雙鏈)的Tmpe/fi為58。C。此外，前述〔丫？209* 3用探針和與前述探針除檢測對象位點的l個鹼基之外完全互補的互補鏈形成的雜交體(4晉配雙鏈)的TmMis值為53 °C 。
這些結果示於圖1 圖3。這些圖是表示伴隨溫度上升的螢光強度的變化的熔解曲線的圖，縱軸的微分值表示"-d螢光強度增加量/dT，， (-dF/dT)，橫軸表示溫度。圖1是表示將PCR的延伸反應溫度設定在52。C時的熔解曲線的圖，圖2是表示將前述延伸反應溫度設定在58。C時的熔解曲線的圖，圖3是表示將前述延伸反應溫度設定在60。C時的熔解曲線的圖。
前述延伸反應溫度為52°C時，前述完全匹配雙鏈的TmPer值與延伸反應溫度的關係為"Tmper值〉延伸反應溫度"，無法滿
足本發明中的條件。因此，如圖l所示，儘管在53。C處可以充分確認錯配雙鏈的峰，但58。C處完全匹配雙鏈的峰極小，因此難以判斷。相反，前述延伸反應溫度為58。C時，前述完全匹配雙
鏈的Tmper值與延伸反應溫度的關係為"Tmper值=延伸反應溫
度，，，前述延伸反應溫度為60。C時，前述完全匹配雙鏈的Tm值
與延伸反應溫度的關係為"Tmper值 < 延伸反應溫度"，滿足本發
明的條件。其結果為，如圖2和圖3所示，53匸處錯配的峰當然可以;險測，並且58 。C處完全匹配的峰同樣可以檢測。產業上的可利用性
如上所述，根據本發明，即使在探針存在下進行目標序列的擴增，在前述延伸反應的反應溫度下，前述探針難以與模板核酸雜交。因此，引物與模板核酸的退火和由前述引物起始的延伸反應不易受探針幹擾，其結果為，可以充分進行前述目標序列的擴增。因此，才艮據本發明，例如，在Tm分析中可以以比以往更高的可靠性來判斷峰的有無。因此，本發明可以說尤其在基因分析領域中是極為有用的技術。
權利要求
1.一種擴增方法，其特徵在於，其為在探針存在下擴增模板核酸中的目標核酸序列的方法，其包括在能與前述目標核酸序列雜交的探針的存在下，通過由引物起始的延伸反應而擴增前述目標核酸序列的工序，作為前述探針，使用的探針為由前述探針和與前述探針互補的互補鏈所形成的雙鏈核酸的熔解溫度顯示為前述延伸反應的反應溫度以下的探針。
2. 根據權利要求l所述的擴增方法，其中，作為前述探針， 使用的探針為由前述探針和與前述探針完全互補的互補鏈所 形成的雙鏈核酸的熔解溫度顯示為前述延伸反應的反應溫度以 下的探針。
3. 根據權利要求2所述的擴增方法，其中，由前述探針和 與前述探針完全互補的互補鏈所形成的雙鏈核酸的熔解溫度與 前述延伸反應的反應溫度之差在約0。C以上。
4. 根據權利要求2所述的擴增方法，其中，前述探針是如 下的探針由前述探針和與前述探針完全互補的互補鏈所形成 的雙鏈核酸的熔解溫度、以及由前述探針和與前述探針除1個鹼 基外完全互補的互補鏈所形成的雙鏈核酸的熔解溫度，二者之差顯示為約rc以上。
5. 根據權利要求l所述的擴增方法，其中，前述探針是用 標記物質標記的標記t罙針。
6. 根據權利要求4所述的擴增方法，其中，前述標記物質 是螢光物質。
7. —種擴增幹擾的抑制方法，其特徵在於，其為在探針存 在下擴增^t板核酸中的目標核酸序列時，抑制前述目標核酸序 列的擴增的幹擾的方法，前述目標核酸序列的擴增方法是權利要求l所述的擴增方法。
8. —種目標核酸序列的分析方法，其特徵在於，其為使用 能與目標核酸序列雜交的探針進行的前述目標核酸序列的分析 方法，其具有下述(A)和(B)工序(A) 通過權利要求l所述的擴增方法，在前述探針的存在 下，擴增模板核酸中的前述目標核酸序列的工序；(B) 前述(A)工序後，改變前述(A)工序的反應液的 溫度，測定表示獲得的擴增產物與前述探針形成的雙鏈核酸的 熔解狀態的信號值的工序。
9. 根據權利要求8所述的分析方法，其還具有下述(C)工序(C) 根據伴隨溫度變化的前述信號值的變動而分析前述 目標序列的工序。
10. 根據權利要求9所述的分析方法，其中，前述(C)工 序是使用表示伴隨溫度變化的信號值的變動的熔解曲線進行的 熔解曲線分析。
11. 才艮據鬥又利要求9所述的分析方法，其中，前述目標核酸 序列是具有發生多態性的檢測對象位點的序列，在前述(C)工序中，根據前述信號值的變動，分析前述 目標核酸序列的#r測對象位點的多態性。
12. 根據權利要求9所述的分析方法，其中，在前述(C) 工序中，根據前述信號值的變動，分析前述目標核酸序列有無 擴增。
13. 根據權利要求8所述的分析方法，其中，前述探針是用標記物質標記的標記揭:針。
14. 根據權利要求13所述的分析方法，其中，前述標記物 質是螢光物質，前述(B)工序中的信號值是螢光強度。
15. —種探針，其特徵在於，其為在權利要求l所述的擴增方法中使用的探針，前述4笨針是如下的探針由前述探針和與前述4笨針互補的 互補鏈所形成的雙鏈核酸的熔解溫度顯示為前述延伸反應的反 應溫度以下的探針。
16. 根據權利要求15所述的探針，其中，前述探針是由 前述探針和與前述探針完全互補的互補鏈所形成的雙鏈核酸的 熔解溫度顯示為前述延伸反應的反應溫度以下的探針。
17. 根據權利要求16所述的探針，其中，前述探針和與前 述探針完全互補的互補鏈所形成的雙鏈核酸的熔解溫度與前述 延伸反應的反應溫度之差為約0。C以上。
18. 根據權利要求16所述的探針，其是如下的探針由前 述探針和與前述:l笨針完全互補的互補鏈所形成的雙鏈核酸的熔解溫度、以及由前述探針和與前述探針除l個鹼基外完全互補的 互補鏈所形成的雙鏈核酸的熔解溫度，二者之差顯示為約rc以上。
19. 根據權利要求15所述的探針，其中，前述探針是用標 記物質標記的標記4笨針。
20. 根據權利要求19所述的探針，其中，前述標記物質是 螢光物質。
21. —種探針設計方法，其特徵在於，其為在探針存在下 擴增模板核酸中的目標核酸序列的方法中使用的前述探針的設 計方法，將前述探針設計成由前述探針和與前述探針互補的互補 鏈所形成的雙鏈核酸的熔解溫度顯示為前述延伸反應的反應溫 度以下。
22. 根據權利要求21所述的探針設計方法，其中，將前述探針設計成由前述探針和與前述探針完全互補的互補鏈所形 成的雙鏈核酸的熔解溫度顯示為前述延伸反應的反應溫度以下。
全文摘要
提供一種在探針存在下的核酸擴增中抑制擴增反應的幹擾而擴增目標序列的方法。在擴增目標序列時，作為共存的探針，使用的探針的鹼基序列為在前述探針和與前述探針互補的互補鏈形成雙鏈核酸時，前述雙鏈核酸的熔解溫度呈現為前述延伸反應的反應溫度以下的鹼基序列。如果在這種探針存在下，例如，引物的退火和延伸反應不易因探針的存在而受到幹擾，能充分進行目標序列的擴增。因此，在通過Tm分析等而分析目標序列中的檢測目標位點的多態性時，能實現高可靠性。
文檔編號C12Q1/68GK101646786SQ200880010650
公開日2010年2月10日 申請日期2008年12月25日 優先權日2007年12月26日
發明者平井光春, 細見敏也, 間島智史 申請人:愛科來株式會社