一種快速擴增雙鏈rna靶序列的方法
2023-05-22 01:26:36
專利名稱：一種快速擴增雙鏈rna靶序列的方法
技術領域：
本發明涉及雙鏈RNA靶序列擴增，特別是以dsRNA為模板直接擴增。
背景技術：
病毒是一種由核酸和蛋白質外殼組成的具有侵染活性的細胞內寄生的最小的病原微生物。根據其核酸種類，可分為DNA病毒和RNA病毒。RNA病毒又分為雙鏈RNA(dsRNA)病毒和單鏈RNA(ssRNA)病毒。單鏈RNA病毒在核酸複製過程中，要以其互補鏈為模板，在RNA聚合酶(RNA-dependent RNAPolymerase，RDRP)的作用下進行核酸的複製。因此，在RNA病毒的感染過程中，絕大多數都會存在雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)的複製中間體，或者是遺傳物質的一種存在方式。dsRNA的分析法已廣泛應用於RNA病毒的研究中。應用這一方法有助於快速檢測已知RNA病毒的感染情況。由於dsRNA包含了RNA病毒的全部遺傳信息，並且dsRNA具有較其他核酸形式(如單鏈RNA)更好的理化穩定性，便於提取和貯存，是獲得RNA病毒基因組信息的較好的材料。
聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種在體外快速擴增特定基因或者DNA序列的方法。在傳統PCR基礎之上發展起來的RT-PCR則是首先以單鏈RNA為模板反轉錄生成cDNA，再在DNA聚合酶作用下通過PCR擴增得到所需的特異性片段。
RNA病毒基因組的特異性靶序列的擴增常用的方法主要有1)提取病毒粒子，再從病毒粒子中釋放病毒核酸後，以此為模板進行RT-PCR擴增。2)從感病的組織中提取總RNA後，再進行RT-PCR擴增。3)提取與病毒感染相對應的dsRNA，以此為模板，再進行RT-PCR反應。這幾種方法中都涉及反轉錄過程，試劑較貴，操作時需要特別小心，防止RNA的降解，從而給擴增帶來不利影響。加之方法1還涉及病毒粒子的提取，設備要求高，操作繁瑣。
DNA聚合酶(DNA polymerase)是一類以DNA或RNA為模板催化合成互補新鏈的酶。儘管大多數聚合酶優先作用於DNA模板，但也可作用於雙鏈RNA模板。耐熱DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)是聚合酶中重要的一種，最初是從一種極度嗜熱的棲熱水生菌(Thermus aquaticus)中分離純化出來的，它是一種依賴於DNA模板的DNA聚合酶。根據國外的報導，這種DNA聚合酶同時也具有反轉錄酶活性，在國內也有研究報導以單鏈RNA(mRNA)為模板利用Taq DNA聚合酶進行反轉錄生成cDNA第一鏈的例子。但沒有以雙鏈RNA為模板利用Taq酶直接進行PCR擴增特定目標序列的報導。
發明內容
針對現有技術中的不足之處，本發明以dsRNA為模板，建立一種簡單、快速擴增基因組靶序列的方法。
本發明的一種快速擴增雙鏈RNA靶序列的方法，它的步驟為(1)dsRNA的製備從組織中提取dsRNA；(2)通過瓊脂糖電泳進行割膠回收、分離純化dsRNA；(3)根據GenBank中的病毒基因組相應序列及其一二級結構特點，運用Primer Primier5.0軟體設計設計獲得雙鏈RNA的相應引物；(4)以回收後的dsRNA為模板，添加雙鏈RNA的相應引物，在Taq酶作用下直接進行PCR擴增，獲得目的產物；PCR的條件反應體系1.5-2.5U的Taq酶，25-100ng/μL的dsRNA模板0.5μL，5-15μM的上遊引物0.5-1.5μL，5-15μM的下遊引物0.5-1.5μL，10倍Buffer2-5μL，2.5μM的dNTP 1.6-3.2μL，用ddH2O補足20-50μL；反應條件採用溫度梯度PCR儀，對靶序列擴增時的退火溫度條件進行摸索；預變性5分鐘以後，選擇以下幾個反應條件中的一個條件94℃1min、50.2℃30s、72℃1min、35個循環、72℃延伸10min；94℃1min、52.6℃30s、72℃1min、35個循環、72℃延伸10min；94℃1min、54.9℃30s、72℃1min、35個循環、72℃延伸10min；或94℃1min、56.7℃30s、72℃1min、35個循環、72℃延伸10min。
所述的擴增結果用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。
所述步驟(4)之後將PCR產物進行膠回收，可獲得未知dsRNA序列。
本發明的優點(1)以dsRNA作為模板，充分利用了dsRNA的穩定性；(2)利用TaqDNA聚合酶既有反轉錄酶活性又有DNA聚合酶活性的特點，省去了反轉錄過程；(3)實驗所需試劑少，操作簡單，所用時間短，達到了省時、省錢、省力的效果。
圖1為本發明實施例中黃瓜花葉病毒CMV RNA3的277bp特異性靶序列的擴增結果；圖中1-DNA Mix Ladder Marker；2～7-退火溫度設定依次為47.0℃，47.9℃，50.2℃，52.6℃，54.9℃，56.7℃。
圖2為本發明實施例中黃瓜花葉病毒CMV RNA3的980bp特異性靶序列的擴增結果；圖中1～6-退火溫度設定依次為47.0℃，47.9℃，50.2℃，52.6℃，54.9℃，56.7℃；7-DNA Mix Ladder Marker。
圖3為本發明實施例中黃瓜花葉病毒CMV的衛星RNA的全序列擴增結果；圖中1～6-退火溫度依次為47.0℃，47.9℃，50.2℃，52.6℃，54.9℃，56.7℃；7-DNA Mix ladder Marker。
圖4為本發明實施例中傳染性法氏囊病毒IBDV的vp2基因序列擴增結果；圖中1-DNA Mix ladder Marker；2～7-退火溫度依次為50.2℃，52.6℃，54.9℃，56.7℃，58.2℃，60.9℃。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步說明實施例1黃瓜花葉病毒(CMV)及其衛星RNA序列1、dsRNA的製備(1)稱取5g去脈的黃瓜鮮葉組織，在液氮中充分研磨至粉末狀；(2)加入10ml 2倍STE(乙二胺四乙酸、三-羥-甲基-氨基甲烷與氯花鈉的混合物，pH8.0)，300μlβ-巰基乙醇，6ml飽和酚，4ml三氯甲烷，1.4ml10％SDS(十二烷基磺酸鈉)，充分勻漿20min；(3)4℃下15 000g離心15min，收集上清；(4)上清液用無水乙醇調至含乙醇17％的RNA混合液，室溫下混勻；(5)稱取3g纖維素(CF-11，Sigma公司產品)，用含17％乙醇的1倍STE平衡後裝柱，以50ml一次性塑料注射器或相當材料作為層析柱；(6)RNA混合液上樣後，用90ml含17％乙醇的1倍STE洗柱；(7)用不含乙醇的1倍STE洗脫，棄去最初的5ml液，收集隨後的10～15ml，加入等體積異丙醇，混勻後室溫放置5min；(8)4℃下15 000g離心15min，棄上清；(9)用200μl 70％乙醇洗沉澱，真空乾燥3min；(10)沉澱及時溶解於60μl TE(乙二胺四乙酸與三-羥-甲基-氨基甲烷的混合物)中，-20℃保存；(11)取5μl溶液在1％瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，比較dsRNA的相對大小，回收所需要的條帶。
(12)將回收的dsRNA濃度調整為50ng/μl。
2.引物設計根據GenBank中的CMV病毒及其衛星RNA的基因組序列及其一二級結構特點，運用Primer Primier5.0軟體設計相應引物。靶序列長度在100bp-1000bp均可進行直接擴增。上遊引物SEQ ID NO1，下遊引物SEQ ID NO2。預計產物長度為385bp。運用同樣方法設計CMV RNA3的兩對引物。一對是短片段靶序列引物，上遊引物SEQ ID NO3，下遊引物SEQ ID NO4。預計產物長度為277bp。另一對是長片段靶序列引物，上遊引物SEQ ID NO5，下遊引物SEQ ID NO6。預計產物長度為980bp。
3.PCR的條件(1)反應體系雙鏈RNA在Taq酶作用下直接進行擴增，其反應體系為1.5U的Taq酶，25ng/μL的雙鏈RNA模板0.5μL，5μM的上遊引物0.5μL，5μM的下遊引物0.5μL，10倍Buffer 2μL，2.5μM的dNTP 1.6μL，用ddH2O補足20μL。
(2)反應條件採用溫度梯度PCR儀，對靶序列擴增時的退火溫度條件進行摸索。預變性5分鐘以後，選擇反應條件
94℃1min、50.2℃30s、72℃1min，35個循環，最後一個循環72℃延伸10min。
4.擴增結果檢測(1)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果獲得385bp和980bp產物。
(2)PCR產物進行膠回收，獲得未知雙鏈RNA序列。
實施例2黃瓜花葉病毒衛星RNA序列1.dsRNA的製備(1)稱取5g去脈的鮮葉組織，在液氮中充分研磨至粉末狀；(2)加入10ml 2倍STE，300μl β-巰基乙醇，6ml飽和酚，4ml三氯甲烷，1.4ml 10％ SDS，充分勻漿20min；(3)4℃下15 000g離心15min，收集上清；(4)上清液用無水乙醇調至含乙醇17％的RNA混合液，室溫下混勻；(5)稱取3g纖維素(CF-11，Sigma公司產品)，用含17％乙醇的1倍STE平衡後裝柱，以50ml一次性塑料注射器或相當材料作為層析柱；(6)RNA混合液上樣後，用90ml含17％乙醇的1倍STE洗柱；(7)用不含乙醇的1倍STE洗脫，棄去最初的5ml液，收集隨後的10～15ml，加入等體積異丙醇，混勻後室溫放置5min；(8)4℃下15 000g離心15min，棄上清；(9)用200μl 70％乙醇洗沉澱，真空乾燥3min；(10)沉澱及時溶解於60μl TE中，-20℃保存；(11)取5μl溶液在1％瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，比較dsRNA的相對大小，回收所需要的條帶。
(12)將回收的dsRNA濃度調整為50ng/μl。
2.引物設計根據GenBank中的CMV病毒及其衛星RNA的基因組序列及其一二級結構特點，運用Primer Primier5.0軟體設計相應引物。靶序列長度在100bp-1000bp均可進行直接擴增。上遊引物SEQ ID NO1，下遊引物SEQ ID NO2。預計產物長度為385bp。運用同樣方法設計CMV RNA3的兩對引物。一對是短片段靶序列引物，上遊引物SEQ ID NO3，下遊引物SEQ ID NO4。預計產物長度為277bp。另一對是長片段靶序列引物，上遊引物SEQ ID NO5，下遊引物SEQ ID NO6。預計產物長度為980bp。
3.PCR的條件(1)反應體系雙鏈RNA在Taq酶作用下直接進行擴增，其反應體系為2.5U的Taq酶，100ng/μL的雙鏈RNA模板2μL，15μM的上遊引物1.5μL，15μM的下遊引物1.5μL，10倍緩衝液5μL，5μM的dNTP3.2μL，用ddH2O補足50μL。
(2)反應條件採用溫度梯度PCR儀，對靶序列擴增時的退火溫度條件進行摸索。預變性5分鐘以後，選擇反應條件94℃1min、52.6℃30s、72℃1min，35個循環，最後一個循環72℃延伸10min。
4.擴增結果檢測(1)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果獲得385bp和980bp產物。
(2)PCR產物進行膠回收，獲得未知雙鏈RNA序列。
實施例3黃瓜花葉病毒及其衛星RNA序列。
1.dsRNA的製備(1)稱取5g去脈的鮮葉組織，在液氮中充分研磨至粉末狀；(2)加入10ml 2倍STE，300μl β-巰基乙醇，6ml飽和酚，4ml三氯甲烷，1.4ml 10％SDS，充分勻漿20min；(3)4℃下15 000g離心15min，收集上清；(4)上清液用無水乙醇調至含乙醇17％的RNA混合液，室溫下混勻；(5)稱取3g纖維素(CF-11，Sigma公司產品)，用含17％乙醇的1倍STE平衡後裝柱，以50ml一次性塑料注射器或相當材料作為層析柱；(6)RNA混合液上樣後，用90ml含17％乙醇的1倍STE洗柱；(7)用不含乙醇的1倍STE洗脫，棄去最初的5ml液，收集隨後的10～15ml，加入等體積異丙醇，混勻後室溫放置5min；(8)4℃下15 000g離心15min，棄上清；(9)用200μl 70％乙醇洗沉澱，真空乾燥3min；(10)沉澱及時溶解於60μl TE中，-20℃保存；(11)取5μl溶液在1％瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，比較dsRNA的相對大小，回收所需要的條帶。
(12)將回收的dsRNA濃度調整為50ng/μl。
2.引物設計根據GenBank中的CMV病毒及其衛星RNA的基因組序列及其一二級結構特點，運用Primer Primier5.0軟體設計相應引物。靶序列長度在100bp-1000bp均可進行直接擴增。上遊引物SEQ ID NO1，下遊引物SEQ ID NO2。預計產物長度為385bp。運用同樣方法設計CMV RNA3的兩對引物。一對是短片段靶序列引物，上遊引物SEQ ID NO3，下遊引物SEQ ID NO4。預計產物長度為277bp。另一對是長片段靶序列引物，上遊引物SEQ ID NO5，下遊引物SEQ ID NO6。預計產物長度為980bp。
3.PCR的條件(1)反應體系雙鏈RNA在Taq酶作用下直接進行擴增，其反應體系為2.0U的Taq酶，50ng/μL的雙鏈RNA模板0.5μL，5μM的上遊引物1.0μL，5μM的下遊引物1.0μL，10倍Buffer 2μL，2.5μM的dNTP2.0μL，用ddH2O補足20μL。
(2)反應條件採用溫度梯度PCR儀，對靶序列擴增時的退火溫度條件進行摸索。預變性5分鐘以後，選擇反應條件94℃1min、56.7℃30s、72℃1min，35個循環，最後一個循環72℃延伸10min。
4.擴增結果檢測(1)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果獲得385bp和980bp產物。
(2)PCR產物進行膠回收，獲得未知雙鏈RNA序列實施例4傳染性法氏囊病毒(IBDV)的dsRNA為例dsRNA的製備1.感病組織或細胞總RNA的提取(1)稱取0.1g感病組織，在液氮中充分研磨至粉末狀；(2)加入1ml Trizol充分勻漿2min；(3)4℃下12 000g離心10min，收集上清，去除不溶物；(4)將勻漿上清於室溫下放置5min；
(5)加入0.2ml氯仿/1ml Trizol，輕微振蕩15秒後，於室溫放置2-3min；(6)4℃下12 000g離心15min，收集上清；(7)加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置10min，4℃下12 000g離心10min，棄上清(8)用800μl 70％乙醇洗沉澱，7500g離心5min，空氣乾燥5min；(9)沉澱及時溶解於50μl DEPC-H2O(焦碳酸二乙酯-水)中，-20℃保存；(10)取5μl總RNA溶液在1％瓊脂糖凝膠上進行甲醛變性電泳分析，檢測總RNA的完整性。比較dsRNA的相對大小，回收所需要的條帶，並將回收的dsRNA將濃度調整為50ng/μl。
2.引物設計根據GenBank中的病毒基因組相應序列及其一二級結構特點，運用PrimerPrimier5.0軟體設計相應引物。設計的VP2基因的上遊引物為SEQ ID NO7，下遊引物為SEQ ID NO8，預計靶序列長度為1338bp。
3.PCR的條件(1)反應體系雙鏈RNA在Taq酶作用下直接進行擴增，其反應體系為2.0U的Taq酶，50ng/μL的雙鏈RNA模板1μL，10μM的上遊引物1μL，10μM的下遊引物1μL，10倍緩衝液3μL，3μM的dNTP 2μL，用ddH2O補足30μL。
(2)反應條件採用溫度梯度PCR儀，對靶序列擴增時的退火溫度條件進行摸索。預變性5分鐘以後，在以下反應條件下，均可得到較好的擴增結果94℃1min、54.9℃30s、72℃1min，35個循環，最後一個循環72℃延伸10min。
4.擴增結果檢測(1)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果獲得1338bp產物。
(2)PCR產物進行膠回收，獲得未知雙鏈RNA序列，按常規方法克隆測序。
對照例1黃瓜花葉病毒及其衛星RNA序列。
1.植物總RNA的提取
(1)稱取0.1g去脈的鮮葉組織，在液氮中充分研磨至粉末狀；(2)加入1ml Trizol充分勻漿2min；(3)4℃下12 000g離心10min，收集上清，去除不溶物；(4)將勻漿上清於室溫下放置5min；(5)加入0.2ml氯仿/1ml Trizol(含酚、異硫氰酸胍和溶解劑等的混合物)，輕微振蕩15sec後，於室溫放置2-3min；(6)4℃下12 000g離心15min，收集上清；(7)加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置10min，4℃下12 000g離心10min，棄上清(8)用800μl 70％乙醇洗沉澱，7500g離心5min，空氣乾燥5min；(9)沉澱及時溶解於50μl DEPC-H2O中，-20℃保存；(10)取5μl總RNA溶液在1％瓊脂糖凝膠上進行甲醛變性電泳分析，檢測總RNA的完整性。
2.引物設計根據GenBank中的CMV病毒及其衛星RNA的基因組序列及其一二級結構特點，運用Primer Primier5.0軟體設計相應引物。靶序列長度在100bp-1000bp均可進行直接擴增。上遊引物SEQ ID NO1，下遊引物SEQ ID NO2。預計產物長度為385bp。運用同樣方法設計CMV RNA3的兩對引物。一對是短片段靶序列引物，上遊引物SEQ ID NO3，下遊引物SEQ ID NO4。預計產物長度為277bp。另一對是長片段靶序列引物，上遊引物SEQ ID NO5，下遊引物SEQ ID NO6。預計產物長度為980bp。
3.反轉錄(即cDNA的合成)反轉錄體系為2μg的總RNA 4μL，5μM的下遊引物0.5μL，2.5μM dNTP0.5μL，DEPC-H2O 1μL，將上述溶液混勻，於65℃保溫10min，冰浴5min，然後加入反轉錄緩衝液2μL、1.25U的RNA酶抑制劑0.25μL、1.25U的反轉錄酶0.25μL，將溶液混勻後置於42℃保溫60min，即可得到cDNA。
4.PCR的條件(1)反應體系cDNA在Taq酶作用下進行擴增，其反應體系為1.5U的Taq酶，cDNA模板3μL，5μM的上遊引物0.5μL，5μM的下遊引物0.5μL，10倍Buffer 2μL，2.5μM的dNTP 1.6μL，用ddH2O補足20μL。
(2)反應條件採用溫度梯度PCR儀，對靶序列擴增時的退火溫度條件進行摸索。預變性5分鐘以後，選擇反應條件94℃1min、50.2℃30s、72℃1min，35個循環，最後一個循環72℃延伸10min。
5.擴增結果檢測(1)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果獲得385bp和980bp產物；(2)PCR產物進行膠回收，獲得未知RNA病毒序列。
與實施例1比較，一次實驗成本增加1/4，時間延長90分鐘。
對照例2黃瓜花葉病毒衛星RNA序列1.植物總RNA的提取(1)稱取0.1g去脈的鮮葉組織，在液氮中充分研磨至粉末狀；(2)加入1ml Trizol充分勻漿2min；(3)4℃下12 000g離心10min，收集上清，去除不溶物；(4)將勻漿上清於室溫下放置5min；(5)加入0.2ml氯仿/1ml Trizol，輕微振蕩15sec後，於室溫放置2-3min；(6)4℃下12 000g離心15min，收集上清；(7)加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置10min，4℃下12 000g離心10min，棄上清(8)用800μl 70％乙醇洗沉澱，7500g離心5min，空氣乾燥5min；(9)沉澱及時溶解於50μl DEPC-H2O中，-20℃保存；(10)取5μl總RNA溶液在1％瓊脂糖凝膠上進行甲醛變性電泳分析，檢測總RNA的完整性。
2.引物設計根據GenBank中的CMV病毒及其衛星RNA的基因組序列及其一二級結構特點，運用Primer Primier5.0軟體設計相應引物。靶序列長度在100bp-1000bp均可進行直接擴增。上遊引物SEQ ID NO1，下遊引物SEQ ID NO2。預計產物長度為385bp。運用同樣方法設計CMV RNA3的兩對引物。一對是短片段靶序列引物，上遊引物SEQ ID NO3，下遊引物SEQ ID NO4。預計產物長度為277bp。另一對是長片段靶序列引物，上遊引物SEQ ID NO5，下遊引物SEQ ID NO6。預計產物長度為980bp。
3.反轉錄(即cDNA的合成)反轉錄體系為2μg的總RNA 4μL，5μM的下遊引物0.5μL，2.5μMdNTP 0.5μL，DEPC-H2O 1μL，將上述溶液混勻，於65℃保溫10min，冰浴5min，然後加入反轉錄緩衝液2μL、1.25U的RNA酶抑制劑0.25μL、1.25U的反轉錄酶0.25μL，將溶液混勻後置於42℃保溫60min，即可得到cDNA。
4.PCR的條件(1)反應體系cDNA在Taq酶作用下進行擴增，其反應體系為2.5U的Taq酶，cDNA模板3μL，15μM的上遊引物1.5μL，15μM的下遊引物1.5μL，10倍Buffer 5μL，2.5μM的dNTP 3.2μL，用ddH2O補足50μL。
(2)反應條件採用溫度梯度PCR儀，對靶序列擴增時的退火溫度條件進行摸索。預變性5分鐘以後，選擇反應條件94℃1min、52.6℃30s、72℃1min，35個循環，最後一個循環72℃延伸10min。
5.擴增結果檢測(1)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果獲得385bp和980bp產物。
(2)PCR產物進行膠回收，獲得未知RNA病毒序列。
與實施例2比較，一次實驗成本增加1/4，時間延長80分鐘。
對照例3黃瓜花葉病毒及其衛星RNA序列。
1.植物總RNA的提取(1)稱取0.1g去脈的鮮葉組織，在液氮中充分研磨至粉末狀；(2)加入1ml Trizol充分勻漿2min；(3)4℃下12 000g離心10min，收集上清，去除不溶物；(4)將勻漿上清於室溫下放置5min；(5)加入0.2ml氯仿/1ml Trizol，輕微振蕩15sec後，於室溫放置2-3min；(6)4℃下12 000g離心15min，收集上清；
(7)加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置10min，4℃下12 000g離心10min，棄上清；(8)用800μl 70％乙醇洗沉澱，7 500g離心5min，空氣乾燥5min；(9)沉澱及時溶解於50μl DEPC-H2O中，-20℃保存；(10)取5μl總RNA溶液在1％瓊脂糖凝膠上進行甲醛變性電泳分析，檢測總RNA的完整性。
2.引物設計根據GenBank中的CMV病毒及其衛星RNA的基因組序列及其一二級結構特點，運用Primer Primier5.0軟體設計相應引物。靶序列長度在100bp-1000bp均可進行直接擴增。上遊引物SEQ ID NO1，下遊引物SEQ ID NO2。預計產物長度為385bp。運用同樣方法設計CMV RNA3的兩對引物。一對是短片段靶序列引物，上遊引物SEQ ID NO3，下遊引物SEQ ID NO4。預計產物長度為277bp。另一對是長片段靶序列引物，上遊引物SEQ ID NO5，下遊引物SEQ ID NO6。預計產物長度為980bp。
3.反轉錄(即cDNA的合成)反轉錄體系為2μg的總RNA 4μL，5μM的下遊引物0.5μL，2.5μMdNTP 0.5μL，DEPC-H2O 1μL，將上述溶液混勻，於65℃保溫10min，冰浴5min，然後加入反轉錄緩衝液2μL、1.25U的RNA酶抑制劑0.25μL、1.25U的反轉錄酶0.25μL，將溶液混勻後置於42℃保溫60min，即可得到cDNA。
4.PCR的條件(1)反應體系cDNA在Taq酶作用下進行擴增，其反應體系為2.0U的Taq酶，cDNA模板3μL，10μM的上遊引物1.0μL，10μM下遊引物1.0μL，10倍Buffer 2μL，2.5μM的dNTP 2.0μL，用ddH2O補足20μL。
(2)反應條件採用溫度梯度PCR儀，對靶序列擴增時的退火溫度條件進行摸索。預變性5分鐘以後，選擇反應條件94℃1min、56.7℃30s、72℃1min，35個循環，最後一個循環72℃延伸10min。
5.擴增結果檢測(1)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果獲得385bp和980bp產物。
(2)PCR產物進行膠回收，獲得未知RNA病毒序列。
與實施例3比較，一次實驗成本增加1/4，時間延長95分鐘。
對照例4傳染性法氏囊病毒(IBDV)的dsRNA為例1.感病組織或細胞總RNA的提取(1)稱取0.1g感病組織，在液氮中充分研磨至粉末狀；(2)加入1ml Trizol充分勻漿2min；(3)4℃下12 000g離心10min，收集上清，去除不溶物；(4)將勻漿上清於室溫下放置5min；(5)加入0.2ml氯仿/1ml Trizol，輕微振蕩15sec後，於室溫放置2-3min；(6)4℃下12 000g離心15min，收集上清；(7)加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置10min，4℃下12 000g離心10min，棄上清(8)用800μl 70％乙醇洗沉澱，7 500g離心5min，空氣乾燥5min；(9)沉澱及時溶解於50μl DEPC-H2O中，-20℃保存；(10)取5μl總RNA溶液在1％瓊脂糖凝膠上進行甲醛變性電泳分析，檢測總RNA的完整性。
2.引物設計根據GenBank中的病毒基因組相應序列及其一二級結構特點，運用PrimerPrimier5.0軟體設計相應引物。設計的VP2基因的上遊引物為SEQ ID NO7，下遊引物為SEQ ID NO8，預計靶序列長度為1338bp。
3.反轉錄(即cDNA的合成)反轉錄體系為2μ的g總RNA 4μL，5μM的下遊引物0.5μL，2.5μMdNTP 0.5μL，DEPC-H2O 1μL，將上述溶液混勻，於65℃保溫10min，冰浴5min，然後加入反轉錄緩衝液2μL、1.25U的RNA酶抑制劑0.25μL、1.25U的反轉錄酶0.25μL，將溶液混勻後置於42℃保溫60min，即可得到cDNA。
4.PCR的條件(1)反應體系cDNA在Taq酶作用下進行擴增，其反應體系為2.0U的Taq酶，cDNA模板3μL，10μM的上遊引物1.0μL，10μM的下遊引物1.0μL，10倍Buffer 3μL，2.5μM的dNTP 2.0μL，用ddH2O補足30μL。
(2)反應條件採用溫度梯度PCR儀，對靶序列擴增時的退火溫度條件進行摸索。預變性5分鐘以後，在以下反應條件下，均可得到較好的擴增結果94℃1min、54.9℃30s、72℃1min，35個循環，最後一個循環72℃延伸10min。
5.擴增結果檢測(1)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果獲得1338bp產物。
(2)PCR產物進行膠回收，獲得未知雙鏈RNA序列，按常規方法克隆測序。
與實施例4比較，一次實驗成本增加1/4，時間延長85分鐘。
最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例子。顯然，本發明不限於以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
序列表SEQ ID NO129 cctctagagg cctgttttgt ttgttggagSEQ ID NO227 ttgagctccc gggtcctgta gaggaatSEQ ID NO321 tgtgggtgac agtccgtaaa gSEQ ID NO420 agatgtggga atgcgttggtSEQ ID NO517 gcgatgcgtg ttgagaaSEQ ID NO621 tttagccgta agctggatgg aSEQ ID NO730 atcggtaccc agattgttcc gttcatacogSEQ ID NO829 ggcgaattcc cggattatgt ctttgaagc
權利要求
1.一種快速擴增雙鏈RNA靶序列的方法，其特徵在於它的步驟為(1)dsRNA的製備從組織中提取dsRNA；(2)通過瓊脂糖電泳進行割膠回收、分離純化dsRNA；(3)根據GenBank中的病毒基因組相應序列及其一二級結構特點，運用Primer Primier5.0軟體設計設計獲得雙鏈RNA的相應引物；(4)以回收後的dsRNA為模板，添加雙鏈RNA的相應引物，在Taq酶作用下直接進行PCR擴增，獲得目的產物；PCR的條件反應體系1.5-2.5U的Taq酶，25-100ng/μL的dsRNA模板0.5μL，5-15μM的上遊引物0.5-1.5μL，5-15μM的下遊引物0.5-1.5μL，10倍Buffer 2-5μL，2.5μM的dNTP 1.6-3.2μL，用ddH2O補足20-50μL；反應條件採用溫度梯度PCR儀，對靶序列擴增時的退火溫度條件進行摸索；預變性5分鐘以後，選擇以下幾個反應條件中的一個條件94℃1min、50.2℃30s、72℃1min、35個循環、72℃延伸10min；94℃1min、52.6℃30s、72℃1min、35個循環、72℃延伸10min；94℃1min、54.9℃30s、72℃1min、35個循環、72℃延伸10min；或94℃1min、56.7℃30s、72℃1min、35個循環、72℃延伸10min。
2.根據權利要求1所述的一種快速擴增雙鏈RNA靶序列的方法，其特徵在於擴增結果用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。
3.根據權利要求1所述的一種快速擴增雙鏈RNA靶序列的方法，其特徵在於步驟(4)之後將PCR產物進行膠回收，可獲得未知dsRNA序列。
全文摘要
本發明公開了一種快速擴增雙鏈RNA靶序列的方法，步驟包括(1)dsRNA的製備；(2)通過瓊脂糖電泳進行割膠回收、分離純化dsRNA；(3)根據GenBank中的病毒基因組相應序列及其一二級結構特點，運用Primer Primier5.0軟體設計設計獲得雙鏈RNA的相應引物；(4)以回收後的dsRNA為模板，添加雙鏈RNA的相應引物，在Taq酶作用下直接進行PCR擴增，獲得目的產物。本發明以dsRNA作為模板，充分利用了dsRNA的穩定性；利用TaqDNA聚合酶既有反轉錄酶活性又有DNA聚合酶活性的特點，省去了反轉錄過程；實驗所需試劑少，操作簡單，所用時間短，達到了省時、省錢、省力的效果。
文檔編號C12Q1/68GK1940083SQ200610053618
公開日2007年4月4日 申請日期2006年9月27日 優先權日2006年9月27日
發明者陳集雙, 唐香山, 竺錫武, 陳紹寧, 劉偉俠, 廖乾生, 馮俊麗 申請人:浙江理工大學