嵌合蛋白的製作方法

2023-05-22 08:41:56 3

專利名稱：嵌合蛋白的製作方法
技術領域：
本發明嵌合蛋白藥用製劑用於治療如炎症、哮喘和腫瘤等不同疾病。
發明
背景技術：
相關申請本專利申請於美國國家知識產權局，專利優先權申請號No.US 60/618,476，2004年10月12日備案，專利申請號US 60/628,994，2004年11月17日備案，專利標題《白細胞介素1受體拮抗劑融合蛋白抑制新生血管形成》，2005年2月1日備案，全部內容參考詳細說明。
炎症是機體抵禦損傷的一種免疫反應，這些損傷可以由機械損傷，感染或抗原刺激所致。病理性炎性反應是指自體抗原非正常刺激引起炎症，去除致炎因素後的過度或持續免疫反應也會引起炎症反應。哮喘和新生血管生成相關的病症往往伴隨著炎症。已經開發了多種治療性蛋白藥物抑制炎症反應，用於治療炎症反應相關的哮喘，緩解病理性新生血管生成。然而，大多數的蛋白製劑由於療效差，有副作用或蛋白不穩定，治療效果並不理想。

發明內容
融合蛋白包含的第一片段位於氨基端，能夠特異性結合、中和第一個細胞因子或生長因子；第二片段位於融合蛋白的羧基端並且能夠特異性結合第二個細胞因子或生長因子的受體，例如在炎症部位高表達的白細胞介素1受體。這兩個片段人為地連接在一起，所對應的第一或第二種細胞因子在炎症部位高表達。
上述的融合蛋白是糖基化蛋白。它還可以包含一個用於連接第一和第二片段的連接片段，該連接片段能夠形成二聚體。例如連接片段包含免疫球蛋白的Fc片段或同功能片段。優選如下免疫球蛋白IgA，IgE，IgD，IgG，或IgM。最好是IgG或其Fc段，例如序列2片段。免疫球蛋白鏈包含序列9，11，12，14，23，或24；或來源於它們的同功能蛋白。
上述的融合蛋白中，第一片段結合且中和血管內皮生長因子，血管生成素、腫瘤壞死因子、白細胞介素18、白細胞介素4、白細胞介素6或其同功能的蛋白。例如包含免疫球蛋白鏈序列的第一片段能夠特異結合併中和血管內皮生長因子、血管生成素、腫瘤壞死因子、白細胞介素18、白細胞介素4、白細胞介素13、或IgE以及其它同功能蛋白。第一片段也可以包含血管內皮生長因子，新生血管形成因子、腫瘤壞死因子、白細胞介素18、白細胞介素4、白細胞介素13或IgE的受體序列，例如序列3，6，15，或19。
上述融合蛋白中，第二片段可以特異地結合白細胞介素1的受體。第二片段可以是白細胞介素1的拮抗劑，例如包含白細胞介素1受體拮抗劑序列(序列1)的片段或其它同功能蛋白的片段。相應地，上述的融合蛋白可以包含序列5，8，10，13，17，18，21，22，24，或25。
本發明的另一方面描述的是，包含編碼上述融合蛋白的序列的體外分離的核酸。該核酸片段可以包含從序列1至序列25中的某一序列。
本發明涉及範圍中包括(1)上述融合蛋白或編碼該蛋白的核酸序列(2)適合於藥用的載體。另外本發明也涉及包含調節患者免疫反應的方法。此方法包括鑑定由於過度炎症反應、免疫應答、或新生血管形成造成機體損傷的患者，以及使用有效劑量的融合蛋白或編碼該蛋白的核酸治療上述疾病。該藥物治療患者可能已經或準備接受異基因或異種移植。實例病症包括炎症疾病、自身免疫疾病、過敏性疾病或是腫瘤疾病。在治療依賴新生血管形成的腫瘤疾病時，融合蛋白包含序列24。
另外一方面，發明的特點還有提高重組蛋白在患者的體內半衰期的方法。該方法包括將重組蛋白與包含序列1片段或同功能的其它蛋白片段融合，形成融合蛋白嵌合體，該方法決定了融合蛋白在患者體內的半衰期。重組蛋白能夠結合某一細胞因子或生長因子。
本發明的特點還包括提高重組蛋白於患者體內的功效的方法。該方法包括將重組蛋白與包含序列1的片段或同功能的其它蛋白片段連接，形成融合蛋白嵌合體。該方法決定了融合蛋白在患者體內的功效。具體講，在患者體內炎症部位或高表達白細胞介素1受體的疾病部位，融合蛋白嵌合體能夠同時結合且中和白細胞介素1受體和其他細胞因子或生長因子。另外一方面，在患者體內炎症部位或高表達白細胞介素1受體的疾病位點，融合蛋白嵌合體可以中和或拮抗白細胞介素1以及其他細胞因子或生長因子的生物活性。
本發明特徵中的另外一方面包括治療蛋白可以靶向性地投送到患者體內的藥物靶點。該方法包括將治療蛋白與包含序列1的片段或同功能的其它片段融合，形成融合蛋白嵌合體，以及將融合蛋白嵌合體注射給需要治療的患者的方法。治療蛋白的靶向位點是高表達白細胞介素1受體的炎症疾病位點。具體說，包含序列1或同功能蛋白的片段與白細胞介素1受體結合，重組蛋白是治療蛋白，可以結合且中和某一細胞因子或生長因子。
分離的多肽指是指不含自然狀態下與其結合的分子，它的純度至少為75％，也就是在75％至100％(乾重)之間。它的純度可以通過合適的標準方法，例如柱層析、聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相色譜進行測定。本發明所指分離的多肽可以從天然來源提取(野型多肽)，通過DNA重組技術表達，或是通過化學合成的方法獲得。核酸可以指DNA分子(cDNA或基因組DNA)，RNA分子(mRNA)以及DNA或RNA的類似物，DNA或RNA的類似物可以利用核苷類似物合成。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但一般首選雙鏈DNA。分離的核酸是指其結構與任何一種天然核酸或天然的基因組核酸片段都不同。這一概念包括如下幾個方面，例如a)DNA包括天然基因組DNA分子的部分序列，但是不包含自然情況下生物基因組序列中該基因片段的旁側序列。b)整合在載體或原核、真核生物基因組DNA內的核酸分子，與天然的載體或基因組DNA有所不同。c)體外分離的分子比如cDNA、基因組片段、PCR擴增片段，限制酶消化片段，d)重組核苷酸序列是雜合基因的部分序列，這部分基因可以編碼融合蛋白。本發明的多肽蛋白就是用上述的核酸分子表達的。為此，研究人員可以通過將上述的核酸分子與合適的調控序列連接構建表達載體。
載體是指能夠將與其相連接的其他核酸序列進行轉移的核酸分子。該載體可以進行自我複製或整合於宿主DNA。載體可以包含質粒載體、柯斯載體或病毒載體。載體包含一段核酸片段，該核酸片段能夠在宿主細胞表達。載體內包含一個或多個的調控序列，與要表達的核酸序列相連接。調控序列包括啟動子、增強子、以及其它表達控制元件(例如多聚腺苷酸信號)。調控序列包擴引導某一核酸序列組成型表達、組織特異性表達和/或可誘導表達的調控元件序列。表達載體的設計取決於以下幾個因素待轉化的宿主細胞，待表達的蛋白或RNA的表達水平或其他類似因素。表達載體可以被引入宿主細胞表達本發明介紹的多肽蛋白。發明還涉及含有上述核酸的宿主細胞。宿主細胞包含大腸桿菌、昆蟲細胞(例如應用杆狀病毒表達載體)、酵母、哺乳動物細胞，參見Goedd等在酶學方法叢書中的文章，基因表達技術(1990年，185頁)。為表達本發明所述多肽蛋白，我們可以使用培養基在特定的條件下培養宿主細胞，讓宿主細胞表達核酸編碼的多肽蛋白，再從細胞或細胞培養液中純化目標蛋白。或者將本發明提到的核酸利用T7啟動子和T7聚合酶進行體外表達。
蛋白因子的同功能蛋白指來自於該蛋白的多肽，例如該蛋白具有一個或多個的點突變、插入突變、缺失突變、截短突變、融合蛋白、或以上突變的組合。同功能蛋白完全保留了該蛋白的活性，例如與細胞因子、生長因子、或其受體分子結合的能力。
本發明的詳細具體說明內容在下面的說明中闡述。本發明的其它特徵，目的以及優勢將在下面的描述以及權利要求說明書詳細說明。
說明書


圖1表達TNFRII-Fc和TNFRII-Fc-IL-1ra融合蛋白的第一代CHO細胞克隆，細胞培養於含無血清培養基的24孔培養板中，直接考馬斯亮藍蛋白染色，所有重組蛋白的表達明顯可見，表達量0.5-1.0ug蛋白，每孔上樣量為10-15微升/孔。
圖2親和層析純化TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合蛋白，在還原和非還原條件下進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，蛋白用考馬斯亮藍染色。
圖3我們解決問題能力的一個例子通過改變第一步純化條件抑制了嵌合蛋白TNFRII-Fc-IL-1ra降解的問題。高效液相色譜分析純化未降解和部分降解的TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合蛋白，以TNFRII-Fc作對照。
圖4親和層析純化IL-4R-Fc、IL-4R-Fc-IL-1ra、IL-18bp-Fc-IL-1ra。
圖5TNFα細胞中和實驗顯示TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合體蛋白能夠中和TNFα對L979細胞的殺傷活性。這一點與上市藥物TNFRII-Fc(Enbrel)相似。
圖6白細胞介素1細胞中和實驗顯示，上市藥物白細胞介素1受體拮抗劑(Kineret)和TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合蛋白都能夠中和白細胞介素1刺激D10細胞增殖的生物活性。
圖7人白細胞介素4中和實驗測定IL-4R-Fc-IL-1ra和對照組的IL-4R-Fc的活性。
圖8人白細胞介素1中和實驗測定IL-4R-Fc-IL-1ra的活性。
圖9白細胞介素18中和實驗測定IL-18bp-Fc-IL-1ra.的生物活性。
圖10白細胞介素1中和實驗測定IL-18bp-Fc-IL-1ra.的生物活性。
圖11利用D10細胞檢測VEGFR1-Fc-IL-1ra融合蛋白中和白細胞介素1的活性。
圖12VEGFR1-Fc-IL-1ra蛋白在HUVE細胞中和血管內皮生長因子活性。
圖13白細胞介素1受體結合實驗。
本發明詳細內容描述本發明的理論基礎至少在一部分上在於發現白細胞介素1受體拮抗劑或其同功能蛋白，與其他生物活性蛋白如抗炎症蛋白、抗哮喘蛋白、抗新生血管生成蛋白融合，能夠延長這些細胞因子的生物半衰期及其生物學功效。這些功能蛋白包括腫瘤壞死因子(TNF)中和分子、白細胞介素18中和分子、白細胞介素4/白細胞介素13中和分子、血管內皮生長因子中和分子以及血管生成素中和分子。
蛋白(位於融合蛋白的氨基端)與其他活性蛋白融合往往導致活性缺失，尤其是在大分子蛋白融合上會更加的明顯。例如，在酶原和激素前體分子中由於氨基端多肽的存在導致酶原和激素前體分子無活性。這些酶原和激素前體分子只有在這些氨基端多肽結構被切掉後才表現為活性分子。而且，大分子蛋白融合往往會導致低表達量。但是出乎意料的是，白細胞介素1受體拮抗劑融合蛋白可以通過哺乳動物細胞表達，可以達到產業化化生產的表達水平。與其他蛋白融合之後不會影響白細胞介素1受體拮抗劑結合白細胞介素1受體以及中和其活性的生物學功能，也不會影響與其融合的其它活性蛋白的結合、中和活性。同樣出乎意料的是，白細胞介素1受體拮抗劑(哺乳動物表達的糖基化蛋白)以及其同功能蛋白不僅可以延長活性蛋白的半衰期，還可以引導融合蛋白定位於高表達白細胞介素1受體的炎症位點。
白介1受體拮抗劑白細胞介素1是一種由巨噬/單核系細胞產生的細胞因子，它以兩種形式存在白細胞介素1α和白細胞介素1β。它通過結合細胞特異性白細胞介素1受體(IL-1R)而引發其生物學效應。白細胞介素1受體常常是表達在白細胞介素1敏感細胞的細胞膜表面。
白細胞介素1受體拮抗劑(IL-1ra)是人體內蛋白，白細胞介素1的天然抑制物。白細胞介素1受體拮抗劑已經用於抑制白細胞介素1的生物活性。它結合細胞膜結合型白細胞介素1受體從而抑制白細胞介素1結合同一白細胞介素1受體。白細胞介素1受體往往表達在炎症位點(Deleuran et al，1992；Laken VD et al，1997)和淋巴細胞(Dower SK et al，1990)。因此，白細胞介素1受體拮抗劑可以引導與其融合的治療性蛋白(如下面將描述的腫瘤壞死因子中和分子)到高表達白細胞介素1受體的炎症部位。由於其具有靶向性效應，所以可以減少治療蛋白所需的應用劑量，從而相應的減少副作用或增加藥物療效。此外，至少在一部分上，由於融合蛋白可以使白細胞介素1受體拮抗劑和與其相融合的蛋白同時到達某一位點，由於二者的協同作用，相對二者單獨或聯合應用，融合蛋白可以具有更好的治療效果。
本發明可以通過白細胞介素1受體拮抗劑和其同功能蛋白來驗證。白細胞介素1受體拮抗劑同功能蛋白是指來源於白細胞介素1受體拮抗劑(序列1)的多肽(如簡介中所述)，它具有白細胞介素1受體拮抗劑的生物活性，即結合白細胞介素1受體並抑制白細胞介素1與該受體的結合。白細胞介素1受體拮抗劑及其同功能蛋白至少包含一個白細胞介素1的受體拮抗劑結構域，該結構域能夠特異性結合白細胞介素1受體家族成員並且抑制白細胞介素及其家族成員誘導的這些受體的活化。白細胞介素1受體家族包含多個成員。相應地，也就有幾種不同的白細胞介素家族的激動劑和拮抗劑。這些白細胞介素1拮抗劑不一定結合同一白細胞介素1受體家族成員。本發明所指的白細胞介素1受體拮抗劑用來代表所有能夠結合白細胞介素1受體家族成員和/或中和白細胞介素1家族成員活性的白細胞介素1拮抗劑。
白細胞介素1受體拮抗劑同功能蛋白包含一個白細胞介素1受體拮抗劑結構域。該結構域是指能夠特異性結合白細胞介素1受體家族成員，從而抑制白細胞介素1及其家族成員對細胞受體的活化。白細胞介素1受體拮抗劑可以包括IL-1ra(美國專利號6,096,728)、IL-1 HY1或白細胞介素家族成員5(美國專利號6,541,623)、IL-1Hy2或白細胞介素家族成員10(美國專利號6,365,726)、IL-1raβ(美國專利號6,399,573)、其它白細胞介素1拮抗劑成員或其同功能的蛋白，也就是來源於白細胞介素1受體拮抗劑的多肽蛋白，例如有一個或更多的點突變、插入、缺失、截短或以上幾種突變的組合。它們充分保持了特異性結合白細胞介素1受體並抑制白細胞介素1活化其細胞膜表面受體的活性。這些蛋白包含序列1或序列1的某片段。白細胞介素1受體拮抗劑最好是來源於哺乳動物細胞的糖基化多肽。白細胞介素1受體拮抗劑的活性可以通過使用白細胞介素1依賴的D10細胞(見例3)進行白細胞介素1細胞中和實驗以及其它白細胞介素1家族成員的中和實驗來檢測。
白細胞介素1受體拮抗劑或其同功能蛋白最好是糖基化蛋白。天然的白細胞介素1受體拮抗劑具有兩個N-link的糖基化位點(美國專利號6096728)。這兩個N-link糖基化位點對於白細胞介素1受體拮抗劑的體內活性，尤其是生物學半衰期和它的血清蛋白結合特性有重要作用。大腸桿菌表達的白細胞介素1受體拮抗劑Kineret缺乏翻譯後修飾。結果造成了它明顯地與人血清蛋白結合，表現為較低的體內活性。
使用白細胞介素1依賴細胞D10細胞進行細胞中和實驗，或其他標準白細胞介素1家族成員中和實驗可以檢測白細胞介素1受體拮抗劑和同功能蛋白的抑制活性(見例3)。白細胞介素1受體拮抗劑融合與任何蛋白融合可增加蛋白的分子量並提高體內的生物半衰期。白細胞介素1受體拮抗劑通過免疫球蛋白的Fc段(例如IgG1的Fc段)融合到其它蛋白上，能夠進一步增加分子量，由於IgG1的Fc片段具有形成二聚體的能力，它的存在能夠加倍提高蛋白在某一特定靶位的分布比例。
腫瘤壞死因子腫瘤壞死因子α和腫瘤壞死因子β是哺乳動物細胞分泌的蛋白，對多種細胞進行具有廣泛的作用。這兩種細胞因子在功能和結構上具有很多的相似之處，所以他們都叫作TNF。
TNF通過結合TNF-敏感細胞的膜表面特異性TNF受體而發揮其生物功能。目前所知TNF受體有兩種的形式，即分子量為55千道爾頓的I型受體(TNFRI)和分子量為75千道爾頓的II型受體(TNFRII)。TNFRI和TNFRII都能夠結合TNFα和TNFβ。
目前TNF在炎症疾病的作用已很確定。TNFRII與人IgG1 Fc片段融合(商品名Enbrel)，已經用於治療某些包括TNF依賴的疾病如類風溼性關節炎和牛皮癬。可溶性TNFRI(Onercept，Serono)已經進行臨床實驗用於治療牛皮癬。
已經被確認了幾種TNF拮抗劑。這些拮抗劑，如可溶性TNFRII可以結合TNF，並抑制TNF與TNF受體的結合。這些蛋白可以用來抑制由TNF所引發的生物學活性。TNF中和蛋白可以和白細胞介素1受體拮抗劑或其同功能的蛋白融合。類似於白細胞介素1，TNF也是炎症反應中重要的介質。上述的TNF中和蛋白的靶蛋白包括TNF及其同功能蛋白。這些蛋白都包括一個或多個TNF中和結構域，該結構域能夠中和TNF，也就是抑制TNF活性。TNF中和結構域包括人TNFRII的細胞外結構域、TNFRI的細胞外結構域、或是抗TNF抗體的可變區。這樣的例子包括TNFRII的胞外結構域、TNF結合蛋白1(rhTBP-1)、TNFRI胞外結構域、人源化的抗TNF抗體和抗TNF的嵌合抗體。
TNFα和白細胞介素1是炎症疾病部位的兩種主要的介質，TNF拮抗劑和白細胞介素1受體拮抗劑或它們同功能的蛋白的融合或嵌合分子既可以用來阻斷TNFα也可以阻斷白細胞介素1的通路，所以比二者單獨使用更有效地治療急、慢性炎症相關疾病。融合蛋白中TNF中和分子的活性可以使用TNF依賴細胞如L979 cell(ATTC)來檢測。TNF依賴細胞可以被重組TNFα殺死。TNF中和蛋白可以中和這種TNF依賴活性，中和蛋白活性也可以應用TNF體外結合實驗來檢測。
同時使用白細胞介素1受體拮抗劑和TNF受體1(不是受體2)曾經用於治療白細胞介素1和TNFα導致的疾病試驗。然而，2003年Immunex Inc和Amgen Inc公司在進行臨床實驗242個病例，治療24周後的結果顯示，同時使用Enbrel和Kineret的正常劑量(Enbrel 25mg兩周一次、Kineret 10mg每天一次，摩爾比大約為1∶12)治療，結果顯示聯合使用並不會增加療效，反而較Enbrel或Kineret單獨使用增加了感染和中性粒細胞減少症發生的機率。
白細胞介素18和白細胞介素4上述的白細胞介素1受體拮抗劑或其同功能的蛋白可以與其它抗炎症、抗哮喘、抗血管生成的蛋白融合。實例包括(i)白細胞介素18中和分子如白細胞介素18結合蛋白(IL-18bp)、白細胞介素18受體(IL-18R)胞外區、人源化抗白細胞介素18抗體。(ii)白細胞介素4中和分子如白細胞介素4受體(IL-4R)胞外區(商品名Nuvance，Immunex公司)、人源化抗白細胞介素4抗體(Protein Design Labs)。(iii)抗血管內皮細胞生長因子抗體和血管生成素中和分子(可溶性Tie2胞外區)。如那時討論的那樣，這些蛋白的碳端引入白細胞介素1受體拮抗劑(1)增加它們的分子量(2)在哺乳動物宿主細胞表達蛋白時，增加兩個糖基化位點(3)靶向性將這些蛋白投送到高表達白細胞介素1受體的炎症位點。(4)以分子比1∶1同時阻斷白細胞介素18、白細胞介素4、血管內皮細胞生長因子或血管生成素以及白細胞介素1分子的生物學功能。
重組人白細胞介素18結合蛋白已經由Serono公司開展臨床實驗治療皮膚炎症性的適應症牛皮癬。已經證明白細胞介素18結合蛋白的安全性。白細胞介素1受體拮抗劑融合在其碳端可以明顯增加其生物活性持續時間。通過與白細胞介素1受體拮抗劑的融合能夠增加其炎症位點的靶向性而顯著增加療效。用白細胞介素1受體拮抗劑融合蛋白同時阻斷白細胞介素18和白細胞介素1具有協同效應，可以用於治療炎症疾病如牛皮癬(Yudoh K等，2004年的研究結果)。最有趣的是，白細胞介素18和白細胞介素1的受體同屬白細胞介素1受體家族，而且幾乎是通過同樣的信號轉導通路發揮其生物學作用。雙重阻斷白細胞介素1和白細胞介素18幾乎可以阻斷整個白細胞介素1受體家族所引起的炎症進程。本發明所述嵌合蛋白雙重阻斷白細胞介素1和白細胞介素18表現為治療炎症疾病的最有效的藥用製劑。
白細胞介素18結合蛋白的同功能蛋白也可以用於本發明中。白細胞介素18結合蛋白或其同功能蛋白包含白細胞介素18中和結構域，該結構域可以中和白細胞介素18，也就是抑制白細胞介素18的生物活性。例如，白細胞介素18中和蛋白結構域可以包括人白細胞介素18受體胞外區(美國專利號6,589,764)，白細胞介素18結合蛋白、抗白細胞介素18抗體或白細胞介素18突變拮抗劑蛋白。
本發明所述的嵌合蛋白中的白細胞介素18中和蛋白活性，可以用白細胞介素18依賴細胞株KG-1細胞檢測。例如，人白細胞介素18在TNFα存在的條件下以劑量依賴的方式誘導KG-1細胞分泌IFN-g。這種白細胞介素18依賴的IFN-g分泌可以被有效劑量的白細胞介素18中和蛋白所抑制。這些白細胞介素18中和蛋白的活性，也可以通過白細胞介素18/白細胞介素18受體結合實驗來檢測。
重組白細胞介素4受體正在進行臨床實驗治療哮喘，已經證明其良好的安全性。然而，它的療效還不是很讓人滿意。有趣的是，有研究報導白細胞介素1可以誘導Th2細胞的活化以及氣道過敏反應(Iwakura Y等，2003年)。另外，哮喘和慢性炎症之間共存、相互依賴以及相互作用在臨床上是很普遍的現象。至少在動物模型上，阻斷白細胞介素1的功能以治療哮喘的效果是明確的。完全有理由認為將IL-1ra和IL-4受體融合以1∶1的分子比同時阻斷白細胞介素1和白細胞介素4，可以明顯的提高治療哮喘的療效。IL-1ra靶向定位於炎症位點可以提高可溶性IL-4受體治療複合炎症的嚴重哮喘的療效。另外，白細胞介素1受體拮抗劑融合蛋白可以顯著提高白細胞介素4受體的生物活性持續時間。
可溶性白細胞介素4受體或其同功能蛋白可以與白細胞介素1受體拮抗劑融合。白細胞介素4受體或其同功能蛋白包含白細胞介素4中和結構域，該結構域能夠中和白細胞介素4，也就是抑制白細胞介素4活性。例如，白細胞介素4中和結構域包括白細胞介素4受體胞外區，抗白細胞介素4抗體，含有雙突變R121D/Y124D序列(Schnarr等，1997年)的白細胞介素4突變蛋白拮抗劑。有趣的是，白細胞介素4受體亞單位不僅可以結合白細胞介素4，也能夠結合白細胞介素13，這是因為白細胞介素4和白細胞介素13的受體具有共同亞單位的天然特點。
本發明所述融合蛋白的白細胞介素4中和活性的可以用白細胞介素4的依賴細胞TF-1檢測。例如，加入有效劑量的IL-4中和蛋白可以抑制白細胞介素4依賴的TF-1細胞增殖。白細胞介素4中和蛋白的活性也可以通過白細胞介素4/白細胞介素4受體的結合實驗來檢測。
血管內皮生長因子和血管生成素上述方法可以應用於血管內皮生長因子以及血管生成素和它們的同功能蛋白的拮抗劑。血管內皮生長因子對於新生血管生成有重要的作用。抗血管內皮生長因子抗體(商品名Avastin，Genentech Inc)可以用於治療腫瘤疾病。同樣，血管內皮生長因子受體的胞外區與IgG1 Fc段融合，已經用於中和血管內皮生長因子來治療新生血管生成相關適應症。血管內皮生長因子同功能蛋白包含血管內皮生長因子中和結構域，該結構域可以中和血管內皮生長因子，也就是抑制血管內皮生長因子的活性。例如，血管內皮生長因子中和蛋白結構域包括人血管內皮生長因子受體胞外區和抗血管內皮生長因子抗體的可變區。
本發明提到的嵌合蛋白中血管內皮生長因子中和蛋白的活性可以用血管內皮生長因子依賴的HUVEC細胞來檢測。例如，人血管內皮生長因子可以誘導HUVEC細胞增殖。有效劑量的血管內皮生長因子中和蛋白可以抑制血管內皮生長因子依賴的HUVEC細胞增殖。血管內皮生長因子中和蛋白的活性，也可以通過血管內皮生長因子/血管內皮生長因子受體結合實驗來檢測。
有研究指出可溶性血管生成素受體Tie2可用作抗血管生成反應製劑治療腫瘤或新生血管生成反應相關的類風溼性關節炎。臨床觀察很早就發現，新生血管生成和炎症是共存和相互依賴的。最普遍的例子就是在類風溼性關節炎，新生血管生成伴隨著炎症發生。可溶性血管生成素受體Tie2或其同功能蛋白包含血管生成素中和結構域，該結構域能夠中和血管生成素，也就是能夠抑制血管生成素1的功能。例如，血管生成素中和結構域包括人Tie2胞外區和抗Tie2抗體或抗血管生成素抗體。
本發明提到的嵌合蛋白中Tie-2中和蛋白的活性可以用依賴細胞HUVEC來檢測。例如，人血管生成素1能誘導HUVEC細胞的磷酸化。這種Tie-2依賴的磷酸化作用可以被有效劑量的Tie-2中和蛋白所抑制。Tie-2中和蛋白的活性也可以用Tie-2/血管生成素2結合實驗檢測。
已知白細胞介素1是病理性血管形成的重要刺激因素。在動物模型中，白細胞介素1受體拮抗劑或其同功能蛋白中和白細胞介素1能夠抑制新生血管形成和腫瘤生長，提示炎症可能促進新生血管形成。例如，惡性乳癌是炎症性乳癌。很有可能在治療腫瘤或類風溼性關節炎方面，白細胞介素1受體拮抗劑和抑制新生血管形成蛋白(抗血管內皮生長因子抗體、可溶性VEGF受體胞外區、可溶性Tie2胞外區)融合蛋白的療效要明顯好於單獨使用抗新生血管形成的製劑。
除了上述治療製劑，其它適於與白細胞介素1受體拮抗劑或其同功能蛋白相融合的治療製劑在下面列出1.E25(olizumab).E25是人源化抗IgE抗體(Novartis)，用於治療過敏性哮喘，季節性過敏性鼻炎。
2.H5G1.1.5G1.1是一種人源化抗C5抗體(Alexion Pharmaceuticals)，可以被應用於治療牛皮癬和自身免疫性疾病。
3.TP10.TP10是一種可溶性的補體受體(sCR1)，用於治療急性呼吸窘迫綜合症和器官移植(AVANT Immunotherapeutics)。
4.ABX-IL8.ABX-IL8是一種抗白細胞介素18的單克隆抗體(Abgenix)，用於治療牛皮癬。
5.CTLA4Ig.CTLA4Ig是一種重組的可溶性受體(Bristol-Myers Squibb)，用於免疫抑制。
在上述因子和白細胞介素1受體拮抗劑或其同功能蛋白形成的融合蛋白中，兩種分子的功能具有協同或互補性。白細胞介素1受體拮抗劑結合白細胞介素1受體，引導融合蛋白定位於高表達白細胞介素1受體的炎症部位。它也可以中和白細胞介素1活性。白細胞介素1受體拮抗劑與以上任一種蛋白融合可以用於治療炎症、哮喘、血管生成相關疾病或內皮細胞增殖相關的疾病。
新生血管生成相關疾病是指需要新生血管生成或表現為新生血管反應的病理症狀。其中包括，但不僅限於癌症、實體瘤、腫瘤轉移、良性腫瘤，包括血管瘤、聽神經瘤、神經纖維瘤、沙眼和化膿性肉芽腫塊、類風溼性關節炎，牛皮癬，眼部疾病如糖尿病性視網膜病，早產兒視網膜病，黃斑退化，眼角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶體纖維增生和發紅，Osler-Webbe綜合症、心肌新生血管生成、斑狀血管形成、毛細血管擴張、血友病關節、血管纖維瘤和創傷性肉芽組織增生。在這裡，內皮細胞增殖反應症狀包括，但不僅限於粘連腸、動脈粥樣硬化、硬皮病和肥厚性瘢痕。這裡描述的融合蛋白也可以通過抑制胚胎著床所需的新生血管形成來治療以上所述疾病。
本發明提到的融合蛋白最好包含一個二聚化結構域。二聚化結構域指的是能夠將兩個多肽偶連在一起的結構域。例如，它包含IgG Fc段(也就是人的IgG重鏈恆定區)。這樣的Fc段的例子包括序列2。IgG Fc段通過半胱氨酸殘基形成鏈內二硫鍵(共價鍵)而形成二聚體。有時非共價鍵二聚化可以在沒有二硫鍵參與的情況下形成。二聚化的IgG Fc段使融合蛋白嵌合體表現為，氮端為二個功能性TNFII型受體或可溶的白細胞介素4受體、白細胞介素18結合蛋白或可溶的Tie-2分子，碳末端為兩個功能性白細胞介素1受體拮抗劑分子。這種排列能夠在體內提高受體/配體結合的機會以更有效地中和TNF alpha、白細胞介素4、白細胞介素18或血管生成素和白細胞介素1受體。
通過二硫鍵形成的共價二聚化活性可以通過還原和非還原SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳來檢測。二聚體蛋白分子量在還原條件下分子量會減少一半。非共價鍵的二聚化可以在非變性和變性的條件下電泳來檢測，在這種情況下二聚體蛋白的分子量在變性條件下會減少一半。
本發明提到的多肽，TNF中和結構域，或白細胞介素4/白細胞介素13中和結構域，或白細胞介素18中和結構域，或血管內皮生長因子中和結構域，或血管生成素中和結構域和白細胞介素1受體拮抗劑結構域可以通過一定方法連接在一起。在這裡，連接是指融合後多肽的各個結構域之間的構象不會相互影響，也就是保持各自的活性。例如白細胞介素4中和結構域保持其中和白細胞介素4的活性，白細胞介素1受體拮抗劑結構域保持其特異結合白細胞介素1受體，阻斷白細胞介素1活化細胞受體的活性。二聚化結構域保持其促使兩個本發明所述的融合蛋白聚合在一起，即兩個白細胞介素4受體胞外區域在氮末端，兩個白細胞介素1受體拮抗劑分子在碳末端。
白細胞介素1受體拮抗劑置於碳端與上述的TNF中和蛋白，白細胞介素18中和蛋白、白細胞介素4中和蛋白、血管內皮生長因子中和蛋白、血管生成素中和蛋白融合形成融合蛋白，具有以下特點(1)提高分子量。(2)用哺乳動物作為宿主細胞表達時，白細胞介素1受體拮抗劑分子上額外增加了兩個糖基化位點。(3)將與白細胞介素1受體拮抗劑融合的中和分子靶向投送到高表達白細胞介素1受體的炎症位點。(4)以分子比1∶1的比例同時封閉白細胞介素1和下列任一蛋白TNF、白細胞介素18、白細胞介素4、白細胞介素13、IgE、血管內皮生長因子、血管生成素。這種雙重阻斷可以提高治療炎症疾病的療效，並且可以更加徹底地阻斷炎症疾病的發展進程。對於某些疾病，炎症和哮喘或血管生成反應的共存或互相依賴在疾病發展起重要作用，所以同時雙重阻斷白細胞介素4/白細胞介素13/血管內皮生長因子/血管生成素和白介1可以更有效、更徹底地治療這樣的疾病。
本發明提及的多肽物質可以用合成或重組表達的方法來獲得。為製備重組多肽，將編碼該多肽的核酸序列與表達融合多肽的核酸序列相融合，例如穀胱甘肽巰基轉移酶、6x-組氨酸表位標籤或M13基因3蛋白的核酸序列連接在一起。得到的融合核酸序列在適當的宿主細胞中表達融合蛋白，進行純化獲得重組融合蛋白。許多宿主-表達載體系統可用於表達融合蛋白。其中包括但不僅限於，轉化了重組噬菌體DNA、質粒DNA、粘粒DNA表達載體的細菌；轉化了重組酵母表達載體的酵母菌；攜帶重組病毒或質粒表達載體的人源細胞系。利用傳統的方法包括製備性色譜，單克隆或多克隆抗體等免疫學分離方法進行分離純化重組多肽或其片段。所獲得的重組多肽可以進一步處理，例如用酶消化來去除表達標籤分子，獲得本發明所指的重組多肽。
組成與治療方法本發明的領域還包括通過給患者注射有效劑量的本發明融合蛋白來治療過度免疫反應疾病、血管生成反應相關疾病的方法。本發明所指融合蛋白製劑的適用人群包括已經或進行性的過度或異常免役反應所累的患者，例如自身免役、免役排斥、過敏性疾病、免疫細胞來源腫瘤疾病的患者。本方法可以單獨使用或與其它藥物或治療方法聯合使用。
治療是指給患者注射藥用製劑來治癒、減輕、緩和、預防、改善疾病的症狀、疾病綜合症、繼發症或易感體質。治療的有效劑量是指在用藥的患者體內獲得滿意的療效的劑量。滿意的療效可以是客觀的(用某些檢查或標誌來判斷)，也可以是主觀的(患者的表現或感覺)。治療疾病的範圍包括急慢性炎症、糖尿病、關節炎(包括類風溼性關節炎、幼年類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病性關節炎)、多發性硬化症、腦脊髓炎、重症肌無力症、全身性紅斑狼瘡、自身免疫性甲狀腺炎、皮炎(包括遺傳性過敏性皮炎和溼疹性皮炎)、牛皮癬、Sjgren′s綜合症、節段性腸炎、口腔潰瘍、虹膜炎、結膜炎、角膜結膜炎、I型糖尿病、炎性腸疾病、潰瘍性結腸炎、哮喘、過敏性哮喘、皮膚紅斑狼瘡、硬皮病、陰道炎、藥疹、麻風反覆反應、麻風結節性紅斑、自身免疫葡萄膜炎、過敏性腦脊髓炎、急性腦出血、感覺神經性聽力喪失、發育貧血症、純紅細胞性貧血、原發性血小板減少、多軟骨炎、肉芽腫瘤、慢性肝炎、史-約症候群、口炎性腹瀉、扁平苔癬、Graves』病、良性淋巴肉芽瘤、早期膽汁性肝硬化、葡萄膜炎、肺間質纖維症、移植物抗宿主病；移植類包括異體或異基因組織移植如骨髓移植、肝移植或是其它器官或組織移植。變態反應疾病如異位性變態反應、愛滋病、淋巴細胞腫瘤如白血病、淋巴瘤、急性肝炎、新生血管生成相關疾病如類風溼性關節炎和腫瘤，心血管疾病。.
上述一種或幾種症狀的患者可以應用本發明藥用製劑治療。診斷這樣的患者可以由患者的感覺或職業醫護人員的判斷來提供，可以是主觀的(感覺)或客觀的(測試或檢驗的結果)。
體內途徑中，將含有本發明融合蛋白的製劑給患者使用。通常，蛋白溶於藥用載體(如生理鹽水)通過口服、靜脈輸注、皮下植入或注射、肌肉注射、鞘內注射、腹膜內注射、直腸內注射、鼻內注射、葉鞘內注射、子宮內注射、氣管內注射、灌胃、肺內注射給藥。
根據給藥途徑、製劑特性、患者症狀及適應症、患者的體型大小、體重、體表面積、年齡和性別以及其他正在應用的藥物來選擇給藥劑量，或者遵從醫生的判斷。適當的劑量範圍在0.01-100.0mg/公斤體重。考慮到不同的劑型構成以及不同的給藥方式造成的不同藥物利用度，給藥劑量根據實際情況進行調整。例如，口腔給藥就要比靜脈注射的給藥量要高。用藥劑量的改變可以根據標準的經驗進行優化。尤其對於口服，利用合適的包封製劑載體(例如多聚微顆粒或可植入裝置)，可能會提高藥物投送的效率。
本發明也包括的藥用製劑即可用的藥用載體製劑以及有效劑量的本發明所提融合蛋白。此載體製劑可用於治療上述疾病。藥用載體可以包括溶劑、分散劑、包衣、抑菌劑、抗真菌劑、等滲緩衝劑、吸收緩釋劑。本發明的藥物根據不同給藥途徑通過經典的方法製作不同劑型的治療製劑。例如，可以製成膠囊、凝膠劑、片劑用於口腔給藥。膠囊製作材料包括標準藥用的明膠或纖維素。片劑的製作材料包括標準常用的藥用的固體填充、潤滑劑，固體填充劑包含澱粉、糖、皂土。製劑也可以是以硬殼片劑或含乳糖、甘露醇、傳統常用的填料及製片劑的膠囊。藥物經非腸道途徑給藥。這類途徑的例子包括水針、生理鹽水輸液、5％葡萄糖活性製劑，或其他常見藥用賦形劑。環糊精、或是我們熟悉的其它溶液製劑，可用作賦形劑使藥物成為治療製劑。
本發明的藥物製劑可以通過體內和體外兩種方式檢測。參見以下實例。簡單的說，體外測活的原理是檢測蛋白製劑能否體外抑制免疫應答。體內測活是通過將藥物注射入動物體內(也就是動物模型)，檢測治療效果。以此結果為基礎，確定適當的給藥劑量範圍和給藥途徑。
以下實例僅僅用於說明，而不限於以任何方式進行繼續應用和開發。根據我們在此的描述，領域內的研究人員不需要進一步的詳細解釋就能夠最大程度地應用本發明所述方法。所引用的文獻僅限於參考。
我們的結果也表明利用哺乳動物宿主細胞表達的白細胞介素1受體拮抗劑融合分子，包含糖基化的白細胞介素1受體拮抗劑，它的分子量較非白細胞介素1受體拮抗劑融合分子有所增加。它們的生物活性持續時間也有所增加，而注射所需有效劑量及所需用藥次數均有所減少。由於其能夠靶向性作用於炎症發病位點以及低有效劑量和低用藥頻率的特點，白細胞介素1受體拮抗劑融合蛋白與非白細胞介素1融合蛋白或相應的治療蛋白與白細胞介素1受體拮抗劑的聯合使用相比，副作用較小。
本發明的
具體實施例方式實施例1我們構建了各種不同的表達載體，來表達編碼下面的蛋白A)TNFRII-Fc-IL-1ra(序列5)，TNFRI-Fc-IL-1ra(序列8)和對照TNFRII-Fc(序列4)或TNFRI-Fc(序列7)；B)Humira(D2E7)-IL-1ra(序列10和11)，Remicade(cA2)-IL-1ra(序列13和14)以及對照二聚化Humira(序列9和11)，和Remicade(cA2)(序列12和14)；C)IL-18bp(序列15)，二聚化IL-18bp-Fc(序列16)，和二聚化IL-18bp-Fc-IL-1ra(序列17)；D)可溶性IL-4R胞外區結構域(序列19)，IL-4R-Fc(序列19)，和IL-4R-Fc-IL-1ra(序列21)；E)VEGFR1-Fc-IL-1ra和輕鏈(序列24、23)，以及抗VEGF重鏈-IL-1ra和輕鏈(序列25、23).
大多數編碼蛋白(序列號4-25)的重組子進行了DNA序列測定而且在哺乳動物細胞系進行表達。序列4-25利用天然或優化的密碼子，以及人工合成的或天然分泌信號序列在馴化的能夠懸浮培養的哺乳動物宿主細胞中表達。通過非加熱SDS凝膠電泳和Westernblot免疫印記法檢測到了含有抗體片段的二聚化重組表達產物。
應用無血清培養基，在24孔細胞培養板內TNFRII-Fc(序列4)和TNFRII-Fc-IL-1ra(序列5)的表達滴度可以分別達到50mg-100mg/L。用直接考馬斯亮藍染色法檢測條件培養液中蛋白含量的方法顯示在馴化的能夠懸浮培養的CHO K1細胞中，TNFRII-Fc-IL-1ra表達量要高於TNFRII-Fc。這也表明通過哺乳動物細胞來表達含有白細胞介素1受體拮抗劑的嵌合蛋白可以達到高水平表達，足以達到商業生產要求。
實施例2我們進行了放大培養、純化TNFRII-Fc-IL-1ra、IL-4R-ECD-Fc-IL-1ra、IL-18bp-Fc-IL-1ra重組表達產物。CHO細胞系用CHO-CD4培養基(Irvine Scientific)和常用的流加培養基進行無血清懸浮馴化，在3L細胞培養器中放大培養。融合蛋白TNFRII-Fc-IL-1ra(序列5)，IL-4R-ECD-Fc-IL-1ra(序列20)，IL-18bp-Fc-IL-1ra(序列17)的產量可達到商業生產的水平。這些蛋白可以應用protein-A親和層析、離子交換、疏水層析進行純化(圖2、3、4)。純化獲得的蛋白加入製劑組分後，凍幹，然後用SEC-HPLC液相分析。
實施例3利用生物活性實驗測定TNFRII-Fc-IL-1ra，IL-4R-Fc-IL-1ra，IL-18bp-Fc-IL-1ra和VEGFR1-Fc-IL-1ra的活性。應用白細胞介素1依賴細胞D10進行白細胞介素1中和測定，D10細胞可用於檢測以下幾個蛋白的封閉活性IL-1ra(Kineret)、TNFRII-Fc-IL-1ra、IL-4R-Fc-IL-1ra和IL-18bp-Fc-IL-1ra。它們都可以抑制重組人白細胞介素1的依賴細胞D10細胞的增殖。
簡單說，人IL-1α能夠以劑量依賴的方式誘導D10細胞增殖。白細胞介素1α誘導50％的細胞增殖，這個就是濃度就是EC50(半數有效劑量)。人IL-1α一般誘導D10細胞增殖的EC50範圍在1-5pg/ml。細胞與有效劑量的白細胞介素1受體拮抗劑共孵育後，白細胞介素1受體拮抗劑通過封閉細胞表面白細胞介素1受體而抑制IL-1α誘導的細胞增殖。這種封閉效應同樣是劑量依賴的。當受體拮抗劑的量較低時，它就不能封閉細胞表面的受體。那麼，白細胞介素1誘導細胞增殖的活性得以恢復。受體拮抗劑使白細胞介素1的50％活性被抑制的濃度就是受體拮抗劑的半數有效劑量。
重組蛋白(TNFRII-Fc-IL-1ra，IL-4R-Fc-IL1ra，IL-18bp-Fc-IL-1ra，或VEGFR1-Fc-IL-1ra)的作用類似於可溶TNFRII、IL-18、IL-4或VEGF中和分子和白細胞介素1受體拮抗劑。細胞學測定確認了這些嵌合蛋白的生物活性(圖6，8，10，11)。
在細胞學測定TNF中和分子活性方面，L929細胞(小鼠結締組織細胞系，來源於ATCC)用於檢測TNFRII阻斷TNFα的活性。簡單說，TNFα以劑量依賴的方式誘導快速細胞死亡，TNFα的半數有效濃度(誘導50％細胞死亡的TNFα濃度)低於50pg/ml。當TNFα分子與高濃度的可溶性TNF受體(sTNFR)共孵育後，可溶性受體與TNFα結合，從而抑制它與細胞表面受體結合。這樣就阻斷TNFα導致細胞死亡的活性。這種阻斷效應也是劑量依賴的。sTNFR濃縮液稀釋到一定濃度以下就不再阻斷TNFα的活性，TNFα繼續誘導細胞死亡。這樣就可以確定是sTNFR的半數有效濃度(也就是阻斷50％TNFα活性的濃度)。
96孔培養板中加入一定數量的L929細胞、10％的馬血清、DMEM培養基(含穀氨醯胺)、1ug/ml放線菌D，每孔總體積150ul，再加入連續稀釋的人TNFα樣品(每濃度各兩復孔)。對照孔只含細胞和培養基。培養板置於37℃溫箱，5％CO2、飽和溼度條件下培養一天。每孔細胞用10％聚甲醛固定，用1％結晶紫染液染色。染色後加入30％的醋酸溶解。測定每孔光密度值(OD)，波長設在540納米，光密度值與細胞總數成正比例。繪製細胞毒曲線，OD值設為Y軸，TNFα濃度作X軸。
連續稀釋TNFRII-Fc(Enbrel)和TNFRII-Fc-IL-1ra樣品(各作兩復孔)，分別加入含固定濃度的人TNFα、10％的馬血清、L-穀氨醯胺和1ug/ml的放線菌D的細胞板中。37℃共孵育1小時後轉入另一塊預先加有L929細胞的96孔板中。人TNF終濃度為500pg/毫升(總體積150ul/孔)。培養板置於37℃溫箱，5％CO2飽和溼度條件下培養一天。細胞用10％多聚甲醛固定，1％結晶紫染液染色。染色後加入30％的醋酸溶解。測定每孔光密度值(OD)，波長設在540納米。分別繪製中和曲線，OD值設為Y軸，TNFRII-Fc和TNFRII-Fc-IL-1ra濃度作X軸。
結果表明人TNF alpha以劑量依賴的方式誘導L929細胞死亡。只含細胞和放線菌素D的本底O.D為0.5，人TNF-alpha劑量效應曲線從0.5降至0.1。人TNF-alpha劑量高於100pg/ml後O.D.值不再下降。結果顯示人TNF-alpha已達飽和濃度。所有實驗均作2復孔。每一樣品濃度的CV％低於9％。此條件下人TNF-alpha的半數有效濃度為8pg/ml。
應用L929細胞，發現TNFRII-Fc和TNFRII-Fc-IL-1ra能夠以劑量依賴的方式抑制人TNF-alpha的活性。OD值的本底是0.1(細胞培養體系含TNF-alpha(500pg/ml)和放線菌素D)。加不同濃度的TNFRII-Fc-IL-1ra，OD值也從0.1增加到0.5，顯示全部中和作用。50ng/ml的TNFRII-Fc和TNFRII-Fc-IL-1ra能夠完全中和人TNF-alpha活性。樣品的每一稀釋度均做兩復孔，每一稀釋度CV％低於10％，TNFRII-Fc和TNFRII-Fc-IL-1ra中和人TNF-alpha活性的半數有效濃度分別為3-4ng/ml，10ng/ml。
人白細胞介素4能夠誘導TF-1細胞增殖，據此可用於白細胞介素4中和實驗。稀釋不同濃度人白細胞介素4加入含TF-1細胞的96孔細胞培養板，37℃，5％CO2條件下培養3天。培養基中加入MTS繼續培養5小時。使用酶聯儀測培養板各孔OD值，波長設在490納米。可以繪出細胞增殖曲線，OD值作為Y軸，白細胞介素4濃度作為X軸。在中和實驗中，將連續稀釋的IL-4R-Fc和IL-4R-Fc-IL-1ra與含一定濃度的白細胞介素4(2ng/ml)培養基在96孔培養板中，37℃預孵育1小時。隨後在每孔中加相同數量的TF-1細胞，置於37℃，5％CO2培養箱中培養3天。加入MTS，繼續培養5小時後，使用酶聯儀測培養板各孔光密度值，波長490納米。繪出細胞生長抑制曲線，OD值作為Y軸，IL-4R-Fc和IL-4R-Fc-IL-1ra濃度作為X軸。該實驗結果(圖表7)結合白細胞介素1中和實驗的結果(圖8)，顯示了IL-4R-Fc-IL-1ra具有生物學功能，同時具有人IL-4受體和IL-1中和蛋白的活性。
人白細胞介素18可以劑量依賴的方式誘導KG-1細胞分泌IFN-g(培養體系含TNFa)，以此原理進行白細胞介素18中和實驗。人白細胞介素18的半數有效劑量(就是指白細胞介素18誘導KG-1細胞分泌IFN-g達最高濃度的50％劑量)通常在20-40ng/ml。在加入細胞培養體系前，人白細胞介素18結合蛋白(IL-18bp)與人白細胞介素18預孵育，那麼白細胞介素18結合蛋白可以結合、抑制白細胞介素18的活性。這種抑制效應是劑量依賴的。白細胞介素18結合蛋白完全封閉IFNg表達所需濃度的50％劑量，就是它的半數有效濃度。
細胞培養板中加入連續稀釋的IL-18bp-Fc-IL-1ra和對照IL-18bp-Fc樣品(各濃度設兩個復孔)，與固定濃度(50ng/ml)的人白細胞介素18(RD System)預孵育，37℃作用1小時。連續稀釋的白細胞介素18(各濃度設兩個復孔)加在培養板中設為陽性對照。各孔加入同樣數量的KG-1細胞(ATCC，CCL246)，以及同樣量的TNFa(BioSource Inc.)，置於37℃、5％CO2培養箱中繼續培養24小時。在細胞培養板中每孔取出50ul，轉移到另外一個ELISA檢測板中。按照人IFNg的ELISA檢測試劑盒(BioSource Inc.)說明進行檢測。光密度值測定初始波長為450納米。繪出白細胞介素18誘導表達IFNg曲線，OD值為Y軸，人白細胞介素18濃度為X軸。白細胞介素18結合蛋白中和曲線以OD值為Y軸，IL-18bp-Fc-IL-1ra或對照組IL-18bp-Fc濃度為X軸。
細胞中和實驗結果在圖9中顯示。結合白細胞介素1中和實驗的結果(圖10)，證明了IL-18bp-Fc-IL-1ra融合蛋白成功的表達是成功的。它保持了同時中和白細胞介素18和白細胞介素1的活性。
人VEGF(血管內皮細胞生長因子)以劑量依賴的方式誘導HUVE(人內皮臍靜脈細胞增殖)，半數有效濃度，就是它誘導HUVE細胞增殖最高所需濃度的50％，一般為2-6ng/ml。將可溶性人VEGF受體1與血管內皮細胞生長因子預孵育後加入到細胞板中，可溶性人VEGF受體-1結合人VEGF並封閉其誘導細胞增殖的活性，這種封閉效應同樣是劑量依賴的。完全封閉所需受體濃度的50％劑量，就是它的半數有效濃度。重組蛋白VEGFR1-Fc-IL-1ra由可溶性VEGF受體1和白細胞介素1受體拮抗劑兩部分組成。它能夠發揮可溶性VEGFR1和白細胞介素1受體拮抗劑的雙重作用。
連續稀釋VEGFR1-Fc-IL-1ra樣品(各做兩復孔)，分別與10ng/ml的VEGF(BioSource)於96孔細胞培養板中37℃預孵育1小時。連續稀釋的人VEGF設為對照組。然後向96孔板中每孔加入相同數量的HUVE細胞(Cambrex)進行培養。在37℃，5％CO2培養箱中繼續培養96小時。在最後的4小時內向每孔加入MTS(Promega)。測定光密度(OD值)的波長為490納米。繪出不同濃度的VEGF使細胞增殖的OD值曲線。VEGF-R的中和曲線用OD值做Y軸，VEGFR1-Fc-IL-1ra濃度作X軸。
人VEGF以劑量依賴的方式刺激HUVE細胞增殖。半數有效濃度3ng/ml。濃度為10ng/ml的VEGF與連續稀釋的VEGFR1-Fc-IL-1ra共孵育後，加入細胞培養體系中，VEGF依賴細胞的增殖以劑量依賴的方式受到抑制。VEGFR1-Fc-IL-1ra的半數有效濃度是15ng/ml(圖12)。結合白細胞介素1中和實驗的結果(圖11)，證明了VEGFR1-Fc-IL-1ra融合蛋白的表達是成功的。它具有中和VEGF和IL-1的雙重活性。
實施例4使用小鼠哮喘模型檢測IL-4R-Fc-IL-1ra療效。使用雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)製備模型。簡單講，這些小鼠在第0天和第14天腹膜內注射40ug OVA(以2.25mg氫氧化鋁乳化製成乳劑，總體積100ul)。
將小鼠分成8小時和48小時兩組，8小時組包含生理鹽水對照8小時組、OVA8小時組、IL-4R-Fc/OVA8小時組、IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA8小時組，48小時組分成理鹽水對照48小時組、OVA48小時組、IL-4R-Fc/OVA48小時組、IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA48小時組。
第28天，所有組均給藥100ug OVA，溶於0.05ml生理鹽水通過鼻內給藥，生理鹽水組除外。生理鹽水組第0天和第14天腹膜內給正常量的生理鹽水(含氫氧化鋁)，在28天通過鼻內給0.05ml生理鹽水。
在29天，48小時組每組均再次給100ug OVA，溶於0.05ml生理鹽水通過鼻內給藥，生理鹽水組除外。生理鹽水組同樣在第29天通過鼻內再次給0.05ml生理鹽水。
IL-4R-Fc和IL-4R-Fc-IL-1ra的給藥治療在第28天，IL-4R-Fc/OVA-8小時組，IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA-8小時組，IL-4R-Fc/OVA-48小時組和IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA-48小時組，以200ug/只/天劑量分別給藥。OVA激發前60分鐘腹膜內注射給藥。IL-4R-Fc/OVA-48小時組和IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA-48小時組在第29天以200ug/只/天的劑量再次給藥。測定支氣管肺泡灌洗液中的細胞數。
8小時組動物在第28天，鼻內一次OVA激發8小時後，處死小鼠取支氣管肺泡灌洗液進行組織學研究。48小時組動物在28天和29天鼻內OVA激發48小時後處死。小鼠左肺主支氣管處結紮，用1ml正常濃度的生理鹽水通過氣管插管灌洗右肺。用血球計數板計算總(淋巴)細胞數。製備甩片，用leukostat(fisher Diagnostics，Pittsburgh，PA)染色後分別計算各種分化細胞數。利用標準血細胞計算方法，分別計巨噬細胞、嗜酸性細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數，400倍放大的視野中應至少有200個細胞。
肺組織學取出氣管和左肺上、下葉部分組織在20攝氏度條件下用Carnoy’s固定液固定15小時。用石蠟包埋，切片(5um)。每隻小鼠左肺隨機取10個氣道組織切片，評估細胞浸潤及黏液阻塞程度。在肺部血管和氣道的周圍的細胞浸潤強度依據半定量評分。
結果1.IL-4R-Fc-IL-1ra嵌合蛋白治療早期階段的肺炎。
表1 8小時組的小鼠經過鼻內OVA一次激發後，支氣管肺泡灌洗液內的分化細胞數量。8小時組的小鼠生理鹽水對照組、OVA、IL-4R-Fc/OVA-8hr和IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA組(每組5隻)的分化細胞計數如下(Mean±SEM).

2.使用IL-4R-Fc-IL-1ra阻斷晚期肺炎。
表格2 48小時組經過鼻內OVA的兩次激發後，支氣管肺泡灌洗液內的分化細胞數。48小時組的小鼠生理鹽水組、OVA、IL-4R-Fc/OVA、IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA組(每組5隻)的分化細胞數(Mean±SEM)。

肺組織學研究結果顯示在OVA-8小時組和OVA-48組實驗中肺部血管和氣道組織周圍觀察到嚴重細胞浸潤。與IL-4R-Fc/OVA-48hr組和IL-4R-Fc/OVA-8hr組比較，IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA-8小時治療組和IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA-48小時治療組能夠明顯減少肺部血管和氣道組織的細胞浸潤。結果顯示，在該哮喘動物模型中，IL-4R-Fc-IL1ra治療效果最佳。
實施例5小鼠關節炎動物模型(CIA)考察IL-18bp-IgG1Fc-IL-1ra融合蛋白的治療效果。依據最近發表的標準方法修改方案(Banada等，2002)誘導CIA動物模型，8-10周齡的DBA/1J小鼠皮內注射牛II型膠原蛋白。在0天和21天，每隻小鼠皮內注射100ul含有200ug牛II型膠原蛋白和含200ug滅活結核分支桿菌的不完全弗氏佐劑。小鼠(每組5隻)在21到36天之間每3天注射治療一次，分成3組，分別腹膜內注射PBS緩衝液對照、3mg/kg IL-18bp-Fc、3mg/kg IL-18bp-Fc-IL-1ra。小鼠36天脫頸處死。正常的三隻DBA/1J對照小鼠同時被處死。
在21到36天每兩天應用雙盲法評測CIA的疾病臨床活動性評分，用三等級評分法評測每隻小鼠爪的發病程度，打分標準0＝正常關節，1＝輕微炎症和發紅，2＝嚴重紅斑和腫脹影響整個爪子，活動受限，3＝畸形關節、關節強硬、關節強直、功能缺失。關節炎發病程度由四個爪子的總分計算，每隻動物的最高分為12分。
在第36天取所有小鼠的雙前肢和右後肢，10％福馬林固定，按照前述方法(Bendele等，2000年)製作組織樣本進行組織學分析。由有經驗的人員以雙盲法對爪、踝關節、膝等部位的組織學改變進行評分。按照前述方法(Bendele等，2000年)，按0-5評分，每隻小鼠取5個部位的數據，統計數據顯示的是炎症、血管翳、軟骨和骨損傷的平均分以及整體評分.
結果IL-18bp-Fc-IL-1ra臨床治療關節組織疾病及關節組織學研究。
各實驗組關節炎發病率接近100％。與PBS空白對照相比，21到36天注射3mg/kgIL-18bp-Fc、3mg/kg IL-18bp-Fc-IL-1ra的蛋白治療組小鼠的疾病臨床活動性評分結果降低。關節組織學分析顯示，與PBS組比較3mg/kg IL-18bp-Fc和3mg/kgIL-18bp-Fc-IL-1ra能夠防止關節損傷。對比3mg/kg IL-18bp-Fc和3mg/kgIL-18bp-Fc-IL-1ra治療組，疾病臨床活動性評分以及組織學評分之間都具有顯著性差異。IL-18bp-Fc-IL-1ra的療效明顯優於IL-18bp-Fc。
表3IL-18bp-Fc-IL-1ra治療CIA模型鼠的疾病臨床活動性評分在0天和21天DBA/1J小鼠注射200ug牛II型膠原蛋白、弗氏不完全佐劑、200ug結核桿菌。各組小鼠在21到36天之間每3天分別腹膜內注射PBS緩衝液對照、3mg/kg體重的IL-18bp-Fe和3mg/kg體重的IL-18bp-Fc-IL-1ra。由兩位有經驗的研究人員每兩天以雙盲法分別鑑定CIA小鼠每隻爪子的病理改變程度，三級評分法進行打分。下列結果為最初注射牛II型膠原蛋白後，各實驗組小鼠的疾病臨床活動性評分數據。((mean±SEM))

實施例6小鼠接觸性過敏試驗模型(CHS)體內測試IL-18bp-Fc-IL-1ra活性。
CHS模型的製作及白細胞介素18嵌合蛋白的藥效實驗。
實驗動物採用C57BL/6mice(8周和14周齡)。所用試劑二硝基氟苯、丙酮、伊文思藍、甲醯胺、牛血清白蛋白、乙酸鹽、伊屋諾黴素、布雷菲德菌素A、脂多糖(Escherichiacoli026B6)均購自Sigma-Aldrich公司。DNFB(二硝基氟苯)使用前丙酮/橄欖油(4/1)現用現稀釋，刮去小鼠背部皮膚，塗抹25μl的0.5％DNFB溶液於小鼠背部致敏動物，同時設置未處理的對照組。5天後，在小鼠右耳兩側使用10μl的0.2％DNFB(非刺激性劑量)溶液塗抹，左耳使用同劑量溶劑(無DNFB)塗抹。在激發疾病模型的5天前，每天使用卡尺測量耳部的厚度。耳部腫脹程度((Tn-T5)右耳)-(Tn-T5)左耳))，Tn和T5分別代表第n天測量各只小鼠耳部厚度數值以及激發5天前小鼠耳部厚度數值。為確保試驗中小鼠耳部腫脹由DNFB導致炎症而不是非特異性所致，每次實驗都設立一個非致敏但激發動物對照組。每隻小鼠從第5天激發前60分鐘開始每天給藥，分別腹膜內注射250μg的IL-18bp-Fc或IL-18bp-Fc-IL-1ra來中和白細胞介素18或/和白細胞介素1。對照組動物只注射生理鹽水。再次激發期間的初次治療7天為一個療程。
結果IL-18bp-Fc-IL-1ra治療接觸過敏。
製作接觸過敏動物模型，在小鼠背部刮毛，塗抹半抗原DNFB(二硝基氟苯)致敏動物。5天後耳部塗抹DNFB激發小鼠的接觸過敏。對比DNFB和溶劑空白處理對照組動物的耳朵腫脹增加程度進行打分確定炎症的激發。在模型激發階段即5-7天給藥IL-18BP-Fc和IL-18bp-Fc-IL-1ra，能夠明顯在這期間減少耳部腫脹。IL-18bp-Fc和IL-18bp-Fc-IL-1ra的療效具有顯著性差異(結果見表)，該結果顯示IL-18bp-Fc-IL-1ra具有在同一或富含IL1受體的靶向性的特點，保證雙重阻斷IL-1和IL-18，其靶向性能夠直接保證其高效性。IL-18bp-Fc-IL-1ra的療效明顯優於IL-18bp-Fc。
表格4在接觸性過敏性模型誘發過程中測試IL-18BP的藥效試驗第0天DNFB致敏C57BL/6小鼠，5天後塗於耳部激發。每天測量耳部腫脹程度，用DNFB激發組較空白對照組腫脹程度的增加來表示。每天使用IL-18bp嵌合蛋白或空白試劑處理小鼠。以下為每組5隻小鼠數據的平均值。

實施例7白細胞介素1受體結合實驗。
簡單說，重組人白細胞介素1受體胞外區使用CHO細胞表達後，進行純化。TNFRII-Fc-IL-1ra、陰性對照TNFRII-Fc、陽性對照IL-1ra(Kineret)，包被於96孔板中，濃度1ug/孔，每孔加100ul包被緩衝液(Sigma)。純化的白細胞介素1受體(濃度0.1ug/孔)在PBS緩衝液中37℃作用45分鐘。用兔抗人白細胞介素1受體胞外區抗體(RDSystems)檢測配體/受體結合反應。隨後加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(Pierce)，PBS-T緩衝液洗板，加入TMB(Sigma，T8665)顯色，EL800酶標儀測光密度值，波長為650納米。檢測結果作圖，OD值為縱坐標，稀釋倍數為橫坐標。圖13顯示了TNFRII-Fc-IL-1ra和IL-1ra(Kineret)都能夠結合白細胞介素1受體，而TNFRII-Fc(Enbrel)不能。有趣的是哺乳動物表達的白細胞介素1受體拮抗劑和大腸桿菌表達的白細胞介素1受體拮抗劑(Kineret)相比，與白細胞介素1受體結合得更好。而且哺乳動物表達的白細胞介素1受體拮抗劑包含2個糖基化的N-link糖基化位點，所以與大腸桿菌表達的白細胞介素1受體拮抗劑(Kineret)相比，結合血清蛋白較少，在體外的結合特性也有所不同。
實施例8125-I標記TNFRII-Fc-IL-1ra，IL-4R-Fc-IL-1ra，和IL-18bp-Fc-IL-1ra檢測實驗動物體內分布情況，以非白細胞介素1受體拮抗劑融合的蛋白作為對照。
用Iodogen方法以125-I標記TNFRII-Fc-IL-1ra，IL-4R-Fc-IL-1ra和IL-18bp-Fc-IL-1ra，然後通過分子篩色譜層析法純化(M Hui等.，1989)，IL-1受體結合實驗是一種常用的方法，用自己製備的哺乳動物表達重組白細胞介素1受體細胞外結構域融合蛋白進行檢測。白細胞介素1受體與125-I標記的TNFRI-Fc-IL-1ra結合的與非標記的TNFRII-Fc-IL-1ra結合進行平行比較。結果顯示125-I標記的TNFRII-Fc-IL-1ra具有結合白細胞介素1受體的功能。
使用6nmol TPA溶於200ul丙酮塗抹於小鼠耳部，2-3天誘導了皮膚炎症的發生。在皮膚炎症小鼠動物模型注射125-I標記的TNFRII-Fc-IL-1ra和125-I標記的TNFRII-Fc(Enbrel)。令人驚訝的是，結果顯示125-I標記的TNFRII-Fc-IL-1ra在炎症位點的分布要多於TNFRII-Fc。這很有可能與白細胞介素1受體的結合有關。
將125-I標記的IL-4R-Fc-IL-1ra、IL-18bp-Fc-IL-1ra以及125-I標記的IL-4R-Fc、IL-18bp-Fc注射小鼠皮膚炎症模型動物。獲得了相似的結果。
表格5125-I標記的TNFRII-Fc-IL-1ra和TNFRII-Fc注射4小時後，在炎症和非炎症皮膚組織位點的分布。該分布情況以每克組織含注射劑量的百分比表示(六隻動物)。

表格6125-I標記的IL-4R-Fc-IL-1ra和IL-4R-Fc注射4小時後，在炎症和非炎症皮膚組織的分布。以每克組織中的注射劑量百分比表示(六隻動物)。


表格7125-I標記的IL-18bp-Fc-IL-1ra和IL-18bp-Fc注射4小時後，在炎症和非炎症組織的分布。以每克組織中的注射劑量百分比表示(六隻動物)。

實施例9使用2隻獼猴測定IL-4R-Fc-IL-1ra的免疫原性。每周皮下注射10mgIL-4R-Fc-IL-1ra，共注射8周。注射前，後(第1和56天)收集血清樣本。應用中和實驗檢測血清樣品中是否存在能夠中和IL-4和IL-1生物活性的針對嵌合蛋白的中和性抗體。為了更好的檢測低濃度的中和抗體，血清進一步用蛋白A和抗IgM抗體進行親和層析。在藥物注射獼猴的未稀釋的血清樣本以及純化的IgG和IgM中都未檢出能夠中和IL-4和IL-1生物活性的針對嵌合蛋白的抗體。結果提示，嵌合蛋白IL-4R-Fc-IL-1ra對猴和人沒有免疫原性。
序列表嵌合蛋白序列110美國蛋白質公司，哈藥集團生物工程有限公司120嵌合蛋白1302006010140200580011525.41412004-04-08150PCT/US2005/0121941512004-10-12160252101211152212PRT213人工序列310WO2006/043972 A13112006-04-274001Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile1 5 10 15Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr leu Arg Asn Asn Gln leu20 25 30Val Ala Gly Tyr leu Gln Gly Pro Asn Val Asn leu Lys Glu Lys35 40 45Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala leu Phe leu Gly Ile50 55 60His Gly Gly Lys Met Cys leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu65 70 75Thr Arg leu Gln leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp leu Ser Glu80 85 90Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser95 100 105Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe110 115 120leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser leu Thr Asn125 130 135Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu140 145 150Asp Glu2102211232212PRT213人工序列310WO2006/043972 A13112006-04-274002Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro5 10 15Ala Pro Glu Lue Lue Gly Gly Pro Ser Val Phe Lue Phe Pro Pro20 25 30Lys Pro Lys Asp Thr Lue Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr35 40 45Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe50 55 60Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys65 70 75Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val80 85 90Lue Thr Val Lue His Gln Asp Trp Lue Asn Gly Lys Glu Tyr Lys95 100 105Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Lue Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr110 115 120Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr125 130 135Lue Pro Pro Ser Arg Asp Glu Lue Thr Lys Asn Gln Val Ser Lue140 145 150Thr Cys Lue Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu155 160 165Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro170 175 180Pro Val Lue Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Lue Tyr Ser Lys Lue185 190 195Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys200 205 210Ser Val Met His Glu Ala Lue His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
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1.一種融合蛋白，其特徵是第一片段位於融合蛋白的氨基末端，並且特異性地結合，以及中和一個細胞因子或生長因子的功能，第二片段位於融合蛋白的羧基末端，並且特異結合一種生長因子或一種細胞因子的受體，這兩個片段是人為連接的，第二個細胞因子的受體在炎症或疾病位點高表達。
2.根據權利要求1中所述的融合蛋白，其特徵是所述的蛋白質含有連接片段，該連接片段將連接第一片段和第二片段連在一起，其中連接片段具有二聚體化的功能。
3.根據權利要求2中所述融合蛋白，其特徵是所述的蛋白的連接片段，包含免疫球蛋白的Fc片段或其同功能片段。
4.權利要求3中所述的融合蛋白，其特徵是所述的免疫球蛋白，是指IgA、IgE、IgD、IgG或IgM。
5.根據權利要求3中所述的融合蛋白，其特徵是所述的免疫球蛋白，是指IgG。
6.根據權利要求5中所述的融合蛋白，其特徵是所述的Fc片段包含序列2。
7.根據權利要求1中所述的融合蛋白，其特徵是所述的蛋白，它的第一片段可以結合及中和血管內皮細胞生長因子，血管生成素、腫瘤壞死因子、白細胞介素18、白細胞介素4或者白細胞介素13或它們的同功能蛋白。
8.根據權利要求7中所述的融合蛋白，其特徵是所述的蛋白，其中第一片段包含一條免疫球蛋白鏈序列，能夠特異地結合且中和血管內皮細胞生長因子，新生血管生成素，白細胞介素18、白細胞介素4、白細胞介素13或IgE或其同功能蛋白。
9.根據權利要求8中所述的融合蛋白，其特徵是所述的蛋白，它的免疫球蛋白鏈，包含序列9，11，12，14，23，或24或同功能蛋白。
10.根據權利要求7中所述的融合蛋白，其特徵是所述的蛋白，它的第一片段包含血管內皮生長因子、血管生成素、腫瘤壞死因子、白細胞介素18、白細胞介素4和白細胞介素13的受體或結合蛋白序列。
11.根據權利要求10中所述的融合蛋白，其特徵是所述的蛋白，第一片段包含序列3，6，15，或19。
12.根據權利要求1中所述的融合蛋白，其特徵是所述的蛋白是糖基化蛋白。
13.根據權利要求1中所述的融合蛋白，其特徵是所述的第二個細胞因子是指白細胞介素1。
14.根據權利要求13中所述的融合蛋白，其特徵是所述的蛋白，第二片段是白細胞介素1的拮抗劑。
15.根據權利要求14中所述的融合蛋白，其特徵是所述的蛋白，第二片段包含白細胞介素1受體拮抗劑的序列(序列1)或其同功能蛋白序列。
16.根據權利要求14中所述的融合蛋白，其特徵是所述的蛋白包含序列5，8，10，13，17，18，21，22，24，或25。
17.一種體外分離的核酸，其特徵是其中包含編碼權利要求1中所述的融合蛋白的序列。
18.根據權利要求17中所述的核酸序列，包含編碼序列1至25的某一序列。
19.一種載體，其特徵是其中包含權利要求17中所述的核酸序列。
20.一種宿主細胞，其特徵是其中包含權利要求17中所述的核酸。
21.一種生產多肽的方法，包括利用細胞培養基培養權利要求20中所述的細胞，使核酸序列編碼的多肽在細胞中表達，然後從培養的細胞或細胞培養液中純化這些多肽。
22.一種藥物製劑組分，其特徵是其中包含權利要求1提到的融合蛋白，或是編碼該融合蛋白的核酸分子，以及可用於藥用的載體
23.一種調節患者免疫反應的方法，這種方法包括確定已經或正在為過度免疫反應所累的患者以及給予該患者有效劑量的權利要求1中提到的融合蛋白或編碼該融合蛋白的核酸分子
24.根據權利要求23中所提到的方法，其特徵是所述的患者已經或準備接受同基因或異基因移植。
25.根據權利要求23中所提到的方法，其特徵是其中的病症是炎症、自身免疫疾病、過敏性疾病、或是新生血管形成依賴的腫瘤疾病。
26.根據權利要求25的方法，其特徵是所述的病症是腫瘤疾病，融合蛋白包含序列22，24，和25。
27.一種延長重組蛋白在患者體內半衰期的方法，其特徵是該方法包括將某重組蛋白與包含序列1，或是其同等功能的序列片段連接，形成融合蛋白嵌合體，決定該融合蛋白在患者體內的半衰期，重組蛋白在體內結合且中和某一細胞因子或生長因子。
28.一種延長重組蛋白在患者體內的功效的方法，其特徵是該方法包括將某重組蛋白與包含序列1，或是其它同等功能的序列片段連接，形成融合蛋白嵌合體，決定該融合蛋白在患者體內的功效，
29.一種在患者體內將治療性蛋白向某一靶位投送的方法，其特徵是該方法包括將治療蛋白與包含序列1，或是其同功能的片段連接，形成融合蛋白嵌合體，以及將該融合蛋白應用於合適的患者，其中的治療性蛋白能夠靶向定位於高表達白細胞介素1受體的炎症位點。
30.根據權利要求28所述的在患者體內將治療性蛋白向某一靶位投送的方法，其特徵是所述的片段包含序列1或其它同等功能的片段，該片段結合白細胞介素1受體，而重組蛋白是一種能夠結合而且中和某一細胞因子或生長因子的治療性蛋白。
31.根據權利要求30所述的在患者體內將治療性蛋白向某一靶位投送的方法，其特徵是所述的融合蛋白嵌合體，在患者體內的能夠在炎症或高表達白細胞介素1受體的疾病位點同時結合且中和白細胞介素1受體以及另一細胞因子或生長因子。
32.權利要求30所述的在患者體內將治療性蛋白向某一靶位投送的方法，其特徵是所述融合蛋白嵌合體在患者體內的炎症位點或高表達白細胞介素1受體的疾病位點能夠同時中和或拮抗白細胞介素1和其他細胞因子或生長因子。
全文摘要
嵌合蛋白，融合蛋白包含的第一片段位於融合蛋白的氨基末端，並且特異性地結合以及中和一種細胞因子或生長因子的功能，融合蛋白包含的第二片段位於融合蛋白的羧基末端，並且特異結合另外一種細胞因子或生長因子的受體，該受體經常在某些疾病位點高表達，例如白細胞介素1受體高表達的炎症疾病位點。而且，所說的第二片段通常是受體拮抗劑，如白細胞介素1受體拮抗劑及其同功能類似分子。本發明同時包括編碼該融合蛋白的核酸、載體、攜帶這些核酸分子的宿主細胞，以及相關的製劑組成和靶向治療炎症疾病以及一些與炎症疾病共存的其它適應症的方法。
文檔編號C12N15/63GK101027079SQ200580011525
公開日2007年8月29日 申請日期2005年4月8日 優先權日2004年10月12日
發明者惠覓宙 申請人:美國蛋白質公司, 哈藥集團生物工程有限公司