Aagab基因突變體及其應用的製作方法

2023-05-21 14:21:51

Aagab基因突變體及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了AAGAB基因突變體及其應用，具體涉及分離的編碼AAGAB突變體的核酸，分離的多肽，篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的方法，篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的系統，用於篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的試劑盒，構建體以及重組細胞。其中，該分離的編碼AAGAB突變體的核酸，與SEQ?ID?NO：1相比，具有選自下列的至少一種突變：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T。通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患I型點狀掌蹠角化症。
【專利說明】AAGAB基因突變體及其應用
[0001]優先權信息
[0002]本申請請求2013年5月23日向中國國家知識產權局提交的、專利申請號為201310234269.1的專利申請的優先權和權益，並且通過參照將其全文併入此處。

【技術領域】
[0003] 本發明涉及AAGAB基因突變體及其應用。具體地，本發明涉及分離編碼AAGAB突變體的核酸，分離的多肽，篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的方法，篩選遺憾I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的系統，用於篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的試劑盒，構建體以及重組細胞。

【背景技術】
[0004]點狀掌蹠角化病(PPPK ；0MIM =148600)是一種以不規則分布於掌蹠的大量的角化性斑塊為特徵的罕見的常染色體顯性遺傳性疾病，其典型臨床表現為雙手掌與足蹠部位的圓形或卵圓形、較硬的黃色或淡黃色角質丘疹，若去除角質丘疹後，局部可留有火山口樣的凹坑，可以伴有甲變形，典型的點狀皮損可以融合成塊，可能與遭受連續性高壓有關，一般足蹠部位皮疹比掌部較大，少數患者也可不僅累及掌蹠部位，其他部位如膝部、手足背部、肘部也可受累。其中，I型點狀掌妬角化症(Punctate palmoplantar keratoderma typeI，PPKP1)，又稱為點狀掌蹠角化病Buschke-Fischer-Brauer型，其發病機制複雜、並且具有高度遺傳異質性。
[0005]現階段，尋找致病基因對疾病診斷或治療意義重大。雖然目前已發現多個PPKPl的致病基因，涉及較多致病突變，但仍存在著相當一部分未知的致病基因及致病位點。
[0006]因而，目前對I型點狀掌蹠角化症的研究仍有待深入。


【發明內容】

[0007]本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在於提出一種能夠有效篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的方法。
[0008]本發明是基於發明人的下列工作完成的:發明人通過目標區域捕獲測序聯合候選基因突變驗證的方法確定了 I型點狀掌蹠角化症的新的致病基因——AAGAB基因，並發現了六個AAGAB基因上的治病突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和 c.481C>T。
[0009]根據本發明的第一方面，本發明提出了一種分離的編碼AAGAB突變體的核酸。根據本發明的實施例，所述核酸與SEQ ID N0:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和c.481C>T。根據本發明的實施例，發明人確定了 AAGAB基因的新突變體，該突變體與I型點狀掌蹠角化症的發病密切相關，從而通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患I型點狀掌蹠角化症。
[0010]根據本發明的第二方面，本發明提出了一種分離的多肽。根據本發明的實施例，與SEQ ID NO:2相比，所述分離的多肽具有選自下列的至少一種突變:p.Phel84Leufs*6、p.Leu252Leufs*14、p.Leu242*、p.Serll8Lysfs*3 和 p.Argl61*。通過檢測生物樣品中是否表達該多肽，可以有效地檢測生物樣品是否易患I型點狀掌蹠角化症。
[0011]根據本發明的第三方面，本發明提出了一種篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟:從所述生物樣品提取核酸樣本；確定所述核酸樣本的核酸序列；所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T是所述生物樣品易患I型點狀掌蹠角化症的指示。通過根據本發明實施例的篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的方法，可以有效地篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品。
[0012]根據本發明的第四方面，本發明提出了一種篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的系統。根據本發明的實施例，該系統包括:核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用於從所述生物樣品提取核酸樣本；核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用於對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基於所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，是否具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和 c.481C>T，判斷所述生物樣品是否易患I型點狀掌蹠角化症。利用該系統，能夠有效地實施前述篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的方法，從而可以有效地篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品。
[0013]根據本發明的第五方面，本發明提出了一種用於篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒含有:適於檢測AAGAB基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，該AAGAB基因突變體具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和c.481C>T。利用根據本發明的實施例的試劑盒，能夠有效地篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品。
[0014]根據本發明的第六方面，本發明還提出了一種構建體。根據本發明的實施例，該構建體包含前面所述的分離的編碼AAGAB突變體的核酸。需要說明的是，「構建體包含前面所述的分離的編碼AAGAB突變體的核酸」表示，本發明的構建體包含與SEQ ID NO:1相比具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T的AAGAB基因突變體的核酸序列。由此，利用本發明的構建體轉化受體細胞獲得的重組細胞，能夠有效地用於篩選治療I型點狀掌蹠角化症的藥物。
[0015]根據本發明的第七方面，本發明還提出了一種重組細胞。根據本發明的實施例，該重組細胞是通過前面所述的構建體轉化受體細胞而獲得的。根據本發明的一些實施例，利用本發明的重組細胞，能夠有效地篩選治療I型點狀掌蹠角化症的藥物。
[0016]本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0018]圖1顯示了根據本發明實施例的篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的系統及其組成部分的示意圖，其中，
[0019]圖1A為根據本發明實施例的篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的系統的示意圖，
[0020]圖1B為根據本發明實施例的核酸提取裝置的示意圖，
[0021]圖1C為根據本發明實施例的核酸序列確定裝置的示意圖；
[0022]圖2-圖9依次顯示了根據本發明一個實施例的I型點狀掌蹠角化症患者家系FamiIy1-Family8 的家系圖；
[0023]圖10-圖15依次顯示了實施例2中檢測獲得的I型點狀掌蹠角化症患者的AAGAB基因的突變位點的Sanger測序驗證峰圖。

【具體實施方式】
[0024]下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
[0025]AAGAB基因突變體
[0026]根據本發明的第一方面，本發明提出了一種分離的編碼AAGAB突變體的核酸。根據本發明的實施例，所述核酸與SEQ ID N0:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T。在本文中所使用的表達方式「編碼AAGAB突變體的核酸」，是指與編碼AAGAB(即P34蛋白)突變體的基因相對應的核酸物質，即核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與AAGAB突變體的編碼基因相對應的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限於DNA、RNA或cDNA。根據本發明的一個具體示例，前面所述的編碼AAGAB突變體的核酸為DNA。根據本發明的實施例，發明人確定了 AAGAB基因的新突變體，這些新突變體與I型點狀掌蹠角化症的發病密切相關，從而通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患I型點狀掌蹠角化症，也可以通過檢測這些突變體在生物體中是否存在，可以有效地預測生物體是否易患I型點狀掌蹠角化症。
[0027]對於本發明說明書和權利要求書中，提及核酸，本領域技術人員應當理解，實際包括互補雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說明書和權利要求書中，雖然多數情況下只給出了一條鏈，但實際上也公開了與之互補的另一條鏈。例如，提及SEQ ID N0:1，實際包括其互補序列。本領域技術人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測另一條鏈，反之亦然。
[0028]該編碼AAGAB突變體的核酸，是本申請的發明人通過目標區域捕獲測序聯合候選基因突變驗證的方法確定的I型點狀掌蹠角化症的新的致病基因AAGAB的突變體。該致病基因及上述的致病突變位點在現有技術中並未被提到。
[0029]其中，野生型AAGAB基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列:
[0030]ATGGCTGCTGGCGTACCCTGTGCGTTAGTCACCAGCTGCTCCTCCGTCTTCTCAGGAGACCAGCTGGTCCAACATATCCTTGGAACAGAAGATCTTATTGTGGAAGTGACTTCCAATGATGCTGTGAGATTTTATCCCTGGACCATTGATAATAAATACTATTCAGCAGACATCAATCTATGTGTGGTGCCAAACAAATTTCTTGTTACTGCAGAGATTGCAGAATCTGTCCAAGCATTTGTGGTTTACTTTGACAGCACACAAAAATCGGGCCTTGATAGTGTCTCCTCATGGCTTCCACTGGCAAAAGCATGGTTACCTGAGGTGATGATCTTGGTCTGCGATAGAGTGTCTGAAGATGGTATAAACCGACAAAAAGCTCAAGAATGGTGCATCAAACATGGCTTTGAATTGGTAGAACTTAGTCCAGAGGAGTTGCCTGAGGAGGATGATGACTTCCCAGAATCTACAGGAGTAAAGCGAATTGTCCAAGCCCTGAATGCCAATGTGTGGTCCAATGTAGTGATGAAGAATGATAGGAACCAAGGCTTTAGCCTTCTCAACTCATTGACTGGAACAAACCATAGCATTGGGTCAGCAGATCCCTGTCACCCAGAGCAACCCCATTTGCCAGCAGCAGATAGTACTGAATCCCTCTCTGATCATCGGGGTGGTGCATCTAACACAACAGATGCCCAGGTTGATAGCATTGTGGATCCCATGTTAGATCTGGATATTCAAGAATTAGCCAGTCTTACCACTGGAGGAGGAGATGTGGAGAATTTTGAAAGACTCTTTTCAAAGTTAAAGGAAATGAAAGACAAGGCTGCGACGCTTCCTCATGAGCAAAGAAAAGTGCATGCAGAAAAGGTGGCCAAAGCATTCTGGATGGCAATCGGGGGAGACAGAGATGAAATTGAAGGCCTTTCATCTGATGAAGAGCACTGA(SEQ ID NO:1)，
[0031]其編碼的蛋白質具有如下所示的胺基酸序列:
[0032]MAAGVPCALVTSCSSVFS ⑶ QLVQHILGTEDLIVEVTSNDAVRFYPWTIDNKYYSADINLCWPNKFLVTAEIAESVQAFVVYFDSTQKSGLDSVSSWLPLAKAWLPEVMILVCDRVSEDGINRQKAQEWCIKHGFELVELSPEELPEEDDDFPESTGVKRIVQALNANVWSNVVMKNDRNQGFSLLNSLTGTNHSIGSADPCHPEQPHLPAADSTESLSDHRGGASNTTDAQVDSIVDPMLDLDIQELASLTTGG⑶VENFERLFSKLKEMKDKAATLPHEQRKVHAEKVAKAFWMAIGGDRDEIEGLSSDEEH(SEQ ID NO:2)。
[0033]發明人發現的AAGAB基因突變體與SEQ ID NO:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和 c.481C>T,即相對於野生型AAGAB基因，本發明的AAGAB基因突變體發生下列的至少一種突變:其cDNA的第552位鹼基到554位鹼基由TAG突變為AT(c.552_554TAG>AT)，第535位鹼基往後推一個鹼基處由G突變為A(C.535+lG>A，剪切位點突變)，第 755 到 756 位鹼基之間插入了 AAGCCAGTCT10 個鹼基(c.755_756insAAGCCAGTCT),第725位鹼基從T突變為G (c.725T>G)，第352位鹼基到355位鹼基之間缺失了TCTG4個鹼基(c.352_355delTCTG),第481位鹼基從C突變為T。由此，其所編碼的產物與野生型的AAGAB相比，具有相應的突變:p.Phel84Leufs*6 (c.552_554TAG>AT)、p.Leu252Leufs*14 (c.755_756insAAGCCAGTCT)、ρ.Leu242* (c.725T>G)、p.Serll8Lysfs*3(c.352_355delTCTG)和p.Argl61* (c.481C>T),即上述突變是由於AAGAB基因的相應突變而引起的。具體地，P.Phel84LeufS*6突變表示:第184位胺基酸處由苯丙氨酸變為亮氨酸，後推6個變為終止子密碼；p.Leu252Leufs*14突變表示:第252位胺基酸處開始發生改變(252密碼子處依然為亮氨酸)，後推14位鹼基突變為終止子；p.Leu242*突變表示--第242位胺基酸處由亮氨酸密碼子突變為終止密碼子；P.Serl 18Lysf s*3突變表示:第118位胺基酸處由絲氨酸突變為賴氨酸，後推3位突變為終止密碼子；p.Argl61*突變表示:第161位胺基酸處由精氨酸直接突變為終止密碼子。其中，c.535+lG>A對應的蛋白突變，是一個剪切位點突變，其後面的胺基酸變異無法預知。
[0034]AAGAB基因編碼一種由315個胺基酸組成的銜接素結合蛋白p34(在本文中有時也稱為「AAGAB」)，α-和Y -銜接蛋白是兩種可溶性配體複合體ΑΡ-1/ΑΡ-2的組成成分，而ρ34蛋白通常以配體的方式與α-和Y-銜接蛋白的ΝΗ2端相結合，從而通過與ΑΡ-1/ΑΡ-2結合來引導可溶性配體到達細胞膜的位置。另外AP-2通常還發揮一個EGFR信號的配體作用，此通路在形成胞內小泡系統中發揮一個重要作用。有研究表明在HaCaT細胞系中對AAGAB基因進行敲除可以使得EGFR信號表達升高20倍，p34蛋白的缺失可以導致與AP-2的結合受到抑制從而減少EGFR蛋白轉化，誘導小泡重新回到細胞表面。通過這個機制，p34蛋白在表皮角質細胞的增殖過程中發揮重要作用。因而，從機制方面，也可以證明發明人的發現，即AAGAB的突變會引起I型點狀掌蹠角化症。但是，本發明發現的I型點狀掌蹠角化症的致病新基因AAGAB以及上述的致病突變位點並未見報導。
[0035]根據本發明的第二方面，本發明提出了一種分離的多肽。根據本發明的實施例，與野生型AAGAB相比，該分離的多肽具有選自下列的至少一種突變:p.Phel84Leufs*6、p.Leu252Leufs*14、p.Leu242*、p.Serll8Lysfs*3 和 p.Argl61*,即該突變是由於 AAGAB基因的 c.552_554TAG>AT、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和c.481C>T突變的至少一種而引起的。具體地，p.Phel84Leufs*6突變表示:第184位胺基酸處由苯丙氨酸變為亮氨酸，後推6個變為終止子密碼；p.Leu252Leufs*14突變表示:第252位胺基酸處開始發生改變(252密碼子處依然為亮氨酸)，後推14位鹼基突變為終止子；P.Leu242*突變表示:第242位胺基酸處由亮氨酸密碼子突變為終止密碼子；p.Serl 18Lysfs*3突變表示:第118位胺基酸處由絲氨酸突變為賴氨酸，後推3位突變為終止密碼子；P.Argl61*突變表示--第161位胺基酸處由精氨酸直接突變為終止密碼子。根據本發明的一些具體示例，該多肽是由前述分離的編碼AAGAB突變體的核酸編碼的。通過檢測生物樣品中是否表達該多肽，可以有效地檢測生物樣品是否易患I型點狀掌蹠角化症，也可以通過檢測這些多肽在生物體中是否存在，可以有效地預測生物體是否易患I型點狀掌蹠角化症。
[0036]根據本發明的第三方面，本發明提出了一種篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟:
[0037]從所述生物樣品提取核酸樣本。根據本發明的實施例，生物樣品的類型並不受特別限制，只要從該生物樣品中能夠提取到反映生物樣品AAGAB是否存在突變的核酸樣本即可。根據本發明的實施例，生物樣品可以為選自人體血液、皮膚、皮下組織的至少一種，優選外周血。由此，可以方便地進行取樣和檢測，從而能夠進一步提高篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的效率。根據本發明的實施例，這裡所使用的術語「核酸樣本」應做廣義理解，其可以是任何能夠反映生物樣品中MGAB是否存在突變的樣本，例如可以是從生物樣品中直接提取的全基因組DNA，也可以是該全基因組中包含AAGAB編碼序列的一部分，可以是從生物樣品中提取的總RNA，也可以是從生物樣品中提取的mRNA。根據本發明的一個實施例，所述核酸樣本為全基因組DNA。由此，可以擴大生物樣品的來源範圍，並且可以同時對生物樣品的多種信息進行確定，從而能夠提高篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的效率。另外，根據本發明的實施例，針對採用RNA作為核酸樣本，從生物樣品提取核酸樣本可以進一步包括:從生物樣品提取RNA樣本，優選RNA樣本為mRNA ；以及基於所得到的RNA樣本，通過反轉錄反應，獲得cDNA樣本，所得到的cDNA樣本構成核酸樣本。由此，可以進一步提高利用RNA作為核酸樣本篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的效率。
[0038]接下來，在得到核酸樣本之後，可以對核酸樣本進行分析，從而能夠確定所得到核酸樣本的核酸序列。根據本發明的實施例，確定所得到核酸樣本的核酸序列的方法和設備並不受特別限制。根據本發明的具體實施例，可以通過測序方法，確定核酸樣本的核酸序列。根據本發明的實施例，可以用於進行測序的方法和設備並不受特別限制。根據本發明的實施例，可以採用第二代測序技術，也可以採用第三代以及第四代或者更先進的測序技術。根據本發明的具體示例，可以利用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種對核酸序列進行測序。由此，結合最新的測序技術,針對單個位點可以達到較高的測序深度，檢測靈敏度和準確性大大提高，因而能夠利用這些測序裝置的高通量、深度測序的特點，進一步提高對核酸樣本進行檢測分析的效率。從而，能夠提高後續對測序數據進行分析時的精確性和準確度。由此，根據本發明的實施例，確定核酸樣本的核酸序列可以進一步包括:首先，針對所得到的核酸樣本，構建核酸測序文庫；以及對所得到的核酸測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數據構成的測序結果。根據本發明的一些實施例，可以採用選自HiSeq2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種對所得到的核酸測序文庫進行測序。另外，根據本發明的實施例，可以對核酸樣本進行篩選，富集AAGAB外顯子，該篩選富集可以在構建測序文庫之前，構建測序文庫過程中，或者構建測序文庫之後進行。根據本發明的一個實施例，針對核酸樣本，構建核酸測序文庫進一步包括:利用AAGAB外顯子特異性引物，對核酸樣本進行PCR擴增；以及針對所得到的擴增產物，構建核酸測序文庫。由此，可以通過PCR擴增，富集AAGAB外顯子(尤其是第3、5、6、8號外顯子)，從而能夠進一步提高篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的效率。根據本發明的實施例，AAGAB外顯子特異性弓丨物的序列不受特別限制，根據本發明的優選實施例，這些AAGAB外顯子特異性引物(針對AAGAB的第3、5、6、8號外顯子)具有SEQ ID NO:5_12所示的核苷酸序列:
[0039]

【權利要求】
1.一種分離的編碼AAGAB突變體的核酸，其特徵在於，所述核酸與SEQ ID N0:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、c.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和 c.481C>T, 任選地，所述核酸為DNA。
2.一種分離的多肽，其特徵在於，與SEQ ID NO:2相比，所述分離的多肽具有選自下列的至少一種突變:p.Phel84Leufs*6、p.Leu252Leufs*14、p.Leu242*、p.Serll8Lysfs*3 和p.Argl61*。
3.一種篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 從所述生物樣品提取核酸樣本； 確定所述核酸樣本的核酸序列； 所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和c.481C>T，是所述生物樣品易患I型點狀掌蹠角化症的指示， 任選地，所述生物樣本為選自人體血液、皮膚、皮下組織的至少一種， 任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，從所述生物樣品提取核酸樣本進一步包括: 從所述生物樣品提取RNA樣本，優選所述RNA樣本為mRNA ；以及 基於所述RNA樣本，通過反轉錄反應，獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構成所述核酸樣本。
5.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，確定所述核酸樣本的核酸序列進一步包括: 針對所述核酸樣本，構建核酸測序文庫；以及 對所述核酸測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數據構成的測序結果，任選地，採用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種對所述核酸測序文庫進行測序， 任選地,針對所述核酸樣本,構建核酸測序文庫進一步包括: 利用AAGAB基因外顯子特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增；以及 針對所得到的擴增產物，構建所述核酸測序文庫， 任選地，所述特異性引物具有如SEQ ID NO:5-12所示的核苷酸序列。
6.一種篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的系統，其特徵在於，包括: 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用於從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用於對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列； 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基於所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0:1相比，是否具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和 c.481C>T,判斷所述生物樣品是否易患I型點狀掌蹠角化症， 任選地，所述核酸提取裝置進一步包括:RNA提取單元，所述RNA提取單元用於從所述生物樣品提取RNA樣本；以及反轉錄單元，所述反轉錄單元與所述RNA提取單元相連,用於對所述RNA樣本進行反轉錄反應，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構成所述核酸樣本。
7.根據權利要求6所述的系統，其特徵在於，所述核酸序列確定裝置進一步包括: 文庫構建單元，所述文庫構建單元用於針對所述核酸樣本，構建核酸測序文庫；以及 測序單元，所述測序單元與所述文庫構建單元相連，用於對所述核酸測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數據構成的測序結果， 任選地,所述文庫構建單元進一步包括: PCR擴增模塊，所述PCR擴增模塊中設置有AAGAB基因外顯子特異性引物，以便利用所述特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增， 任選地，所述特異性引物具有如SEQ ID NO:5-12所示的核苷酸序列， 任選地，所述測序單元包括選自HISEQ2000、SOLiD,454和單分子測序裝置的至少一種。
8.一種用於篩選易患I型點狀掌蹠角化症的生物樣品的試劑盒，其特徵在於，含有: 適於檢測AAGAB基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，所述AAGAB基因突變體具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和 c.481C>T, 任選地，所述試劑為核酸探針或引物， 任選地,所述核酸探針或引物具有如SEQ ID NO:5-12所示的核苷酸序列。
9.一種構建體，其特徵在於，包含權利要求1所述的分離的編碼AAGAB突變體的核酸。
10. 一種重組細胞，其特徵在於，所述重組細胞是通過權利要求9所述的構建體轉化受體細胞而獲得的。
【文檔編號】C12Q1/68GK104178489SQ201310264083
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年6月27日 優先權日:2013年5月23日
【發明者】張學軍, 王俊, 楊森, 肖若, 孫良丹, 張青, 高敏, 崔紅宙, 王文俊 申請人:安徽醫科大學第一附屬醫院, 深圳華大基因科技有限公司