基於細胞的高通量檢測法、其使用方法和試劑盒的製作方法

2023-05-22 02:28:56 2

專利名稱：基於細胞的高通量檢測法、其使用方法和試劑盒的製作方法
基於細胞的高通量檢測法、其使用方法和試劑盒 相關申請的交叉引用本申請要求2007年1月31日提交的美國臨時申請No. 60/898,571 的優先權，在此通過引用將其全部內容併入本申請。本發明涉及基於細胞的高通量檢測法、使用這種檢測法的方法以及 這種檢測法的試劑盒。更具體地，本發明涉及用於高通量細胞檢測法如 免疫測定法中的基於重力的洗滌/過濾步驟。
背景技術：
使用各種方法來檢測細胞和另一種實體(通常是藥物或藥物候選 物、毒素、環境汙染物等)之間的相互作用在本領域是公知的。可以廣 泛地獲得多種這樣的基於細胞的檢測形式。這些檢測法被用於檢測測試 化合物對細胞的一種或多種標記物分子(一般是蛋白質)的表達的作 用。基於細胞的檢測法 一 般測定分化性應答(differentiatWe response)，其需要針對於細胞的細胞壁上或細胞內的分化特異性標記 物分子例如蛋白的免疫測定法。 一般而言，至少要加入結合標記物分子 結合的第一配體(第一抗體或其他實體)，第一配體本身或者第二配體 (例如具有可檢測標記物的第二抗體)通常能夠被流式細胞術、比色法 或放射測定法所檢測到。免疫測定法要求在檢測步驟之前去除未結合配體。通常通過離心洗 滌步驟可以實現這個要求。降低加入一種或多種配體之後的液體水平， 並將洗滌緩衝液加入到溶液內。然後進行洗滌，去除上清液，將細胞留在少量液體內。常常重複洗滌步驟3到8次，以便保證能基本上去除未結合物質。這是一個費時的過程，並受限於個人在任何給定時間內所能處理的 試管數目。兼容所有操作的自動化也不是一件容易的事情。另外，廢棄 的量以及其所來源的部位都有所不同，並造成了細胞的丟失，可能是因 為傾倒或者是因為液體缺少(如果倒的太多)所造成的細胞應激或死 亡。同樣，必須保持足夠多的洗滌次數，以保證去除掉足夠量的背景試 劑，使得可以得到準確的測定值。US 2001/0055776 Al提出了用具有多孔過濾板的真空裝置提供更高 通量形式的用途。低真空是難以控制的，每個孔對低真空的應答都有所 不同。這使得在一些已變幹的孔和其他仍保持太多液體而導致假陽性信 號的孔之間出現了不一致的結果。更重要的是，細胞回收率是非常低 的，雖然在一些情況中可能容許利用剩餘的少數細胞進行檢測。缺乏高通量的、高細胞活力/保留率的檢測法是實現蛋白質組學用於 藥物開發的全部潛能的主要瓶頸。本發明提供了這樣一種解決方案。發明內容在本發明中，細胞被放置於多孔板內並在此生長。當進行檢測時， 可以利用重力洗滌掉任何未結合的配體，而不是利用真空裝置或離心。 然後檢査細胞以檢測出結合的配體。本發明的一個目的是提供用重力流洗滌多孔過濾板中所用細胞的方法。本發明的另一個目的是提供用重力流洗滌具有聚碳酸酯濾膜的多孔 過濾板中所用細胞的方法。本發明的另一個目的是提供用重力流洗滌具有親水性聚碳酸酯濾膜 的多孔過濾板中所用細胞的方法。本發明的另一個目的是提供用重力流洗滌具有孔徑約為3微米的親 水性聚碳酸酯濾膜的多孔過濾板所用細胞的方法。本發明的一個目的是提供用重力流洗滌多孔過濾板檢測法所用細胞 以獲得細胞的高保留率的方法。本發明的一個附加目的是提供檢測靶特異性試劑的方法，包括步驟a. 選出具有選定的靶分子的細胞，所述靶分子位於細胞壁上或細胞 內的位置上；b. 在多孔過濾板上培養細胞；c. 用包括針對細胞內或細胞上的選定的靶分子的配體的試劑接觸細胞，配體選自由包括可檢測標記物的配體和能夠附著於含有可檢測標記 物的第二配體的配體組成的組。d. 用重力流洗滌細胞至少一次，以便去除任何未與細胞的選定的靶分子結合的試劑，以提供洗滌過的細胞；和e. 搜索配體，以指示出是否存在靶分子(包括蛋白的功能狀態的變 更例如蛋白質的磷酸化)。本發明另一個目的是提供作為本方法的配體的第一和第二抗體。 本發明另一個目的是提供作為本方法的配體的第一和第二抗體，以 及通過利用對與第一抗體結合的第二抗體的螢光、化學發光、比色或放 射性檢測來檢測第一抗體與靶分子的結合。本發明的一個目的是提供用於對洗滌液體和未結合試劑進行重力過 濾的裝置，其是由過濾板、載體板、以及收集架組成的，所述過濾板具 有兩個或多個孔，每個孔的底部都覆蓋有多孔膜；所述載體板具有與過 濾板的孔數目相等且與過濾板的孔相對準的孔，載體孔具有開放的頂部 和底部。本發明的另一個目的是提供具有孔徑約1到約5微米的親水性膜的 過濾板，孔徑優選地約為3微米。本發明的一個附加的目的是提供具有其內徑至少要比與其相互作用 的過濾板的孔的外徑稍微更大的載體板。本發明的另一個目的是提供具有親水性膜的過濾板和具有其內表面 已經變成親水性的孔的載體板。本發明的一個目的是提供由多孔過濾板、載體板、用於通過重力流 進行細胞洗滌的廢液收集器組成的試劑盒。本發明的另一個目的是提供由具有親水性膜的多孔過濾板、載體 板、用於通過重力流進行細胞洗滌的廢液/試劑收集器組成的試劑盒。本發明的另一個目的是提供由具有孔徑約為3微米的親水性膜的多 孔過濾板、載體板、用於通過重力流進行細胞洗滌的廢液/試劑收集器、 能夠結合標記物蛋白的第一抗體和能夠結合第一抗體的第二抗體組成的 試劑盒，其中第二抗體具有能夠被檢測到的實體。本發明的目的是提供具有能夠通過螢光、比色或放射性而被檢測到 的第二抗體的試劑盒。本發明的目的是提供具有能夠被流式細胞術檢測到的第二抗體的試 劑盒。


圖1顯示了本發明的裝置的實施方式的分解透視圖。圖2顯示了本發明的裝置的實施方式的分解橫截面圖。圖3顯示了本發明的裝置所用的過濾板的實施方式的俯視圖。圖4顯示了本發明的裝置所用的虹吸裝置的橫截面圖。圖5顯示了另一個實施方式的橫截面圖。圖6用框圖形式顯示了本發明的方法。圖7用框圖形式顯示了本發明的第二個方法。圖8顯示了實施例1的數據。圖9顯示了實施例2的數據。圖10A和B顯示了實施例3的數據。
具體實施方式
本發明是一種快速的、基於細胞的高通量檢測法以及相關的試劑盒 和使用方法，其可以被用於例如篩選測試化合物對細胞生長和分化的作 用，如細胞的標記物蛋白的表達所指示的那樣。下面詳細描述了本發明 的組分。簡單地，將細胞培養在過濾板上。過濾板包括具有孔隙的低磷 光背景的材料，其容許細胞培養於過濾板上並被原位洗滌。在洗滌步 驟，通過使用重力過濾使得細胞丟失最小化。板上的細胞與試劑接觸，所述試劑包括與細胞的標記物分子(通常 是蛋白)和可檢測試劑特異性結合的配體。可檢測試劑可以是與螯合劑 螯合的稀土元素離子，同時螯合劑與配體結合，或者可檢測試劑可以是 任何商品化可獲得的抗體等，其具有與之所形成的或者與之相附著的可 檢測實體。如果需要，可以在細胞與試劑接觸之前去除細胞培養基。任 選地，可以將試劑直接地加入到細胞培養上清液中。直接加入避免了附 加的洗滌步驟，還增加了檢測法的高通量性能。在洗滌細胞去除了未結合試劑之後，可以通過螢光、化學發光、放 射性或比色測定出與可測試試劑相關的檢測。檢測到實體表示配體與標 記物分子的結合，因此可以被用於檢測出是否存在標記物分子。在一個 利用螢光的實施方式中，利用對螢光的時間分辨(time-resolved)螢光 測定可以使得基於細胞的檢測法的高螢光背景的特徵最小化。在本發明的一個實施方式中，配體是單獨的第一抗體，與使用第一 抗體和第二抗體的檢測法相比較，這縮短了處理時間。同樣，可以使用 兩個配體例如第一和第二抗體，或者與生物素結合的第一配體以及包括 抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素的第二抗體。除此之外，本發明的方法還可以用於監測細胞分化，評價細胞的活 力，或者篩選測試化合物對標記物蛋白表達的各種作用。因為利用其中培養有細胞的同一過濾板可以進行標記物蛋白檢測，方法容易適用於高 通量篩選形式，因此解決了在篩選測試化合物的體內所需作用或非所需 作用中的重要瓶頸。本發明也提供了用於本發明的篩選和檢測方法的測試試劑盒。試劑 盒包括標記物分子的配體、作為標記物分子的配體的一部分的可檢測實 體或者僅與第一配體相附著的第二配體、適合於培養細胞的過濾板、用 於把持過濾板的載體板和過濾液收集板。試劑盒中的過濾板優選地具有 有著孔隙的低磷光背景的材料，所述孔隙大小容許通過重力流原位洗滌 培養於過濾板上的細胞。任選地，測試試劑盒也包含能夠表達標記物蛋 白的細胞。如果需要，測試試劑盒還可以提供本發明的各種方法的說明 書。本發明的檢測和篩選方法所用的細胞並不限於任何特殊類型的細 胞，但是一般都是哺乳動物細胞，優選地是人類細胞。這些細胞包括原 代細胞培養物以及腫瘤或正常細胞細胞株。可以培養例如體外維持單個 或多個細胞。在一個實施方式中，細胞是能夠進一步分化的祖細胞例如 骨、睪丸、或復層扁平上皮的幹細胞、胚胎幹細胞、祌經元祖細胞、神 經膠質祖細胞、或造血祖細胞包括粒細胞、單核細胞、紅細胞、巨核細 胞、髓系和淋巴系幹細胞。其中可以培養特殊的細胞類型以便表達所檢測的標記物分子的任何 培養基都可以用於本發明的方法。對於給定細胞類型的合適培養基的選 擇以及其他培養條件例如溫度和二氧化碳百分比都在本領域技術人員的技能範圍之內(見例如，ANIMAL CELL CULTURE, R. I. Freshney， ed., 1986)。本發明所能檢測的標記物分子通常都是蛋白，通過所培養的細胞的 性質可以確定出所述標記物分子，其包括細胞表面蛋白和細胞內蛋白。 本發明並不限定使用任何特殊標記物蛋白。如果細胞內標記物蛋白是可 檢測的，優選地，在與第一配體或者與含有可檢測實體的第二配體孵育之前，如本領域已知的那樣固定並透化細胞。本發明所能檢測的細胞內標記物蛋白包括但不限於血紅蛋白A、細胞角蛋白、細胞因子(例如 IL-4、 IFNY)、肌動蛋白、信號傳導分子、耐酒石酸的酸性磷酸酶(成 骨細胞分化的標記物)、von Willebmnd因子、和神經元祖細胞分化標 記物如GFAP、 MAP2、 (3微管蛋白m、禾卩nestin。可以被檢測的用於評價各種測試化合物的毒性的標記物蛋白是那些 在多種細胞類型中都存在的蛋白，包括蛋白例如醛脫氫酶(ALDH)、 膠原、3-磷酸甘油醛脫氫酶、延伸因子la、和Y肌動蛋白。可以被檢測 的用於評價測試化合物對細胞周期的作用的標記物蛋白包括各種微管和 微絲蛋白。可以檢測其他標記物蛋白(細胞類型或細胞階段特異性蛋 白)，以評價測試化合物對細胞分化的作用。這些標記物蛋白包括例如 造血標記物如血紅蛋白A、血型糖蛋白A、 gpIIWIIa、促紅細胞生成素 受體、CDllb、 CD19、 CD33、 CD34、 CD36、 CD41、 MOl、 OKT3、 OKT4、 OKT8、 OKTll、 OKT16、 OKMl、 OKM5、 Leu7、 Leu9、 Leu Ml、和LeuM3;神經元特異性標記物蛋白例如乙醯膽鹼酯酶；神經膠 質特異性標記物蛋白例如膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和髓磷脂鹼性蛋 白；和其他只在特定細胞內可見的蛋白例如人乳脂肪球抗原 (HMFG)、角蛋白和晶體蛋白。任選地，利用與每種標記物蛋白特異性結合的配體可以同時或依次 檢測同一細胞或細胞培養物中的兩種或多種標記物蛋白。對於同時檢測 而言，例如可以使用對其相應的可檢測實體具有可區別的激發和/或發射 最大值的不同的配體。與標記物蛋白特異性結合的配體通常與標記物蛋白結合的親和力至 少是所述配體與合適的結合檢測法中所用的其他蛋白的結合親和力的約 2到3倍，優選的是5到10倍，甚至更優選的是20倍。如果配體例如 是抗體，合適的檢測法包括免疫化學檢測法例如Western印跡放射免疫 測定法、或免疫細胞化學檢測法。優選地，與標記物蛋白特異性結合的抗體在免疫化學檢測法中不能檢測出其他蛋白，以及可以從溶液中免疫 沉澱出標記物蛋白。用放射免疫測定法、螢光猝滅法或其他本領域已知 的合適檢測法都可以檢測出配體和受體的結合親和力或者作為受體的配 體與其自身的配體的結合親和力。抗體例如單克隆或多克隆抗體、單鏈抗體、Fab片段、(Fab')2片段等都可以被便利地用於本發明的方法。術 語"抗體"在本說明書和權利要求書中都打算包括所有這些內容。在本發明的另一個實施方式中，第一配體例如第一抗體或生物素、 抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素標記的配體與標記物蛋白結合。然 後與稀土元素螯合劑或其他可檢測實體綴合的第二配體與第一配體結 合。例如，第一配體可以是第一抗體以及第二配體可以是第二抗體。多 種合適的第一-第二抗體對都是本領域公知的，可以被用於本發明的實施 方式。同樣，第一配體可以包括生物素基序以及第二配體可以包括抗生 物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素。如果需要，第一配體可以包括抗生物 素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素以及第二配體可以包括生物素。也可以使 用本領域已知的其他特異的結合對。檢測可以是定性的或定量的。優選地用利用時間延遲的方法檢測熒 光，這降低或消除了非特異的背景螢光對檢測信號的影響。優選的檢測 方法是時間分辨螢光測定法。也可以使用放射性實體以及使用各種比色 實體。去除未結合配體所必需的洗滌步驟造成了免疫測定法的勞動密集型 特徵並減少了其通量。另外，洗滌期間或者細胞培養物轉移期間的細胞 丟失一直都是重要的問題。在本發明的檢測法中，通過使用多孔過濾板 基本上已經解決了這個問題，在多孔過濾板上培養細胞並用重力原位洗 滌細胞。過濾板的平均孔徑足以容許培養基、洗滌液和未結合配體等在 重力作用下通過，同時保留下培養細胞。在孔內缺少足夠多體積的液體 時，平均孔徑使得表面張力作用足以讓過濾板作用為具有從例如約5pm 到30pm直徑範圍內的細胞的培養板。本發明方法所用的過濾板通常具有約0.45pm到5pm之間的平均孔徑，優選的約1.0和5.0pm之間，以 及甚至更優選的約3.0微米。因此，用於本發明方法的理想的過濾板是細胞培養兼容的，並且至 少在其表面構建有低磷光背景和低非特異性蛋白結合性能的膜材料。例 如如用螢光分光光度計(例如EG&G Wallac的Victor或Victor2 或等 價裝置)所測定的那樣，可接受的低磷光背景優選地約為lO,OOOcoimts 或更少，更優選地為約5000counts或更少，甚至更優選地約為 500coimts或更少。另外，板應當具有可接受的高重力過濾率以及具有頂 蓋和底蓋，以使得蒸發最小化。板優選地是公知的96孔或384孔格 式，以及具有透明的膜材料，以容許直視細胞。利用常規篩查技術可以研究適用於本發明的過濾板的合適材料。具 有低磷光、低非特異性蛋白結合性能、與細胞培養要求相兼容的性能以 及能夠形成具有容許細胞被培養於過濾板並被原位洗滌的平均直徑的孔 隙的材料例如聚碳酸酯一般都應當是合適材料。檢査多種商品化可獲得的過濾板，以確定出其用於本發明的檢測法 的適用性。來自麻省Millipore Corporation of Billerica的MultiScreen PCF已經被確定出其具有近5000counts的背景磷光，其激發波長為 340nm以及發射波長為615nm。甚至更為優選的過濾板是來自麻省 Millipore Corporation of Billerica的被稱作"MultiScreen Fluoresence" 板的黑色聚碳酸酯模板。被用於篩選其影響標記物分子表達的能力的測試化合物可以是本領 域已知的任一藥物試劑或者可以是先前未知其具有任何藥物活性的化合 物。測試物可以是天然存在的或者是在實驗室合成的。它們可以是從微 生物、動物或植物中分離到的，或者可以是重組生成的或者通過本領域 已知的化學方法合成的。因為本發明有助於高通量篩選，測試化合物通常是從化合物文庫中 獲得的。生成測試化合物的組合文庫的方法是本領域已知的，並包括但不限於形成"生物學文庫"、空間平行定位的固相或液相文庫、需要去巻積(deconvolution)的合成文庫法、"一珠一物(one-bead one-compound) "文庫法、和利用親和色譜選擇的合成文庫法(15-21)。 生物學文庫方法限定於多肽文庫，而其他四種方法可以適用於多肽、非 肽寡聚體或小分子的化合物文庫(13)。但是，本發明並不受限於任何 用於生成潛在測試化合物的方法或者潛在測試化合物的來源。可以將溶液中的、珠、質粒或噬菌體上的測試化合物呈遞給細胞， 見美國專利No. 5,223，409，在此通過引用將其內容併入本申請。任選 地，可以定量出測試化合物影響標記物分子表達的程度。例如，可以定 量出存在測試化合物時與稀土元素離子相附著的螢光(第一螢光)，可 以測定出沒有測試化合物時與稀土元素離子相附著的螢光(第二熒 光)。用第一螢光減去第二螢光就得出了兩個螢光之間的差，因此得到 了測試化合物影響標記物分子例如蛋白的表達的程度。優選地，第一和 第二螢光與相同類型的可檢測實體(在這種情況中是稀土元素離子如 銪)相附著，使得可以進行有效的比較。本發明的裝置優選地包括如圖1所示的三個組分多孔過濾板2、 載體板4和濾液收集架6或集合管。多孔過濾板2具有一系列2個或多 個孔8，其從基本上平坦的上表面10向下延伸。孔的數目可以取決於所 需的體積和板2的大小。每個板2的孔數範圍通常為8、 24、 48、 96或 384個。每個孔8都具有與孔下方相附著的多孔濾膜12，其選擇性地隔離開 孔8。載體板4具有一系列開放的貫穿其中的孔10。孑L 10具有比多孔 板2的？L 8的外徑稍微更大的內徑。孔10有著與多孔板2的孔8相等的 數目並與多孔板2的孔8對齊。在一個實施方式中，載體板4的孔10的內徑是足夠大的，使得當 多孔板2被插入到載體板4內時，在載體孔10的內徑和板孔8之間有著 空氣間隙(約0.2到0.5毫米)。在另一個實施方式中，載體板4的孔10的內徑是固有親水性的例如通過選擇親水性聚合物，或者是通過使用塗層使得其為親水性的。或者，或另外地，載體板的孔10的開放底部可以逐漸變細形成流經其中 的液體的收集管或噴嘴14。這些都限制了在洗滌和本發明的其他液體步 驟期間的交叉汙染和液體飛濺。在另一個實施方式中，支架6可以含有虹吸裝置16例如吸收墊或 一組稜紋(ribs)(圖5所示)，其位於多孔板2的孔8下面的支架上。 該虹吸裝置被用於將在孔8的濾膜外底面上形成的液滴更為快速地和完 全地吸入到濾液收集架6中。虹吸的位置遠離濾液的底部。在US 6，989，099描述了一些這樣的虹吸裝置，在此通過引用將其內容併入本申 請。膜可以是由聚合物形成的微孔膜，所述聚合物選自烯烴例如聚乙烯 包括超大分子量聚乙烯、聚丙烯、EVA共聚物和oc烯烴、茂金屬烯烴聚 合物、聚碳酸酯、乙烯共聚物例如PVC、聚醯胺例如尼龍、聚酯、纖維 素、乙酸纖維素、再生纖維素、纖維素複合物、聚碸、聚醚碸、聚芳香 碸、聚苯碸、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯及其摻合物。所選的膜取決於本申請所用的孔的大小、所需的流體特徵等。 膜優選地是選自聚碳酸酯、PVDF、尼龍(例如尼龍66)或聚醚碸 (PES)。優選地，膜是固有親水性的或者通過加入被摻入到基礎聚合物中的 第二種聚合物(例如PVP和聚碸)或者通過使用交聯於、移植到或者其 他不可逆地塗層到膜上的塗層使得膜變為親水性的，所述方法在本領域 是公知的，見US 4，618，533和US 4，944，879。優選的膜是具有如US 4,618,533所採用的親水性塗層的聚碳酸酯、PVDF或PES。這些膜可以 來自各個來源，包括Millipore Corporation of Billerica Massachusetts的商 標名為Durapore⑧的親水性PVDF膜、Millipore Express 或Millipore Express Plus親水性PES膜或IsoporeTM親水性聚碳酸酯膜。孔徑應當是足夠小的，使得細胞不會被拖拉到膜孔內或流經過膜 孔，但是孔徑應當足夠大，以容許好的流動性能，其最優尺寸將取決於細胞的類型。其直徑優選地是從約0.45微米到約5微米，更優選地是在 約1微米和約3.5微米之間，以及最優選地是在2和3微米之間。大多 數細胞的直徑都大於7微米(除了血小板為3微米和紅細胞為5微米 外)，使用孔徑約為3微米的膜可以避免細胞流經孔隙，同時提供了可 接受的流速。可以使用對稱的或不對稱的膜。對稱膜沿其整個厚度都具有基本上 一致的孔徑(從膜的第一面到第二個相對面的孔徑差異一般小於2 倍)。不對稱膜的孔徑至少在沿其膜厚度的一部分以及常常是在沿其膜 厚度的整個部分上都有著不同(從膜的第一面到第二個相對面的孔徑差 異一般為2到1000倍)。在一個實施方式中，對稱膜是優選的。在另 一個實施方式中，具有面向細胞的緊密面的不對稱膜是優選的。其開放 面的孔徑小於約5微米並朝向細胞的不對稱膜在本發明的另一個實施方 式中是優選的。本發明的裝置也可以具有多孔板2、載體板4和/或收集板6上的導 向膜，以便將不同的組件排列對齊在一起。如該實施例所示，載體板4 上的邊框18被用於將載體板放置於收集板6的中央並與其對齊。通過 將多孔板的孔8插入到載體4的孔10將多孔板2放置到載體板4的中 央。如果需要，也可以使用調準栓、板(2,4)上的knocked off corners 和其他這種公知的裝置，以保證只能按所需的一個方向裝配這些板。如圖3所示，多孔板2A可以是被特定設計用於生長細胞的板。這 禾中板來自 Millipore Corporation of Billerica， Massachusetts 並按 Multiscreen CaC02細胞培養板銷售。它包含孔8A，與每個孔8A緊鄰 排列的是孔隙9，其給密封的孔(沒有顯示)提供了通路，所述孔含有 細胞生長於其中的培養基。裝配本發明的裝置，使得多孔板2或2A的孔8或8A至少被部分插 入到載體板6的孔10內。然後將載體板4安裝並固定於收集板6上，或 者在插入多孔板2或2A之前將其固定。本發明的一個方法(圖6所示)是在第一個步驟100中，首先在被 放置於細胞培養架(沒有顯示)上的多孔板2或2A內生長細胞，知道 細胞已經得到所需的密度。在第二個步驟102中，從培養架上取出多孔 板2或2A，並如上所述將其放置到載體板4內。載體板4己經被固定於收集板6上，或者如果沒有固定，將其和已 經匹配的多孔板2 —起固定到收集板的上方。每個孔8都含有支持細胞活力的低水平的液體。但是，該水平不足 以克服濾孔的阻力，不會發生流動。在第三個步驟104中，根據所用的檢測系統，向一個或多個孔內加 入至少一種試劑，並容許孵育，以便它可以與細胞或細胞所表達的標記 物分子相互作用。然後在第4個步驟106中，通過簡單地加入洗滌緩衝 液(例如水、緩衝水、鹽水等)來洗滌未結合試劑一次或多次，所加入 的洗滌緩衝液的體積生成的液面高度足以容許液體在重力的影響下穿過 濾膜的孔隙並留到孔外，流經載體板10並流到收集板6內。如果需要，可以依次加入附加的試劑例如第二抗體，以及在添加間 隔按需地進行一次或多次洗滌，以便去除未結合物質，因此將其在檢測 步驟中出現的通常由未結合物質引起的背景噪音。然後在最後一個步驟108中檢測是否存在標記物分子以及其所需的 數量。通常的檢測物試劑包括但不限於抗體、染料、配體、化學發光性 化學物、放射性同位素和化合物等。利用方法例如螢光測定法、流式細 胞術、比色法、放射活性、光密度測定等一般都可以檢測出這些檢測物 試劑。在本發明的另一個方法中，在第一個步驟100A中，細胞生長在其 他地方，然後將其加入到多孔板2的孔8內。從此開始，過程與上述的 過程基本相同。在各種方法中，特別是在利用被加入到多孔板2的孔8內的細胞的 方法中，至少在使用之前預溼載體板4。多孔板2的濾膜優選地也是被 預溼的，以便增強所需的液體流動。通過分別預溼每個或兩個組分或者 當通過與裝配亞單元同步的預溼進行兩個組分的預溼可以實現這一點。可以用緩衝平衡鹽溶液等預溼濾膜和載體板4的表面。已經發現當例如通過使用血漿處理使得載體板變為親水性時，獲得 液體流經系統的重力所必需的時間就可以減半。常用系統一般會衝洗約 2到約5分鐘，這取決於各種參數例如所用的液體、孔內的液體體積、 孔內的細胞密度。具有親水性載體板的同一系統衝洗約1到2分鐘。如果系統是重力驅動的，重要的是所加入的液體的量到蓄水高度 (headheight)或者液體體積的壓力本身可以驅動過濾過程。一般而言，已經發現使用親水性聚碳酸酯的3微米孔徑膜的96孔 板的孔可以含有約100pL液體，且不會出現任何流動。加入洗滌溶液形 成了足夠高的引起基於重力的液流按可接受的速度流經系統的蓄水高 度。通常使用約100到25(VL添加的洗滌液，這取決於孔的體積和洗滌 所需的速度和充分性。在一些情況中，使用振動或搖動可以有助於加速過程，儘管這並非 必需的。一旦液體水平達到足夠低的水平，過濾就終止了，因為液體不再能 夠克服對抗流動的內在阻力。這是本發明的一個有趣的和有用的特點， 因為它避免了孔的乾涸，如在真空過濾或離心中所發生的那種情況。另 外，因為施加於細胞和液體的力(重力)是輕微的，所以只有很少的細 胞損傷或裂解以及很少的或沒有會干擾檢測的液體泡沫形成現象。最後，與真空離心(其力高到足以將細胞強力拖拉到濾膜內和/或流經濾 膜)相比較，過濾引起的細胞丟失被最小化。本發明可以使用自由漂浮(懸浮)細胞和粘附細胞。如果使用粘附 細胞，細胞優選地生長於載體例如微載體珠、非織物或其他支架系統， 使得液體仍然能夠進入到通往板中孔隙的通道。同樣，粘附細胞可以生 長到次最佳密度或者可以在操作之前用糜蛋白酶處理細胞。用任一商品化的液體操縱機械手可以容易地將本發明的板、試劑盒 和方法自動化。所需做的只是調節每個步驟中所加入的液體量和/或如上 述的加入預溼步驟以便可以獲得所需的液流，以及調節步驟之間的間隔 時間以及步驟數以便保證每個洗滌步驟都進行足夠長的時間，以容許未 結合物質的充分清除。實施例1用以下方案實施基於重力的過濾用於基於細胞的檢測法中的細胞將Jurkat細胞(T淋巴母細胞細胞株)培養於兩個含有3微米孔徑 的親水性聚碳酸酯濾膜的96孔過濾板上(100jnL終體積，含有10MFCS (胎牛血清)的完全培養基)檢測法包括每孔100，000個細胞。在檢測當天，用PBS預溼每個過濾板的底部，並將其放入到載體板內。然後將所裝配好的裝置放入到過濾液收集器上。 通過每個孔內加入200jiL洗滌緩衝液(含1%FBS或BSA的PBS)洗滌細胞。一旦向孔內加入洗滌緩衝液，液體開始從孔內流出，形成液滴經重 力滴入到收集器內(而細胞仍保留在孔內)。流出的液體被收集於液體 收集器內。在約2分鐘後，達到平衡，此時不再有或者只有很少的液體從孔內 流出。在孔內仍保留有約10(HiL液體。加入另外的20(HiL洗滌緩衝液。在一個板中，用CD45特異性抗體(抗CD45)處理細胞(發明 板)。用對照(同位素)抗體(兩種情況中的抗體終濃度都約為 3pig/mL)處理另一個板(對照板)，並孵育30分鐘。在孵育期間，仍 保留了孔內的液體，且細胞沒有出現乾涸。通過如上面的步驟3和4所示的洗滌3次來去除過量的未結合抗體。將第二抗體Alexa488綴合抗體(來自Invitrogen公司)加入到每個 板的孔內，並孵育30分鐘，然後如上面步驟3和4所示的洗滌3次。利用Guava benchtop流式細胞儀分析所製備的細胞樣品(檢測熒 光)。如圖8所示，直方圖顯示出清晰的經抗CD45抗體染色的細胞群 (左側)。只經同位素抗體染色的對照細胞顯示於右側。圖8很好地顯 示了對螢光測定值的列表總結。實施例2在這個實施例中，根據實施例1的方案測試細胞，並將其與經US 2001/0055776A1的真空方法製備的細胞洗滌進行比較。 在本發明的方法中，洗滌細胞6次。對於真空方法，施用0.4微米孔徑的聚碳酸酯過濾板，並在如所引 用的上述申請所述的約5英寸汞柱洗滌3次。用基於ATP的發光檢測法測定出兩個板中的殘餘細胞。 如圖9所示，在圖X軸的下方列出了輸入到每個孔內的細胞數。分 別顯示了本發明的方法和裝置以及現有技術的方法和裝置的回收百分 比。從實心條中延伸出的線性條表示在個體孔內發現的相對於圖的實心 條所示的平均值的變異。可以清楚地看到，本發明提供了比現有技術的真空方法令人驚訝的和出人意料的顯著更好的細胞保留率。在多數情況 中，該性能都要比現有技術高出4倍。實施例3用基於重力的過濾法實施基於細胞的凋亡檢測。活細胞對螢光染料標記的caspase抑制物(FLICA)的暴露造成了 凋亡細胞對這些試劑的攝取，因為FLICA結合活化的caspase (Smolewski et al.， 2001)。用漸增濃度的公知的凋亡誘導劑(星形孢菌 素)在37。C處理細胞2個小時。在孵育之後，用FLICA處理細胞。通 過用洗滌緩衝液經重力洗滌細胞4次，從未凋亡細胞中去除未結合的 FLICA。在重力洗滌之後，用流式細胞儀檢測經FLICA (FAM-VAD-FMK， pan-caspases FLICA)標記的細胞。圖IOA和B顯示了經誘導的樣品(10、 0.63、 0.06微摩爾星形孢菌 素)和未經誘導的對照樣品中的經FAM-VAD-FMK染色的細胞的流式 細胞直方圖。凋亡細胞群的增加(每個直方圖中的綠色群)作為漸增濃 度的誘導劑(星形孢菌素)的函數對於本領域任何人員都應當是顯而易 見的。圖10B顯示了基於流式細胞分析的數字標繪的FAM陽性群百分 比。注意劑量效應。
權利要求
1.檢測靶特異性試劑的方法，包括步驟a.選擇具有選定的靶分子的細胞，所述靶分子位於細胞壁上或細胞內的位置；b.在多孔過濾板上培養所述細胞；c.用包括針對所選定的細胞內或細胞上的靶分子的配體的試劑接觸所述細胞，所述配體選自含有可檢測標記物的配體和能夠與含有可檢測標記物的第二配體相附著的配體；d.用重力流洗滌細胞至少一次，以便去除任何未與細胞的選定的靶分子結合的試劑，以提供洗滌過的細胞；和e.搜索配體，以指示出是否存在靶分子。
2. 檢測耙特異性試劑的方法，包括步驟a. 選擇具有選定的耙分子的細胞，所述靶分子位於細胞壁上或細胞 內的位置；b. 在多孔過濾板上培養所述細胞；c. 用包括針對所選定的細胞內或細胞上的靶分子的配體的試劑接觸 所述細胞，所述配體選自含有可檢測標記物的配體和能夠與含有可檢測 標記物的第二配體相附著的配體；d. 用重力流洗滌細胞至少一次，以便去除任何未與細胞的選定的耙 分子結合的試劑，以提供洗滌過的細胞；和e. 搜索配體，以指示出是否存在靶分子。
3. 權利要求l的方法，其中板具有聚碳酸酯濾膜。
4. 權利要求1的方法，其中板具有親水性聚碳酸酯濾膜。
5. 權利要求1的方法，其中濾膜是具有約3微米孔徑的多孔聚碳 酸酯濾膜。
6. 權利要求1的方法，其中濾膜是具有約3微米孔徑的多孔的、 親水性的聚碳酸酯濾膜。
7. 權利要求1的方法，其中所述配體具有選自由螢光材料、放射 性材料、化學發光劑、光吸收和光密度測量物組成的組中的可檢測的實 體。
8. 權利要求l的方法，其中分子是標記物蛋白。
9. 權利要求1的方法，其中分子是標記物蛋白，所述蛋白是細胞 特異性標記物蛋白。
10. 權利要求1的方法，其中分子是標記物蛋白，所述蛋白是細胞 表面蛋白。
11. 權利要求1的方法，其中分子是標記物蛋白，所述蛋白是細胞 的細胞內蛋白。
12. 檢測免疫測定的方法，包括步驟a. 選擇具有選定的靶蛋白的細胞，所述靶蛋白位於細胞壁上或細胞 內的位置；b. 在多孔過濾板上培養細胞，其中濾膜是由具有約3微米標定孔徑 的多孔的、親水性的聚碳酸酯構成的；c. 用至少一種針對所選定的靶蛋白的抗體接觸細胞，所述至少一種 抗體選自由含有可檢測標記物的抗體和能夠與含有可檢測標記物的第二 抗體相附著的抗體組成的組；d. 用重力流洗滌細胞至少一次，以便去除任何未與所選定的靶蛋白 結合的抗體，以提供洗滌過的細胞；和e. 用檢測裝置搜索抗體，以指示出是否存在靶蛋白。
13. 檢測靶特異性試劑的方法，包括步驟a. 選擇具有選定的靶分子的細胞；b. 在多孔過濾板上培養所述細胞，其中所述過濾板具有低螢光背景 和容許細胞培養於板上並經重力原位洗漆的孔；c. 用包括針對細胞的選定的靶分子的第一配體接觸細胞；d. 用重力流洗滌細胞至少一次，以便去除任何未與細胞的選定的靶分子結合的第一配體；e. 加入能夠附著第一配體並具有可檢測標記物的第二配體；f. 用重力流洗滌細胞至少一次，以便去除任何未與細胞的選定的靶 分子結合的第二配體，以提供洗滌過的細胞；和g. 搜索可檢測標記物，以指示出是否存在所述靶分子。
14. 用於實施免疫測定的試劑盒，包括多孔板、多孔載體和濾液收 集架，所述多孔板具有孔徑為約1到約3微米的親水性膜，所述多孔載 體具有開放的頂部和開放的底部且所述多孔載體的孔與過濾板的孔對齊 並能夠對準過濾板的孔，所述濾液收集架能夠用其上表面支持所述載體 的底面，且所述載體的上表面支持所述過濾板。
15. 權利要求14的試劑盒，其中膜是3微米孔徑的聚碳酸酯濾膜。
16. 權利要求14的試劑盒，還包括用於結合細胞的標記物蛋白的第—抗體o
17. 權利要求14的試劑盒，還包括用於結合細胞的標記物蛋白的第 一抗體以及含有可檢測實體的第二抗體，其中第二抗體能夠結合第一抗 體。
18. 權利要求14的試劑盒，還包括一種或多種洗滌緩衝液。
全文摘要
在本發明中，細胞被放置於多孔板內並生長其中。當進行檢測時，利用重力洗滌掉任何未結合的配體，而不是利用真空或離心。然後檢查細胞，以檢測出結合的配體。為了進行洗滌步驟，板被放置於具有與過濾板的孔相對準的開放孔的載體板內，或者可以使用與過濾板底部相附著的虹吸裝置或排水管。加入足夠量的洗滌液，以容許通過重力的作用發生過濾。細胞被保留在孔內的效率是其他快速方法的4倍。
文檔編號G01N33/566GK101236203SQ20081000889
公開日2008年8月6日 申請日期2008年1月30日 優先權日2007年1月31日
發明者J·Y·帕克 申請人:米利波爾公司