一種酵母培養物及其製備方法與改善瘤胃發酵中的應用的製作方法
2023-05-22 03:39:06 2
專利名稱：一種酵母培養物及其製備方法與改善瘤胃發酵中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種酵母培養物及其製備方法與改善瘤胃發酵中的應用。
背景技術：
隨著飼用抗生素的普及甚至濫用，其所帶來的耐藥性、藥物殘留等負面效應日益突出。歐盟自2006年起全面禁止抗生素作為飼料添加劑；美國近年來幾乎凍結了所有新型抗生素的審批；我國政府也先後頒布了一系列飼料藥物添加劑使用規範。飼用抗生素的淡出是畜牧業發展的必然趨勢，而開發利用可選擇性促進腸道有益菌增殖、改善腸道內環境、 提高動物機體免疫力，同時不為腸道內酶所分解、不產生耐藥性、無殘留的新型綠色飼料添加劑是畜牧業可持續發展的必然趨勢，酵母培養物就是其中一種。酵母培養物(Yeast culture, YC)是指由酵母菌在特定工藝條件下經充分發酵後所形成的微生態製品，主要包括酵母細胞代謝產物、經發酵後變異的培養基以及少量已無活性的酵母細胞。酵母培養物的複雜成分主要包括酵母細胞內的營養物質和酵母細胞的發酵代謝產物，有維生素、胺基酸、消化酶、有機酸、多糖以及未知的生長因子等。作為集營養、 保健於一體的新型飼料添加劑，酵母培養物通過調控瘤胃微生物區系有效提高反芻動物對飼料的利用率，這也是近年來反芻動物學和營養學研究的熱點。酵母培養物的質量受菌種、發酵生產工藝以及檢測手段等因素的影響。酵母菌在不同的培養環境下，如不同的溫度、溼度或酸鹼環境尤其是底物成分，會產生不同的發酵產物，而這其中又包含大量的未知生長因子。生產酵母培養物時所使用的培養基和發酵工藝控制參數對其終端產品中代謝產物的組成、濃度及其生物利用率的穩定性有著至關重要的影響。即便在使用相同酵母菌種的情況下，不同培養基組成或不同的發酵生產控制工藝會導致酵母培養物產品中代謝產物組成和濃度出現明顯的差異。
發明內容
本發明的目的是提供一種酵母培養物及其製備方法與改善瘤胃發酵中的應用。本發明所提供的所述酵母培養物的製備方法，包括如下步驟將釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)進行液體發酵後，收集發酵液,除去所述發酵液中的所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)細胞得到的無菌液體即為所述酵母培養物。在上述方法中，所述液體發酵在如下條件下進行20-40°C、100-200轉/分鐘振蕩培養10-30小時後再靜置培養10-60小時；該振蕩培養是在有氧條件下進行的，該靜置培養是在厭氧條件下進行的。在上述方法中，所述液體發酵所使用的發酵培養基的溶劑為水，溶質由如下I) -3) 的物質組成I)碳源，所述碳源為如下A)_C)中的任一種A)葡萄糖、蔗糖和糖蜜；
B)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任兩種；C)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任一種；2)氮源，所述氮源為如下D)_F)中的任一種D)酵母膏、蛋白腖和硫酸銨；E)酵母膏、蛋白腖和硫酸銨中的任兩種；F)酵母膏、蛋白腖和硫酸銨中的任一種；3)無機鹽，所述無機鹽為 KH2P04、MgSO4, MnSO4, CaCl2, GuSO4, ZnSO4 和 FeSO4 ；所述碳源在所述發酵培養基中的總濃度為30_300g/L ;所述碳源具體可由IOg/ L-100g/L 葡萄糖、10g/L-100g/L 鹿糖和 10g/L-100g/L 糖蜜組成；所述氮源在所述發酵培養基中的總濃度為25_640g/L ;所述氮源具體可由IOg/ L-300g/L酵母膏、10g/L-300g/L蛋白腖和5g/L_40g/L硫酸銨組成；所述無機鹽中的各組分在所述發酵培養基中的濃度分別為=KH2PO4O. lg/L-10. Og/ L、MgSO4O. 0488g/L-4. 88g/L、MnSO4O. 089g/L_3. 56g/L、FeSO4O. 068g/L_2. 714g/L、 CaCl2O. lg/L-4. 0g/L、CuSO4O. 0639g/L_2. 556g/L、ZnSO4O. 0561g/L_2. 244g/L ；所述發酵培養基的pH值為4· 0-6. 5。在上述方法中，所述液體發酵按照包括如下步驟的方法進行將所述釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)接種於種子培養基中，20_4(TC、100-200 轉/分鐘振蕩培養18-40小時，獲得種子液；再將所述種子液按照(1-30) 100的體積比接種於所述發酵培養基中進行所述液體發酵。所述種子液中所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)的濃度為 106_108cfu/L。在上述方法中，所述種子培養基的溶劑為水，溶質為葡萄糖、酵母粉、蛋白腖和 MnSO4，在所述種子培養基中各溶質的濃度分別為葡萄糖10g/L-40g/L、酵母粉5. Og/ L-40g/L、蛋白腖 5. 0g/L-40g/L、MnSO4O. 089g/L_3. 56g/L。由上述方法製備得到的酵母培養物屬於本發明保護的範圍。本發明所提供的所述酵母培養物可用於製備動物飼料添加劑。所述動物具體可為反芻動物。所述動物飼料添加劑具體可為改善反芻動物瘤胃發酵的製劑。所述改善反芻動物瘤胃發酵體現為增加所述反芻動物瘤胃液中氨態氮的含量，和 /或增加所述反芻動物瘤胃液中揮發性脂肪酸濃度。所述揮發性脂肪酸具體可為乙酸、丙酸和丁酸。使用本發明所提供的發酵工藝得到的酵母培養物對反芻動物瘤胃液、乳酸利用菌和纖維素分解菌分別進行體外培養，可使反芻動物瘤胃液中氨態氮濃度和揮發性脂肪酸含量分別提高38. 3-65. 58%和29. 8-39. 4 %，可使乳酸利用菌反芻獸月形單胞菌和埃氏巨型球菌的生物量分別提高2. 6-3. 5倍和2. 4-3. 8倍，可使纖維素利用菌產琥珀酸擬桿菌、 牛黃瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的生物量分別提高75. 6 % -80. 9%,69. 89% -82. 75 %和 64. 78% -76. 76%。本發明對提高反芻動物生產力水平、優化飼料的營養價值具有重要意義。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例所用的培養基、菌株的詳細信息如下⑶C培養基青島海博生物技術有限公司。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) :CGMCC 編號為 2. 1882。產玻拍酸擬桿菌(Fibrobactersuccinogenes subsp. succinogenes (Hungate)) ATCC 編號為 19169。牛黃瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens Sijpesteijn) :ATCC 編號為 19208。白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus Hungate) :ATCC 編號為 27210。反會獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant) ATCC 編號為 12561。埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii (Gutierrez et al. ) Rogosa) :ATCC編號為 17752。實施例I、酵母培養物及其製備方法與應用一、酵母培養物的製備I、培養基的配製液體種子培養基稱取IOg葡萄糖、5g酵母粉、5g蛋白腖和O. Ig MnSO4 ·Η20，用IL 蒸餾水加熱溶解後，121°C、0. IMpa高溫滅菌15min，備用。液體發酵培養基稱取IOg葡萄糖，IOg鹿糖，IOg糖蜜，IOg蛋白腖，IOg酵母膏， 5g 硫酸銨，O. Ig KH2PO4,0. Ig MgSO4 · 7H20，0. Ig MnSO4 · H2O, O. Ig CaCl2,0. IgCuSO4 · 5Η20, O. Ig ZnSO4 · 7Η20 和 O. Ig FeSO4 · 4Η20，蒸餾水溶解後，用 O. lmol/L HCl 溶液調節 pH 值至
4.O,定容至1L, 121°C、0. IMpa高溫滅菌15min,備用。2、種子液的獲得將凍幹保藏的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae CGMCC No. 2. 1882)活化三代後接入上述液體種子培養基中，200C、100轉/分鐘振搖培養18h，獲得種子液，經檢測，該種子液經15倍稀釋後的0D_值為O. 491，釀酒酵母的活細胞數為I. I X 109cfu/L。3、發酵液的獲得將步驟2獲得的種子液按I : 100的體積比接種於液體發酵培養基中，20°C、100 轉/分鐘條件下發酵培養IOh後轉入20°C恆溫箱中靜置培養10h，獲得發酵液。4、酵母培養物的獲得將步驟3獲得的發酵液於4000轉/分鐘條件下離心5min除去菌體，將獲得的上清液用細菌過濾器(0. 22 μ m)過濾，經平板檢驗無菌長出，得到的無細胞濾液即為無菌酵母培養物。 二、利用酵母培養物對瘤胃液的體外批次培養反芻動物瘤胃液中氨態氮濃度是反映其瘤胃代謝和微生態環境狀況的重要指標之一，利用這一指標對反芻動物進行氮的營養檢測是現代動物營養學中採用的重要手段之一。瘤胃揮發性脂肪酸是指碳水化合物在瘤胃微生物的作用下最後分解為短鏈脂肪酸 (VFA)包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、2-甲基丁酸、戍酸、異戍酸等，其中，乙酸、丙酸、 丁酸佔90%以上，其他佔不到10%，因此，平時揮發性脂肪酸是指乙酸、丙酸、丁酸。本實驗中所檢測的揮發性脂肪酸即為乙酸、丙酸和丁酸。反芻動物60%的消化能是由VFA提供的， 因此，VFA是反芻動物重要的能量來源。本實驗利用步驟一得到的酵母培養物對瘤胃液進行體外批次培養的培養液進行氨態氮濃度和揮發性脂肪酸測定。I、瘤胃液的體外批次培養從相同且正常條件下飼養的年齡相同、平均體重550kg左右、泌乳期相同的奶牛 (平均泌乳期64d)中隨機取4頭安裝有永久性三位點瘻管的健康荷斯坦奶牛，晨飼(8:00) 前Ih時，用硬質PVC管分別從每頭奶牛瘤胃上下左右不同位點採集瘤胃液，分別裝入提前預熱已達39 °C並通有CO2的保溫瓶中，裝滿後立即蓋嚴瓶口，迅速返回試驗室。將上述每頭奶牛的瘤胃液分2組每組設3個重複，各組的培養方法如下處理組用四層紗布過濾瘤胃液(期間溫度保持在39土TC，且儘量少與空氣接觸)，持續通入約5min CO2氣體後，迅速分裝至如上已提前預熱並通有CO2的保溫瓶中，每保溫瓶中瘤胃液為20ml，再加入40ml緩衝液、O. 5ml步驟一得到的酵母培養物、O. 15g精料 (型號B211，長春博瑞飼料有限公司)和O. 15g羊草後於39°C條件下培養24小時得到培養液。對照組用四層紗布過濾瘤胃液(期間溫度保持在39土TC，且儘量少與空氣接觸)，持續通入約5min CO2氣體後，迅速分裝至如上已提前預熱並通有CO2的保溫瓶中，每保溫瓶中瘤胃液為20ml，再加入40ml緩衝液、O. 15g精料(型號B211，長春博瑞飼料有限公司)和O. 15g羊草後於39°C條件下培養24小時得到培養液。上述緩衝液的配製方法如下於培養前Ih準確量取988ml A液，IOml B液，2ml C液，充分混合，通CO2至無色後將其分裝於培養瓶內(每個培養瓶加40ml)，持續通入IOmin CO2，蓋上裝有塑料三通的橡皮塞，置於恆溫水浴中預熱至39°C待用。上述A液、B液和C液的配製方法如下A 液稱取 382. 5mg k2HP04，292mg KH2PO4, 480mg (NH4) 2S04, 200mg NaCl, IOOmgMgSO4 · 7H20和4000mg Na2CO3，用蒸餾水溶解後定容至1000ml。在使用前一天配製待用。B 液稱取 50mg EDTA, 200mg FeSO4 · 7H20, 200mg MnCl2 · 4H20, IOmg ZnSO4 · 7H20, 30mg H3BO3, 20mg CoCl2 · 6H20, Img CuCl2 · 2H20，2mg NiCl2 · 6H20 和 3mg NaMoO4，用蒸餾水溶解後定容至1000ml，持續通入18小時CO2後，蓋嚴瓶口，置於4°C冰箱備用。C液稱取25g Na2S · 9H20置於IOOml容量瓶中加80ml蒸餾水溶解後定容至 100ml，持續通入20min CO2後，蓋好瓶口，置於4°C冰箱備用。2、氨態氮濃度的測定採用亞硝基鐵氰化鈉比色法測定，步驟如下I)氨氮標準系列溶液的配製①準確稱量O. 382g氯化銨，用O. 2mol/L鹽酸溶液溶解並定容到100ml，作為保存液，於4°C冰箱保存。②取步驟①的保存液10ml，用蒸餾水稀釋定容至100ml，作為工作液，其含氮量為 10mg/100ml。
③一次量取步驟②的工作液0、l、2、4、6ml分別置於5個編號的50ml容量瓶內，接著分別加入蒸餾水10、9、8、6、4ml，再用O. 2mol/L鹽酸溶液定容，得到每IOOml溶液中含氮量分別為0,0. 2,0. 4,0. 8、I. 2mg的標準系列溶液。2)準確量取上述氨氮標準系列各溶液0.4ml於IOml試管中，再依次加入2ml A液和2ml B液，搖勻後靜置lOmin，用TU-1901紫外可見分光光度計比色，波長700nm，用不含氮的標準溶液作空白對照。記錄各系列標準溶液的消光值。3)用消光值作自變量，溶液含氮量作從變量導出回歸方程回歸方程為y = O. 9062-0. 0084，R2 為 O. 9998。4)樣品處理取步驟I得到的培養液IOml在3500-4000轉/分鐘下，離心lOmin， 量取2ml上清液(若氨氮含量較高，可取Iml上清液再加Iml蒸餾水)，置於15ml試管內， 再加入8ml O. 2mol/L鹽酸至IOml搖勻(稀釋倍數為5或10)。比色操作同步驟2)。把各樣品測得的消光值代入步驟3)的回歸方程中，算得的結果乘以樣品的稀釋倍數就是原樣中氨態氮的濃度。將組內的各樣品取平均值，結果如表I所示。3、揮發性脂肪酸(VFA)的測定I)標準液的配製VFA標準溶液(混標)用移液槍取344 μ L乙酸，373 μ L丙酸和184 μ L正丁酸， 置於IOOmL容量瓶中，用超純水定容，即60mmol/L(3. 60g/L)乙酸，50mmol/L(3. 72g/L)丙酸和20mmOl/L(1.76g/L)正丁酸混合標準溶液。乙酸(色譜純，P = I. 049，廣州自力色譜公司)，丙酸(色譜純，P = 0.993，廣州自力色譜公司)，正丁酸(色譜純，P = 0.959，同上)，偏磷酸(分析純)，實驗用水全部為超純水(18. 2M Ω · cm)。2)樣品的預處理取步驟I得到的培養液I. 5ml於10000轉/分鐘，IOmin離心後，取Iml上清液，加 25%偏磷酸溶液O. 2ml，用渦漩振蕩器混合均勻，以10000轉/分鐘離心10_15min，得到上清液，用於檢測。3)氣相色譜條件採用Agilent Technologies 7890A氣相色譜儀進行測定；色譜柱Nukol毛細管柱(30mXO. 32mmXO. 25 μ m);進樣口 220°C ;檢測器250°C ;柱溫升溫程序初始溫度 60°C，然後以20°C /min升溫速率升至190°C，保持3min，進樣口壓力IOOkPa ;SPL分流比 20 I ;氣體流速載氣氮氣N275ml/min ;氫氣H270ml/min ;空氣50ml/min ;進樣量=IuL04)上樣檢測及定量分析色譜柱的選擇實驗比較了非極性色譜柱DB-I柱和極性色譜柱Nukol柱對揮發性脂肪酸分離效果的影響。結果表明，用非極性柱DB-I柱對標準溶液中的乙酸、丙酸、丁酸進行分析，各組分不易分開，峰重疊現象嚴重，分離效果不理想。而用Nukol極性柱進行分析， 各組分實現完全分離，且峰形良好。這可能是由於乙酸、丙酸、丁酸本身為強極性物質，符合相似相溶原理，因此實驗選強極性的Nukol柱用於實際樣品分析。柱溫的選擇柱溫通常有兩種方式，一種為恆溫分析，另一種為程序升溫。本實驗採用Nukol毛細柱，分別比較了恆溫分析和多種程序升溫條件對分離效果的影響。結果表明程序升溫分析在分離效果和靈敏度兩方面都明顯優於恆溫分析；採用柱溫升溫程序: 初始溫度60°C，然後以20°C /min速率升溫至190°C，保持3min，可實現對VFA的良好分離。
標準曲線將混合標準溶液稀釋製備一系列不同濃度的標準溶液，分別取ImL混合標準溶液置於1.5mL離心管中，加入0.200mL 25 %偏磷酸溶液，用渦漩振蕩器混合均勻，以10000轉/分鐘離心15min，用微量注射器取上清液I μ L，注入氣相色譜儀中，進行分析，記錄峰面積，以峰面積y對濃度X作標準曲線。結果表明，乙酸、丙酸、丁酸峰面積與其濃度呈良好線性關係，回歸方程分別為y = 338. 96x+84. 185，y = 832. 3x+464. 32，y = 1556. 6x+645. 94，線性相關係數R2分別為O. 9998,0. 9993,0. 9968。按照相同的方法檢測步驟2)經過預處理的樣品，將得到的乙酸、丙酸和丁酸峰面積數值分別代入上述三個回歸方程，得出各樣品中乙酸、丙酸和丁酸的濃度，計算總濃度，組內樣品取平均值，結果如表I所
/Jn ο4、表I結果表明與對照組相比，處理組培養液的氨態氮濃度提高45. 1%，揮發性脂肪酸含量提聞31. 6%。表I.氨態氮和揮發性脂肪酸含量測定結果
權利要求
1.一種酵母培養物的製備方法，包括如下步驟將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)進行液體發酵後，收集發酵液，除去所述發酵液中的所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)細胞得到的無菌液體即為所述酵母培養物。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述液體發酵在如下條件下進行 20-400C >100-200轉/分鐘振蕩培養10-30小時後再靜置培養10-60小時。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於所述液體發酵所使用的發酵培養基的溶劑為水，溶質由如下I)-3)的物質組成1)碳源，所述碳源為如下A)-C)中的任一種A)葡萄糖、蔗糖和糖蜜；B)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任兩種；C)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任一種；2)氮源，所述氮源為如下D)-F)中的任一種D)酵母膏、蛋白腖和硫酸銨；E)酵母膏、蛋白腖和硫酸銨中的任兩種；F)酵母膏、蛋白腖和硫酸銨中的任一種；3)無機鹽，所述無機鹽為KH2P04、MgSO4, MnSO4, CaCl2, CuSO4, ZnSO4 和 FeSO4 ；所述碳源在所述發酵培養基中的總濃度為30-300g/L;所述碳源具體可由IOg/L-100g/L 葡萄糖、10g/L-100g/L 鹿糖和 10g/L-100g/L 糖蜜組成；所述氮源在所述發酵培養基中的總濃度為25-640g/L;所述氮源具體可由IOg/ L-300g/L酵母膏、10g/L-300g/L蛋白腖和5g/L_40g/L硫酸銨組成；所述無機鹽中的各組分在所述發酵培養基中的濃度分別為=KH2PO4O. lg/L-10. 0g/L、 MgSO4O. 0488g/L-4. 88g/L、MnSO4O. 089g/L_3. 56g/L、FeSO4O. 068g/L_2. 714g/L、CaCl2O. lg/ L-4. 0g/L、CuSO4O. 0639g/L-2. 556g/L、ZnSO4O. 0561g/L_2. 244g/L ；所述發酵培養基的pH值為4. 0-6. 5。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特徵在於所述液體發酵按照包括如下步驟的方法進行將所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)接種於種子培養基中，20-40°C、100-200轉/分鐘振蕩培養18-40小時，獲得種子液；再將所述種子液按照(1-30) 100的體積比接種於所述發酵培養基中進行所述液體發酵。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述種子培養基的溶劑為水，溶質為葡萄糖、酵母粉、蛋白腖和MnSO4，在所述種子培養基中各溶質的濃度分別為葡萄糖10g/L-40g/ L、酵母粉 5. 0g/L-40g/L、蛋白腖 5. 0g/L_40g/L、MnSO4O. 089g/L_3. 56g/L。
6.由權利要求1-5中任一所述方法製備得到的酵母培養物。
7.權利要求6所述酵母培養物在製備動物飼料添加劑中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於所述動物飼料添加劑為改善反芻動物瘤胃發酵的製劑。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於所述改善反芻動物瘤胃發酵體現為增加所述反芻動物瘤胃液中氨態氮的含量，和/或增加所述反芻動物瘤胃液中揮發性脂肪酸濃度。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵在於所述揮發性脂肪酸為乙酸、丙酸和丁酸。
全文摘要
本發明公開了一種酵母培養物及其製備方法與改善瘤胃發酵中的應用。該酵母培養物按照包括如下步驟的方法製備將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeCGMCC No.2.1882)進行液體發酵後，收集發酵液，除去所述發酵液中的所述釀酒酵母細胞得到的無菌液體即為所述酵母培養物。使用本發明所提供的酵母培養物對反芻動物瘤胃液、乳酸利用菌和纖維素分解菌分別進行體外培養，可使反芻動物瘤胃液中氨態氮濃度和揮發性脂肪酸含量分別提高38.3-65.58％和29.8-39.4％，並顯著促進乳酸利用菌和纖維素利用菌的增殖。本發明對提高反芻動物生產力水平、優化飼料的營養價值具有重要意義。
文檔編號A23K1/16GK102586329SQ20121005217
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者劉萍, 徐樂, 解洛香 申請人:中國農業大學