具有改善的凝乳性質的凝乳酶變體的製作方法

2023-05-22 07:33:11 2

具有改善的凝乳性質的凝乳酶變體的製作方法
【專利摘要】具有改善的凝乳性質的凝乳酶變體。
【專利說明】具有改善的凝乳性質的凝乳酶變體 發明領域
[0001] 本發明涉及具有改善的凝乳性質的凝乳酶變體。
[0002] 發明背景
[0003] 利用凝乳酶類（例如凝乳酶及胃蛋白酶）對乳的酶法凝固是奶酪生產中最重要工 藝中的一個。酶法乳凝固是一個兩階段工藝：第一階段，其中蛋白水解酶、凝乳酶或胃蛋白 酶攻擊K-酪蛋白，導致酪蛋白膠束結構的亞穩態以及第二階段，其中乳隨後凝固並形成 凝固物。
[0004] 凝乳酶（EC 3. 4. 23. 4)及胃蛋白酶（EC 3. 4. 23. 1)(哺乳動物胃中的凝乳酶類） 是屬於肽酶中一大類的天冬氨酸蛋白酶。
[0005] 當在胃黏膜細胞中產生時，凝乳酶以及胃蛋白酶分別是以無酶學活性的凝乳酶原 前體以及胃蛋白酶原前體存在。當分泌凝乳酶時，N-端肽片段，即片段前體（信號肽）被 切除以產生包含片段原（pro-fragment)的凝乳酶原。凝乳酶原是一種基本上無活性形式 的酶，但是，其在酸性條件下會因片段原的自催化移除而被激活成為活性凝乳酶。此激活在 適宜的pH條件下在胃腔中體內發生或在酸性條件下體外發生。
[0006] 已對牛（即Bos Taurus)的結構以及功能特徵、凝乳酶原前體、凝乳酶原以及凝乳 酶進行了深入地研宄。牛凝乳酶原前體分子的前體部分（pre-part)包含16aa殘基，對應 的凝乳酶原的原體部分（pro-part)具有42aa殘基的長度。活性牛凝乳酶包含323aa，是兩 種皆具有活性的形式A及B的混合物。
[0007] 凝乳酶是在哺乳動物種中自然地產生的，所述種例如牛、駱駝、山羊、水牛、綿羊、 豬、人、猴以及大鼠。
[0008] 多年來，牛凝乳酶可商用於乳品工業。
[0009] W002/36752A2(Chr. Hansen)描述了駱駝凝乳酶之重組製造。
[0010] 以下隨即列出的參考文獻可在本發明的上下文中視為描述凝乳酶的突變體的參 考文獻：
[0011] -Suzuki 等：Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218，Lys220and Asp304in chymosin(定點誘變揭露凝乳酶中 Thr218、Lys220 以及 Asp304 的功能性分布），Protein Engineering,第 4 卷，1990 年 1 月，69-71 頁；
[0012] -Suzuki 等:Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis (通過定點誘變改變凝乳酶的催化性質），Protein Engineering,第 2 卷，1989 年 5 月，563-569 頁；
[0013] -van den Brink等：Increased production of chymosin by glycosylation (通 過糖基化增產凝乳酶），Journal of biotechnology,第 125 卷，2006 年 9 月，304-310 頁；
[0014] -Pitts 等：Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei (瑞氏木黴中產生的凝乳酶pH最適宜突變體的表達以及 表徵），Journal of biotechnology,第 28 卷，1993 年 3 月，69-83 頁；
[0015] -M. G. Williams 等:Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin(牛凝乳酶的點突變體的 誘變、生化表徵以及X-射線結構分析），Protein engineering design and selection,第 10 卷，1997 年 9 月，991-997 頁；
[0016] -Strop 等!Engineering enzyme subsite specificity!preparation, kinetic characterization, and χ-ray analysis at 2. OANG resolution of Vallllphe site mutated calf chymosin(工程酶亞位點特異性：在Vallllphe位點突變的小牛凝乳酶的 2. OANG解析度下的製備、動力學表徵、以及X-射線分析），Biochemistry,第29卷，1990年 10 月，9863-9871 頁；
[0017] -Supannee 等：Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity (影響凝乳活性的小牛凝乳酶B的位點特異性突變），Food Chemistry,第 62 卷，1998 年 6 月，133-139 頁；
[0018] -Zhang 等!Functional implications of disulfide bond,Cys45-Cys50,in recombinant prochymosin (重組凝乳酶原中二硫鍵（Cys45_Cys50)的功能性含 義），Biochimica et biophysica acta,第 1343 卷，1997 年 12 月，278-286 頁。
[0019] h沭現有摶術的參考f獻沒有一篇言接並明確地描沭了下f中所描沭/要求保 護的仵一凝乳酶突奪體/奪體。


【發明內容】

[0020] 本發明要解決的問題是提供具有改善的凝乳性質的凝乳酶變體。
[0021] 如文中工作實施例中所討論--本
【發明者】已鑑定出多種改善的駱駝（參見文中實 施例6)以及牛（參見文中實施例7)凝乳酶變體。
[0022] 基於駱駝以及牛變體的對比性分析-本
【發明者】鑑定出了多個其它胺基酸位置，從 通過製備這些位置中一個或多個的變體可得到改善的凝乳酶變體（參見文中實施例8)的 意義上講，這在文中是重要的。
[0023] 如本領域中所知--獲自不同的哺乳動物種（例如，比如，牛、駱駝、綿羊、豬、或大 鼠）的不同天然野生型凝乳酶多肽序列具有相對高的序列類似性/同一性。
[0024] 在文中圖1中，這是通過文中相關的不同凝乳酶序列的比對例示的。
[0025] 就此相對密切的序列關係而言一一認為不同的天然野生型凝乳酶的3D結構也相 對類似。
[0026] 在本發明上下文中一一天然獲得的野生型凝乳酶（例如牛凝乳酶或駱駝凝乳酶） 在文中可為親本多肽的實例一一即發生改變以得到本發明的變體凝乳酶多肽的親本多肽。
[0027] 不受理論限制一一認為文中所述的凝乳酶相關的胺基酸位置在文中任意的所關 注的相關凝乳酶（例如，例如牛、駱駝、綿羊、豬、大鼠等的凝乳酶）中具有普遍重要性一一 從通過製備這些位置中一個或多個的變體通常可得到改善的凝乳酶變體的意義上講（例 如，改善的牛、駱駝、綿羊、豬或大鼠凝乳酶變體）。
[0028] 如文中所述--在文中將公眾已知的牛凝乳酶B凝乳酶原前體序列（Genbank登 錄號P00794--在文中以SEQ ID NO: 1公開）用作參照序列以確定所關注（例如，駱駝、綿 羊、牛等）的親本凝乳酶多肽的胺基酸位置。
[0029] SEQ ID NO: 1的牛凝乳酶B凝乳酶原前體在文中可另稱為牛（Bos bovis)凝乳酶 B或僅稱為牛凝乳酶。序列也在文中圖1中所示。
[0030] 文中另一個相關的凝乳酶序列是公眾已知的文中SEQ ID NO:2的單峰駝 (Camelius dromedarius)凝乳酶序列。在文中可另稱為駱蛇凝乳酶。序列也在文中圖1中 所示。
[0031] 在本發明上下文中，認為具有與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽至少65%序 列同一性的親本凝乳酶多肽（例如，來自綿羊或大鼠的親本凝乳酶多肽）在文中可視為與 例如牛或駱駝凝乳酶有充分的結構相關性，從而可通過製備如文中所述的任一胺基酸位置 的變體而加以改善。
[0032] 因此，本發明的第一方面涉及一種製備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其包括以 下步驟：
[0033] (a):在具有凝乳酶活性的親本多肽中的一個或多個位置製造改變，其中所述改 變包含對應於位置 117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、 350、352及353中任一個位置的至少一個胺基酸位置的置換、缺失或插入；以及
[0034] (b):製備並分離步驟（a)中改變的多肽，從而得到分離的凝乳酶多肽變體，其中 所述變體具有凝乳酶活性；
[0035] 以及其中：
[0036] ⑴：親本多肽的胺基酸位置是通過使該親本多肽與SEQ ID NO: 1 (牛凝乳酶）的 多肽比對確定的一一即，將SEQ ID NO: 1的多肽用於確定親本多肽中對應的胺基酸序列；以 及
[0037] (ii)親本多肽具有與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽至少65%序列同一性， 所述成熟多肽是從SEQ ID NO: 1的胺基酸位置59到胺基酸位置381。
[0038] 如本領域中已知一一技術人員可根據他的一般公知常識常規地製備並純化凝乳 酶以及凝乳酶變體。
[0039] 換句話說，一旦技術人員擁有本文中所關注（例如，來自牛、駱駝、綿羊、豬、或大 鼠）的具有凝乳酶活性的相關的親本多肽，則對於技術人員來說製備該所關注的親本凝乳 酶的變體是常規工作。
[0040] 本發明的第二方面涉及利用第一方面的方法或其任何的文中相關的實施方案獲 得的分離的凝乳酶多肽變體。
[0041] 關於以上第二方面的術語"獲得的"應被理解成分離的凝乳酶多肽變體已利用第 一方面的方法或其任何的文中相關的實施方案獲得。
[0042] 因此，關於第二方面的術語"獲得的"不應被理解成可獲得的。
[0043] 如文中所述--在文中工作實施例中，利用SEQ ID NO: 1(牛）的多肽作為親本多 肽來製備變體--所述變體在文中可稱為牛凝乳酶變體。
[0044] 因此，本發明的第三方面涉及分離的凝乳酶多肽變體，其包含：
[0045] (a):具有凝乳酶活性的親本多肽中一個或多個位置處的改變，其中所述改變包含 對應於位置 117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352 以及353中任一個位置的至少一個胺基酸位置的置換、缺失或插入；以及
[0046] (b):其中所述變體具有凝乳酶活性；
[0047] 以及其中：
[0048] (i):親本多肽的胺基酸位置是通過使該親本多肽與SEQ ID NO: I (牛凝乳酶）的 多肽比對來確定的一一即，SEQ ID NO: 1的多肽用於確定親本多肽中對應的胺基酸序列；以 及
[0049] (ii):親本多肽具有與SEQ ID NO: 1 (牛凝乳酶）的成熟多肽至少90%序列同一 性，所述成熟多肽是從SEQ ID NO: 1的胺基酸位置59到胺基酸位置381 ;以及
[0050] (iii)分離的變體多肽具有與SEQ ID NO: 1 (牛凝乳酶）的成熟多肽少於100%序 列同一性。
[0051] 如文中所述--在文中工作實施例中，利用SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的多肽作 為親本多肽來製備變體--該變體在文中可稱為駱駝凝乳酶變體。
[0052] 因此，本發明的第四方面涉及一種分離的凝乳酶多肽變體，其包含：
[0053] (a):具有凝乳酶活性的親本多肽中一個或多個位置處的改變，其中所述改變包含 對應於位置 117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352 以及353中任一個位置的至少一個胺基酸位置的置換、缺失或插入；以及
[0054] (b):其中所述變體具有凝乳酶活性；
[0055] 以及其中：
[0056] ⑴：親本多肽的胺基酸位置是通過使該親本多肽與SEQ ID NO: 1 (牛凝乳酶）的 多肽比對來確定的一一即，SEQ ID NO: 1的多肽用於確定親本多肽中對應的胺基酸序列；以 及
[0057] (ii):親本多肽具有與SEQ ID NO: 2 (駱駝凝乳酶）的成熟多肽至少90%序列同 一性，所述成熟多肽是從SEQ ID NO: 2的胺基酸位置59到胺基酸位置381 ;以及
[0058] (iii)分離的變體多肽具有與SEQ ID NO: 2 (駱駝凝乳酶）的成熟多肽少於100% 的序列同一"性。
[0059] 可根據本領域使用如文中所述的分離的凝乳酶多肽變體一一例如，用於生產所關 注的食品或飼料產品（例如，比如，所關注的基於乳的產品，其可例如為奶酪產品）。
[0060] 因此，本發明的第五方面涉及一種生產食品或飼料產品的方法，其包括將有效量 的如文中所述的分離的凝乳酶多肽變體加入食品或飼料成分中並進行進一步製作步驟以 得到所述食品或飼料產品。
[0061] 以下僅通過實施例來描述本發明的實施方案。
[0062]定義：
[0063] 文中相關術語的所有定義是根據技術人員參照文中相關的技術上下文所理解的 內容。
[0064] 術語"凝乳酶"涉及EC 3. 4. 23. 4類的酶。凝乳酶具有高特異性並且其是通過裂 解酪蛋白的K-鏈中單個105-Ser-Phe-|-Met-Ala_108鍵來使乳凝固。本領域技術中所用 的另一個名稱是凝乳素（rennin)。
[0065] 術語"凝乳酶活性"涉及技術人員在本發明上下文中所理解的凝乳酶的凝乳酶活 性。
[0066] 技術人員知道如何確定文中相關的凝乳酶活性。
[0067] 在文中工作實施例4中，提供了一個確定凝乳酶比活一一另稱為凝固活性或凝乳 活性的標準方法的實例。
[0068] 在文中工作實施例5中，提供了一個確定蛋白水解活性的標準方法的實例。
[0069] 如本領域中已知一一文中相關的所謂C/P比是通過凝固比活（C)除以蛋白水解活 性（P)來確定的。
[0070] 如本領域中已知一一更高的C/P比通常意味著在（例如）奶酪生產期間因非特異 性蛋白降解而導致的蛋白損失減少，也就是，奶酪產量得以提高，並且在熟化期間奶酪中的 苦味的生成降低。
[0071] 術語"分離的變體"意指通過人工修飾的變體。在一個方面中，利用SDS PAGE確 定，變體具有至少1 %純度，例如，至少5%純度，至少10%純度，至少20%純度，至少40%純 度，至少60%純度，至少80%純度，以及至少90%純度。
[0072] 術語"成熟的多肽"意指在翻譯以及任何翻譯後修飾（例如，N端加工、C端截斷、 糖基化、磷酸化等）後的最終形式的肽。在本發明上下文中，文中相關的成熟凝乳酶多肽可 被視為活性凝乳酶多肽序列一一也就是，沒有前體部分的序列和/或原體部分的序列。成 熟多肽的文中相關實例是例如SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽，其是從SEQ ID NO: 1 的胺基酸位置59到胺基酸位置381;或者是SEQ ID NO: 2 (駱駝凝乳酶）的成熟多肽，其是 從SEQ ID NO:2的胺基酸位置59到胺基酸位置381。
[0073] 術語"親本"或"具有凝乳酶活性的親本多肽"意指對其進行改變以製得本發明的 酶變體的多肽。親本可為天然產生（野生型）的多肽或其變體。
[0074] 術語"序列同一性"涉及兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的關係。
[0075] 就本發明而言，兩個胺基酸序列之間的序列同一性程度是利用如在優選3. 0.0 版本或更新版本的 EMBOSS 軟體包（EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000, Trends Genet. 16:276-277)的 Needle 程序中執行的 Needleman-Wunsch 算法（Needleman 及 Wunsch, 1970,J. Mol. Biol. 48:443-453)確定 的。所用的可選參數是開放空位罰分（gap open penalty) 10,空位延伸罰分0.5,以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）置換矩陣。將Needle標記的"最長同一性"的輸出 結果（利用-nobrief選項獲得）用作百分比同一性並按如下計算：
[0076] (相同殘基X 100V(比對長度-比對中的空位總數）
[0077] 就本發明而言，兩個脫氧核苷酸序列之間的序列同一性程度是利用如在優選 3.0.0 版本或更新版本的 EMBOSS 軟體包（EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，如上所述）的 Needle 程序中執行的 Needleman-Wunsch 算 法（Needleman及Wunsch, 1970，如上所述）確定的。所用的可選參數是開放空位罰分10， 空位延伸罰分0. 5,以及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）置換矩陣。將Needle標 記的"最長同一性"的輸出結果（利用-nobrief選項獲得）用作百分比同一性並按如下計 算：
[0078] (相同的脫氧核苷酸X 100V(比對長度-比對中的空位總數）。
[0079] 術語"變體"意指一種具有凝乳酶活性的包含一個或更多個（若干個）位置處的 改變（也就是，置換、插入、和/或缺失）的肽。置換意指佔據一個位置的胺基酸被一個不 同的胺基酸替換；缺失意指佔據一個位置的胺基酸的移除；而插入意指鄰近佔據一個位置 的胺基酸加入1-3個胺基酸。
[0080] 胺基酸可為天然或非天然胺基酸--例如，被例如D-丙氨酸的例如特定的D-異 構體（或D-形式）置換在理論上是可行的。
[0081] 術語"野生型"凝乳酶肽意指由天然產生的生物體（例如，自然界中可見的哺乳動 物（例如，駱駝或牛））表達的凝乳酶。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0082] m:文中相關的不同凝乳酶序列的比對。所示的"牛凝乳酶B"是文中SEQ ID NO: 1的牛凝乳酶並且所示的"單峰駝"是文中SEQ ID NO: 2的駱駝凝乳酶。將如文中所述 的SEQ ID NO: 1的牛凝乳酶用作參照序列，可例如看出牛凝乳酶在位置10中具有"V"而駱 駝凝乳酶在同樣的位置10中具有"A"。也（例如）可看出牛/大鼠在位置352中具有"Q" 並且駱駝/雙峰駝在相同的位置352中具有"E"。
[0083] 根據圖1中所示的凝乳酶序列--綿羊具有與牛SEQ ID NO: 1的94. 5%序列同一 性；雙峰駝（C. bacttrianus)具有與牛SEQ ID NO: 1的83. 2%序列同一性；單峰駝（SEQ ID N0:2的駱駝凝乳酶）具有與牛SEQ ID NO: 1的84%序列同一性；豬具有與牛SEQ ID NO: 1 的80. 3%序列同一性，大鼠具有與牛SEQ ID NO: 1的71. 9%序列同一性。
[0084] 如技術人員在本發明上下文中所理解--（例如）綿羊、雙峰駝、駱駝、豬或大鼠 凝乳酶的成熟多肽序列與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶--也就是，SEQ ID NO: 1的胺基酸位置 59至381)的成熟多肽的文中相關的序列同一性百分比在相當程度上類似於上述序列同一 性百分比。
[0085] 胤1牛凝乳酶的3D結構一一3D結構是公眾可獲得的。顯示了其中胺基酸位置 296及294存在於牛凝乳酶中的一個實例。

【具體實施方式】
[0086] 確宙所關注的凝乳酶的胺基酸位詈
[0087] 如上所討論--在文中將文中以SEQ ID NO: 1公開的公眾已知的牛凝乳酶序列用 作參考序列來確定所關注（例如，駱駝、綿羊、牛等）的文中相關的凝乳酶多肽的胺基酸位 置。
[0088] 就本發明而言，將以SEQ ID N0:1(牛凝乳酶）公開的多肽用於確定另一種凝乳酶 多肽中對應的胺基酸殘基。使另一種凝乳酶多肽的胺基酸序列與以SEQ ID NO: 1公開的多 肽比對，並根據比對，利用文中工作實施例1中所描述的ClustalW算法，確定對應於以SEQ ID NO: 1公開的多肽中任意胺基酸殘基的胺基酸位置編號。
[0089] 另一種凝乳酶多肽中對應的胺基酸殘基的鑑定可通過利用如在優選3. 0.0 版本或更新版本的 EMBOSS 軟體包（EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000, Trends Genet. 16:276-277)的 Needle 程序中執行的 Needleman-Wunsch 算法（Needleman 及 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)證實。
[0090] 基於以上熟知的電腦程式一一對於技術人員而言，確定所關注（例如，駱駝、綿 羊、牛等）的文中相關凝乳酶多肽的胺基酸位置是常規工作。
[0091] 在文中圖1中顯示了比對的一個實例。
[0092] 只作為一個實例--在圖1中，可（例如）看出，文中所用的牛參照SEQ ID NO: 1 在位置50中具有"G"，"單峰駝"（文中SEQ ID NO: 2)在這個位置50中具有"A"。
[0093] 奪體的命名
[0094] 在描述本發明變體中，為便於參考，採用以下所述的命名法。採用公認的IUPAC單 字母或三字母胺基酸縮寫。
[0095] 在以下這個"命名"部分中所述的特定變體可以不是本發明文中相關變體一一也 就是，此"命名"部分只用於描述如此般文中相關所用的命名。
[0096] 置&。對於胺基酸置換，使用以下命名：初始的胺基酸，位置，置換的胺基酸。因此， 位置226處蘇氨酸被丙氨酸在理論上的置換被表示為"Thr226Ala"或"T226A"。多個突變 是通過加號（" + "）分開，例如，"Gly205Arg+Ser411Phe"或"G205R+S411F"，分別表示位置 205及411處甘氨酸（G)被精氨酸（R)以及絲氨酸（S)被苯丙氨酸（F)的置換。例如稱為 "226A"的置換指位置226處的親本胺基酸（例如，T、Q、S或另一種親本胺基酸）被丙氨酸 的置換。
[0097] 缺失:對於胺基酸缺失，使用以下侖名：初始胺基酸,位置，*。因此，位置195處 甘氨酸的缺失被表示為"Glyl95*"或"G195*"。多個缺失是通過加號（" + "）分開，例如， "Glyl95*+Ser411*"或"G195*+S411*"。
[0098] 通人。對於胺基酸插入，使用以下命名：初始胺基酸，位置，初始胺基酸，插入 的胺基酸。因此，在位置195處的甘氨酸後插入賴氨酸被表示為"Glyl95GlyLys"或 "G195GK"。多個胺基酸的插入被表示為[初始胺基酸，位置，初始胺基酸，插入的胺基酸 #1，插入的胺基酸#2 ;等]。例如，在位置195處的甘氨酸後插入賴氨酸及丙氨酸被表示為 "Glyl95GlyLysAla" 或 "G195GKA"。
[0099] 在這些情況中，插入的胺基酸殘基是通過將小寫字母加到所插入的胺基酸殘基前 的胺基酸殘基的位置編號而編號的。在以上實施例中，序列因此為：
[0100]

【權利要求】
1. 一種製備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其包括以下步驟： (a) :在具有凝乳酶活性的親本多肽中的一個或多個位置製造改變，其中所述改變包含 對應於位置 117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352 及353中任一個位置的至少一個胺基酸位置的置換、缺失或插入；以及 (b) :製備並分離步驟（a)中改變的多肽，從而得到分離的凝乳酶多肽變體，其中所述 變體具有凝乳酶活性； 以及其中： (i) :所述親本多肽的胺基酸位置是通過使該親本多肽與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的 多肽的比對確定的一一即，SEQ ID NO: 1的多肽用於確定所述親本多肽中對應的胺基酸序 列；以及 (ii) :所述親本多肽具有與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽至少65%序列同一 性，所述成熟多肽是從SEQ ID NO: 1的胺基酸位置59到胺基酸位置381。
2. 如權利要求1所述的製備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其中所述的分離的凝乳酶 多肽變體具有： -產生比包含SEQ ID NO: 1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶活 性；以及 -產生比包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的駱駝凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶 活性。
3. 如以上權利要求中任一項所述的製備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其中所述改變 包含至少一個胺基酸位置的置換以及其中所述置換為134Q、141E、143F、280I、281V、298E、 300R、307D、309D、309W、311I、352L、352Q、353L 或 353Q。
4. 如權利要求3所述的製備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其中所述置換為H134Q、 Q141E、I143F、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、Q352L、E352L、 E352Q、K353L 或 K353Q。
5. 如以上權利要求中任一項所述的製備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其中所述改變 包含至少一個胺基酸位置的置換以及所述置換為： F281V+V306I+I321L ； H134Q+I154L+D216S ； V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F ； D156V+G309D+M314L+V317I ； H134Q+L280I+G309W ； R119Q+D156V+V375L ； Y79S+R119S+H204R ； Y79S+H134Q+Y365F+V375L ； Y194I+R213Q+G309D ； Y79S+D117N+I321L ； Y185F+D325M+E352Q ； Y79S+L224V+L311I ； S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E ； F281V+G309W+S331Y+D337E ； D156V+G309D+M314L+V317I ； G128D+L188I+Y326F ； R119S+V241I+L280I+L311I+D325M ； R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W K279V+V281F ； Q298E+Q300R ； H350N+Q352E+K353L ； D307N+D309G ;或 Q141E+I143F。
6. 如以上權利要求中任一項所述的製備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其中所述的親 本多肽具有與SEQ ID NO: 1 (牛凝乳酶）的成熟多肽至少95%序列同一性。
7. 如權利要求1至5中任一項所述的製備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其中所述的 親本多肽具有與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多肽至少95%序列同一性，所述成熟多 肽是從SEQ ID NO:2的胺基酸位置59到胺基酸位置381。
8. -種通過如權利要求1至7中任一項所述的方法得到的分離的凝乳酶多肽變體。
9. 一種分離的凝乳酶多肽變體，其包含： (a) :具有凝乳酶活性的親本多肽中一個或多個位置處的改變，其中所述改變包含對應 於位置 117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352 及 353中任一個位置的至少一個胺基酸位置的置換、缺失或插入；以及 (b) :其中所述變體具有凝乳酶活性； 以及其中： (i) :所述親本多肽的胺基酸位置是通過使該親本多肽與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的 多肽的比對確定的一一即，SEQ ID NO: 1的多肽用於確定所述親本多肽中對應的胺基酸序 列；以及 (ii) :所述親本多肽具有與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽至少90%序列同一 性，所述成熟多肽是從SEQ ID NO: 1的胺基酸位置59到胺基酸位置381 ;以及 (iii) :所述分離的變體多肽具有與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽少於100% 序列同一性，以及 其中所述分離的變體具有產生比包含SEQ ID NO: 1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比更 高的C/P比的凝乳酶活性。
10. 如權利要求9所述的分離的凝乳酶多肽變體，其中所述的親本多肽具有與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽至少97%序列同一性；以及 其中所述的分離的牛凝乳酶變體包含與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽相比少 於10個胺基酸改變（例如置換）。
11. 如權利要求9至10中任一項所述的分離的凝乳酶多肽變體，其中所述改變包含至 少一個胺基酸位置的置換以及其中所述置換為D117N、H134Q、Q141E、I143F、D156V、V241I、 V279M、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、D325M、H350N、Q352L、 E352L、E352Q、K353L 或 K353Q。
12. 如權利要求9至10中任一項所述的分離的凝乳酶多肽變體，其中所述改變包含至 少一個胺基酸位置的置換以及其中所述置換為： F281V+V306I+I321L ； H134Q+I154L+D216S ； V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F ； D156V+G309D+M314L+V317I ； H134Q+L280I+G309W ； R119Q+D156V+V375L ； Y79S+R119S+H204R ； Y79S+H134Q+Y365F+V375L ； Y194I+R213Q+G309D ； Y79S+D117N+I321L ； Y185F+D325M+E352Q ； Y79S+L224V+L311I ； S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E ； F281V+G309W+S331Y+D337E ； D156V+G309D+M314L+V317I ； G128D+L188I+Y326F ； R119S+V241I+L280I+L311I+D325M ； R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W K279V+V281F ； Q298E+Q300R ； H350N+Q352E+K353L ； D307N+D309G ;或 Q141E+I143F。
13. -種分離的凝乳酶多肽變體，其包含： (a) :具有凝乳酶活性的親本多肽中一個或多個位置處的改變，其中所述改變包含對應 於位置 117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352 及 353中任一個位置的至少一個胺基酸位置的置換、缺失或插入；以及 (b) :其中所述變體具有凝乳酶活性； 以及其中： (i) :所述親本多肽的胺基酸位置是通過使該親本多肽與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的 多肽比對確定的一一即，SEQ ID NO: 1的多肽用於確定所述親本多肽中對應的胺基酸序列； 以及 (ii) :所述親本多肽具有與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多肽至少90%序列同 一性，所述成熟多肽是從SEQ ID NO: 2的胺基酸位置59到胺基酸位置381 ;以及 (iii) :所述分離的變體多肽具有與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多肽少於100% 序列同一性；以及 其中所述分離的變體具有產生比包含SEQ ID NO: 2的成熟多肽的駱駝凝乳酶的C/P比 更高的C/P比的凝乳酶活性。
14. 如權利要求13中任一項所述的分離的凝乳酶多肽變體，其中所述改變包含至少一 個胺基酸位置的置換以及其中所述置換為： F281V+V306I+I321L ； H134Q+I154L+D216S ； V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F ； D156V+G309D+M314L+V317I ； H134Q+L280I+G309W ； R119Q+D156V+V375L ； Y79S+R119S+H204R ； Y79S+H134Q+Y365F+V375L ； Y194I+R213Q+G309D ； Y79S+D117N+I321L ； Y185F+D325M+E352Q ； Y79S+L224V+L311I ； S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E ； F281V+G309W+S331Y+D337E ； D156V+G309D+M314L+V317I ； G128D+L188I+Y326F ； R119S+V241I+L280I+L311I+D325M ； R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W K279V+V281F ； Q298E+Q300R ； H350N+Q352E+K353L ； D307N+D309G ;或 Q141E+I143F。
15. -種製造食品或飼料產品的方法，其包括將有效量的如權利要求8至14中任一項 所述的分離的凝乳酶多肽變體加入食品或飼料成分中並進行進一步製作步驟以得到所述 食品或飼料產品；以及 其中所述產品是基於乳的產品並且其中所述方法包括將有效量的如權利要求8至14 中任一項所述的分離的凝乳酶多肽變體加入乳中並進行進一步製作步驟以得到所述基於 乳的產品；以及 其中所述乳為豆乳、綿羊乳、山羊乳、水牛乳、犛牛乳、羊駝乳、駱駝乳或牛乳；以及 其中所述的基於乳的產品是發酵乳製品、夸克或奶酪。
【文檔編號】C12N9/64GK104487572SQ201380039107
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年5月22日 優先權日:2012年5月25日
【發明者】約翰尼斯·馬騰·范丹尼布林克, 馬丁·倫德, J·雅各布森, 薩裡·夏洛特·漢森, 伊本·傑普森 申請人:科.漢森有限公司