一種降血脂及調節腸道菌群的益生菌製劑的製備方法

2023-05-21 13:17:11 1

專利名稱：：一種降血脂及調節腸道菌群的益生菌製劑的製備方法一種降血脂及調節腸道菌群的益生菌製劑的製備方法發明領域本發明屬於生物
技術領域：
，涉及一種降血脂及調節腸道菌群的益生菌製劑的製備方法。
背景技術：
：心血管疾病是一類嚴重危害健康的疾病。近年來，隨著社會的進步和人民生活水平的日益提高以及工作節奏的不斷加快，心血管疾病已逐漸成為人類健康的頭號殺手。心血管疾病與血脂升高、缺少運動、壓力過大、家族心血管疾病史等相關，其中血脂升高，是造成膽固醇升高的主要因素之一。目前，對血脂高的控制主要是以含洛伐他汀類的藥物為主，該藥物具有嚴重的毒副作用，容易造成如肌痛、頭痛、轉氨酶升高、胃腸道不適、血脂紊亂、肝腎功能損害等。"益生菌"是機體補充攝入的具有活性的微生物，可有效改善腸道菌群的平衡，對宿主產生良好的健康效應，具有防止腹瀉、提高機體免疫力、降低血清膽固醇、血壓、抗癌等生理功能。Kefir粒作為重要的益生菌源，在歐州許多國家，早已被廣泛地應用來預防和治療腸易激綜合症、潰瘍性結腸炎、便秘等胃腸消化代謝、降血脂等生理疾病。
發明內容本發明的目的在於克服現有技術的不足之處，提供一種天然、安全，既能降血脂又可以調節腸道菌群的益生菌製劑的製備方法。本發明實現目的的技術方案是一種降血脂及調節腸道菌群的益生菌製劑的製備方法，製備方法的步驟如下(1)將Kefir源植物乳桿菌MA2進行高密度培養，得到發酵液，其菌體密度不小於108cfii/mL;(2)上述發酵液經離心收集獲得菌體，加入保護劑，凍幹成菌粉；(3)在凍幹的菌粉中加入低聚糖混合物，混合均勻即得益生菌製劑成品。而且，所述保護劑用量為菌體重量的3倍。而且，所述保護劑的構成及其質量百分比分別為10%的脫脂奶95%、海藻糖1.5%、甘油0.5%、山梨醇2%、麥芽糊精1%。而且，所述低聚糖混合物的構成及其在菌粉中加入量分別為低聚葡萄糖0.2%、菊粉0.3%、低聚果糖0.2%。而且，所述益生菌製劑成品包含的MA2的活菌數不少於l.OX101GcfWg。而且，所述Kefir源植物乳桿菌MA2已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保存編號為CGMCC3005。本發明的優點和積極效果是本發明所製備的益生菌製劑在降血脂的同時還具有調節腸道菌群的生理功能，可以治療和預防高血脂症狀和調節腸道菌群，且無毒，安全，保存期長，可製成膠囊、微膠囊、衝劑、片劑等。圖l為本發明植物乳桿菌MA2在MRS(參)及MRS-CHO培養基中的生長曲線(圏)，及膽固醇的降解率(A)。圖2飼餵高脂飼料的大鼠糞便中菌群的測定結果。其中A組，高膽固醇詞料(A);B組，高膽固醇飼料+植物乳桿菌MA2(,);a.大腸桿菌b.乳酸菌c.雙歧桿菌。試驗結果表示為平均值(SD)(n=10)具體實施例方式下面結合實施例，對本發明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護範圍。—、Kefir源植物乳桿菌k"o6a"7/w//a"torawMA2的篩選及生理功能測定1、Kefir源植物乳桿菌Za"o6fld〃w;/a"tonwMA2的篩選(1)kefir粒中益生乳酸菌的篩選將西藏kefir粒，加一定量的生理鹽水於滅菌研缽中研磨破碎，用無菌生理鹽水作適當稀釋後，取10(HtL分別塗布在MRS固體培養基，30'C厭氧培養48h，觀察並記錄菌落特徵並挑取不同形態單個菌落，再分別劃線接種於MRS上，重複幾次純化乳酸菌，得到乳酸菌純菌株，然後進行革蘭氏染色和過氧化氫試驗，對具有革蘭氏染色陽性和過氧化氫試驗陰性的菌株進行斜面保藏。(2)降膽固醇益生乳酸菌的初篩將kefir粒中篩選出的各乳酸菌菌株，按4°/。接種量分別接種於含的膽固醇的MRS液體培養基(MRS-CHO)中，在37"下厭氧培養24h後，利用臨苯二甲醛的方法測上清液中的膽固醇含量，計算膽固醇降解率。以不接菌的含膽固醇的MRS液體培養基作為對照。選取膽固醇降解率高的乳酸菌作為進一步的復篩菌株。膽固醇的降解率(％)-接菌的MRS培養基中上清液中膽固醇含量/未接菌的MRS培養基中上清液中膽固醇含量(對照組)xioo%(3)降膽固醇益生乳酸菌的復篩對上述篩選出來的膽固醇降解率高的菌株，進行牛乳發酵試驗，觀察其凝乳時間，凝乳質地，凝乳時的pH，並對其凝乳風味作出感官評價；另外，測試其對酸和和膽鹽的耐受能力，選取凝乳特性，耐酸特性及耐膽鹽特性良好的乳酸菌MA2，經生理生化和16SrDNA測序確定其為植物乳桿菌。本發明所使用的Z"c/otoc///^/7to"tor,MA2具有良好的體外降膽固醇功能，檢測結果如附圖1。本菌種已在北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保存編號為CGMCC3005。2、Kefir源植物乳桿菌丄a"o&ad/top/朋towMA2耐酸和耐膽鹽特性的檢測菌株的酸和膽鹽耐受性是益生菌篩選的一個重要指標準。具有對宿主有生理功能的益生菌很多，實際被應用的卻很少，因為所攝入的益生菌必須能夠耐受胃酸、膽汁，以存活的狀態到達腸道，定殖，進而成功地發揮生理功能。實驗結果證明，Kefir源植物乳桿菌￡a"o&ac//topto7tomwMA2，具有很強的酸耐受性和膽鹽耐受性，在pH2.0的環境中，2h後活菌數僅下降了2個數量級；另外，菌株MA2在牛膽鹽中的生長延滯時間較短，顯示出很強的膽鹽耐受性。3、Kefir源植物乳桿菌ia"o6flcz7/^//a"tomMA2的降膽固醇和調節腸道菌群活性的大鼠試驗。本實驗利用高膽固醇大鼠模型，考察了從Kefir粒中篩選出來的，具有體外降膽固醇效果的益生乳酸菌…植物乳桿菌i:"cto6ac說^p/anfanimMA2的體內降低血清膽固醇及調節腸道菌群的功效；測定了40天後，Z""o6a"7/^//朋torawMA2對大鼠大鼠體重，攝食量和飼料利用率，及臟器質量的影響；而且測定了其對血清總膽固醇(TC)，高密度膽固醇(HDL"C)，低密度膽固醇(LDL—C)，甘油三酯(TG);肝臟總膽固醇，甘油三酯；糞便總膽固醇，甘油三酯的影響；另外還研究了MA2菌株對大鼠腸道菌群及糞便中有機酸含量的影響，考察了其潛在的降血脂和調節腸道菌群的益生特性。實驗結果如表l，2,3，4，表lMA2對飼餵高脂飼料大鼠的體重，攝食量和飼料利用率的影響A組B組0天體重(g)140.25(4.50)140.54(4.30)40天體重(g)217.66(13.92)221.31(20.32)體重增量(g/40d))77.41(8.43)80.77(6.47)攝食量(g/40d)713.12(23,732.45(14.50)飼料利用率(％)10.860単50)11.03%(0.45)注A組，高膽固醇飼料；B組，高膽固醇詞料+植物乳桿菌MA2;試驗結果表示為平均值(SD)(n=10)_表2MA2對飼餵高脂飼料大鼠的臟器質量的影響腦重(g)心重(g)肝重(g)脾重(g)腎重(g)A組1.77(0.02)0.62(0.02)7.26(0.02)0.34(0.03)1.31(0.01)B組1.72(0.02)0.59(0.02)6.95(0.03)0.3(0.02)1.3(0.02)注A組，高膽固醇飼料；B組，高膽固醇飼料+植物乳桿菌MA2;試驗結果表示為平均值(SD)(n=10)由表l，表2可以看出，A,B兩組的體重增量，飼料利用率，臟器質量並未出現顯著差異(PX).05)，這表明在飼餵期間，植物乳桿菌MA2對大鼠並沒有明顯的毒副作用，植物乳桿菌MA2處理組與對照組大鼠呈現出相同的生長趨勢。Bernardeauetal.(2002)andLiongandShah(2006)等人，考察了嗜酸乳桿菌，千酪乳桿菌ASCC292，低聚果糖和麥芽糊精對飼餵了高膽固醇飼料的Wistar大鼠的降膽固醇作用，最終得到了與本試驗相似的結果，發現其對體重增量，攝食量都沒有顯著的影響。_表3MA2對飼餵高脂飼料大鼠的血清TC，HDL~C，LDL-~C,TG的影響_TC(mg/dl)HDL~C(mg/dl)LDL-^C(mg/dl)TG(mg/dl)A4卯,34(26.25)62.16(9.11)300.88(31.91)124.38(15.93)B388.54(8.9)**58.27(4.28)240.56(14.45)**93.11(15.01)*注A組，高膽固醇飼料B組，高膽固醇飼料+植物乳桿菌MA2;試驗結果表示為平均值(SD)(n==10),p<0.05*,p<0.01**。植物乳桿菌MA2對飼餵了高膽固醇飼料的大鼠血清的影響見表3。由表3可知，相比較於A組，B組的TC濃度顯著降低(P0.05)，飼餵40天後，降低了20.76%。另夕卜，B組的LDL-C濃度也顯著降低((P0.05)，降低了20.05%。相比於A組，B組大鼠的TG濃度也顯著降低，在試驗結束時，降低了25.14%。總之，植物乳桿菌MA2降低了伺餵高膽固醇飼料大鼠的血清總膽固醇(TC)，低密度膽固醇(LDL-C)，甘油三酯(TG)的含量，但是，對HDL-C的濃度的影響不顯著。表4MA2對飼餵高脂飼料大鼠的糞便TC和TG的影響tableseeoriginaldocumentpage6注A組，高膽固醇飼料；B組，高膽固醇飼料+植物乳桿菌MA2;試驗結果表示為平均值(SD)(n=10),p<0.05*.MA2對大鼠肝臟和糞便中TC，TG的影響見表4，A，B兩組的肝臟重量沒有顯著不同(P0.05)。相比於A組，B組肝臟中的膽固醇含量和TG含量顯著降低(p0.05)，進一步證明大鼠血清中的膽固醇含量確實降低，並不是膽固醇在血液和肝臟中的重分配。另外，B組大鼠的排便量顯著高於A組(P0.05)，證明植物乳桿菌MA2具有促進排便的益生功能。B組大鼠糞便中TC的含量顯著高於A組(P0.05)，TG的含量也高於A組，但是並不顯著(PX).05)。表5MA2對飼餵高脂飼料大鼠的糞便有機酸的影響tableseeoriginaldocumentpage6注A組，高膽固醇飼料；B組，高膽固醇飼料+植物乳桿菌MA2;試驗結果表示為平均值(SD)(n=10)，p<0.05*'p<0.01**。表5描述了MA2對飼餵高脂飼料大鼠的糞便有機酸的影響。由表5可知，同A組相比，添加了植物乳桿菌MA2，即B組大鼠的丙酸含量顯著升高，大約是A組的3倍。有報導稱丙酸含量的升高，可以影響膽固醇代謝的主要酶類，導致膽固醇含量的降低，另外，乙酸是脂合成的底物，因此乙酸合成降低，可以引起脂肪合成的減少，而本實驗，A，B兩組的乙酸和丁酸的含量並沒有顯著差異。圖2描繪了植物乳桿菌MA2對高膽固醇大鼠的糞便菌群的影響。由結果可知，在整個飼養期間，兩組的大腸桿菌數量，基本上都沒有發生太大變化，維持在89logcfog'、而B組的乳酸菌從第20天開始顯著升高，最終升高到11.53logcfo，g'1,而A組的乳酸菌只有9.34logcfuf1;B組的雙歧桿菌也從第24天顯著升高，最終相比於A組，升高了一個數量級。許多研究表明益生乳酸菌可以在腸道中抑制病原菌的生長，促進優勢益生菌的生長，調節腸道菌群的平衡，促進機體的健康。本實驗中，植物乳桿菌MA2在體內促進了乳酸菌和雙歧桿菌的生長，證明其可以通過胃液和膽汁的的不利環境，成功地到達腸道，發揮了其生理作用。另外，實驗結果顯示，植物乳桿菌MA2在體內，對大腸桿菌並沒有顯示明顯的抑制作用，這與先前的體外抑菌試驗結果一致，推測原因可能是因為植物乳桿菌MA2不能產生細菌素類物質，而是通過營養競爭作用促進了腸道內有益菌的生長。4、結論該益生菌製劑在降血脂的同時還具有調節腸道菌群的生理功能。二、Kefir源植物乳桿菌丄actokcz7/w:y;/朋ton^MA2的益生菌製劑的製備製備方法的步驟是-(1)將甘油管保藏的菌株MA2活化，接種到MRSbroth培養基中，厭氧培養18h後，得到發酵液；離心收集菌體，加入凍幹保護劑，'真空冷凍乾燥得菌粉；本步驟中，保護劑的配方為(質量百分比)10%的脫脂奶95%，海藻糖1.5%，甘油0.5%，山梨醇2%，麥芽糊精1%;(2)再加入低聚糖混合物，其添加組分及各組分在菌粉中的質量百分比分別為0.2%的低聚葡萄糖、0.3%的菊粉、0.2%的低聚果糖，混合，復配，研磨，測活菌數不少於1.0X101Qcfo/g,裝膠囊或裝於鋁箔袋，製成膠囊420mg/粒或散劑500mg/袋。此外，本發明還可以進行Kefir源植物乳桿菌￡a"o6ac7'//wsp/朋tonw7MA2益生菌微膠囊的製備，其步驟是(1)將甘油管保藏的菌株MA2活化，接種到MRSbroth培養基中，厭氧培養18h後，得到發酵液；離心收集菌體，加入凍幹保護劑，真空冷凍乾燥得菌粉；本步驟中，保護劑的配方為(質量百分比)10%的脫脂奶95%，海藻糖1.5%，甘油0.5%，山梨醇2%，麥芽糊精1%;製備菌懸液，使菌體的濃度達到101Dcfu/mL;(2)然後對菌體進行三層包埋，即在上述製備的菌懸液中加入與菌懸液等體積的第一層包埋材料，包埋材料選用4%大豆分離蛋白溶液，常溫下，200r/min攪拌20min至均勻，再等體積加入第二層包埋材料，包埋材料選用4%的微孔澱粉溶液，200r/min攪拌20min至吸附，接著加入2倍溶液體積的第三層包埋材料，包埋材料選用2%的海藻酸鈉溶液，200r/min攪拌30min攪拌均勻，將得到的混合液滴入2%的CaCl2溶液中，固化30min成球；(3)進行真空冷凍乾燥，即將上述製得的微球用無菌水漂洗後放在一8(TC的冰箱中預凍3h，在冷阱溫度一5rC，真空度0.09毫巴，真空冷凍千燥24h,即製得Zfl"o6a"7/M//fl"mn/wMA2微膠囊；(4)再加入(質量比)0.2%的低聚葡萄糖，0.3%的菊粉，0,2%的低聚果糖，混合，復配，研磨，活菌數不少於1.0X10Wcfu/g。權利要求1、一種降血脂及調節腸道菌群的益生菌製劑的製備方法，其特徵在於製備方法的步驟如下(1)將Keffr源植物乳桿菌MA2進行高密度培養，得到發酵液，其菌體密度不小於108cfu/mL；(2)上述發酵液經離心收集獲得菌體，加入保護劑，凍幹成菌粉；(3)在凍幹的菌粉中加入低聚糖混合物，混合均勻即得益生菌製劑成品。2、根據權利要求1所述的一種降血脂及調節腸道菌群的益生菌製劑的製備方法，其特徵在於所述保護劑用量為菌體重量的3倍。3、根據權利要求1或2所述的一種降血脂及調節腸道菌群的益生菌製劑的製備方法，其特徵在於所述保護劑的構成及其質量百分比分別為10%的脫脂奶95%、海藻糖1.5%、甘油0.5%、山梨醇2%、麥芽糊精1%。4、根據權利要求1所述的一種降血脂及調節腸道菌群的益生菌製劑的製備方法，其特徵在於所述低聚糖混合物的構成及其在菌粉中加入量分別為低聚葡萄糖0.2%、菊粉0.3%、低聚果糖0.2%。5、根據權利要求1所述的一種降血脂及調節腸道菌群的益生菌製劑的製備方法，其特徵在於所述益生菌製劑成品包含的MA2的活菌數不少於1.0X101cfo/g。6、根據權利要求1所述的一種降血脂及調節腸道菌群的益生菌製劑的製備方法，其特徵在於所述Kefir源植物乳桿菌MA2已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保存編號為CGMCC3005。全文摘要本發明涉及一種降血脂及調節腸道菌群的益生菌製劑的製備方法，其步驟為(1)將Kefir源植物乳桿菌MA2進行高密度培養，得到發酵液，其菌體密度不小於108cfu/mL；(2)上述發酵液經離心收集獲得菌體，加入保護劑，凍幹成菌粉；(3)在凍幹的菌粉中加入低聚糖混合物，混合均勻即得益生菌製劑成品。本發明所製備的益生菌製劑在具有降血脂功能的同時還具有調節腸道菌群的生理功能，可以治療和預防高血脂症狀和調節腸道菌群，且無毒，安全，保存期長，可製成膠囊、微膠囊、衝劑、片劑等。文檔編號A61K35/66GK101559082SQ200910069088公開日2009年10月21日申請日期2009年6月1日優先權日2009年6月1日發明者王豔萍,女許申請人:天津科技大學