一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙的製作方法
2023-05-22 03:01:46
一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種黃病毒科瘟病毒屬的動物病毒鑑別檢測器具，特別是涉及一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙，由支撐板，樣品墊，金標墊，檢測膜和吸水墊構成，檢測膜上含有豬瘟病毒檢測線T1「│」，牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2「│」和質控線C「│」印跡。鑑別檢測時，在檢測膜顯現三條紅色條帶「│││」為豬瘟病毒感染或免疫並混合牛病毒性腹瀉病毒感染，在豬瘟病毒檢測線和質控線顯現兩條紅色條帶「│ │」為豬瘟病毒感染或免疫，在牛病毒性腹瀉病毒檢測線和質控線顯現兩條紅色條帶「││」為牛病毒性腹瀉病毒感染，只顯現一條紅色條帶「│」為豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒陰性。本鑑別檢測試紙特異性強，敏感性高，反應譜廣，且操作簡便、快速，可廣泛用於豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的鑑別檢測，易於在生產實踐中推廣應用。
【專利說明】一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種黃病毒科瘟病毒屬的動物病毒鑑別檢測器具，特別是涉及一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙。
【背景技術】
[0002]豬痕病毒(ClasscalSwine Fever Virus, CSFV)和牛病毒性腹?寫病毒(BovineViral Diarrhea Virus, BVDV)同屬於黃病毒科(Flaviridae)痕病毒屬的成員，它們所引起的傳染病給養豬、養牛業造成了巨大的經濟損失。
[0003]豬痕((Classical swine fever, CSF))是由豬痕病毒引起的一種以高熱、出血和高死亡率為特徵的高度接觸性傳染病，世界動物衛生組織(OIE)將其列入OIE疫病名錄，為須申報的動物傳染病，我國列為一類動物疫病。豬瘟只感染豬和野豬，豬瘟病毒可以在其它動物體內增值，但不引起發病。CSFV基因組為線狀單股正鏈RNA，長約1.23X 104nt，含有一個大的開放閱讀框架(0RF)，編碼4種結構蛋白(C、Ems、El和E2)以及8種非結構蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B)。CSFV 只有一個血清型，可分為 3 個基因群和10個基因亞群，雖然不同毒株間存在顯著的抗原差異，但目前還沒有找出毒力強弱的抗原標誌。豬痕兔化弱毒疫苗(hog cholera lapinized vaccine, HCLV)是我國上世紀五十年代研製的世界公認的優良疫苗，安全性好、免疫原性好、遺傳性狀穩定，可同時誘導體液免疫和細胞免疫，能對不同基因亞群產生免疫保護，預防和控制了 CSF的大規模流行，至今地位和價值無可動搖。但是，近年來CSF的流行和發病特點又發生了新變化，多表現為非典型、慢性和隱性感染，出現了所謂「非典型豬瘟」、「溫和型豬瘟」和「帶毒母豬症候群」，仍是危害養豬業的主要傳染病之一。引起非典型豬瘟主要原因，是豬群免疫活疫苗後，豬群個體間抗體水平參差不齊，豬群中有的豬瘟抗體水平遠高於發病保護臨界點，有的僅稍高於或低於發病保護臨界點，使豬瘟野毒株與只有部分免疫力豬體組織互相作用，達到一種動態平衡作用，兩者相互作用在體內長期存在，對豬瘟免疫系統產生持續性損害，造成非典型豬瘟。因此，加強免疫監測手段，並在免疫監測下進行有效的疫苗接種是防制豬瘟的重要措施。
[0004]牛病毒性腹瀉病毒主要引起牛的病毒性腹瀉，表現為腹瀉、急慢性黏膜病、免疫耐受和持續性感染、免疫抑制、繁殖障礙、血小板減少和出血症等，它不僅感染牛，而且能夠感染豬、綿羊、山羊、鹿、駱駝及其他野生動物。本病呈世界性分布，嚴重危害牛、羊、豬、鹿等養殖業的發展。BVDV基因組為單股正鏈RNA，全長約1.23~1.25X 104nt，包括5』非翻譯區(untranslatedreg1n, 5』UTR)—個大開放閱讀框，編碼4種結構蛋白(C、E?s、El和E2)以及8種非結構蛋白(Npr。、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B),以及一個3，非翻譯區(3』UTR)。根據5』UTR序列的差異，BVDV可分為BVDV-1型和BVDV-2型，BVDV-1型和BVDV-2型引起的臨床症狀和發病特點有明顯不同。BVDV-1型普遍用於疫苗生產、診斷和研究，包括許多經典株和常見的疫苗株，所引起的症狀常常為一過性發熱、下痢和急慢性黏膜病；而BVDV-2型大多是弱毒或無毒，是產生持續性感染的重要原因。目前國外主要採取疫苗接種和淘汰持續感染牛為主的綜合防治措施。我國由於試製的疫苗效果不理想，且對該病的重視程度不夠等多方面的因素，尚無有效的BVDV疫苗使用，使得該病在我國呈逐漸擴大的趨勢。
[0005]CSFV和BVDV在核苷酸序列上約66%具有同源性，胺基酸約85%同源性，二者在病毒粒子結構、基因組結構和抗原特性方面均很接近，在免疫學上存在廣泛的交叉性。Fernelius等(1973)首次從自然感染髮病的豬體內分離到BVDV，從而在病原學上證明BVDV可以自然感染豬。近年來的流行病學調查結果表明我國豬群中BVDV感染已經比較嚴重，送檢的樣品中部分批次樣品陽性率高達80.72%。造成這種情況的原因是由於豬通過與BVDV牛群的直接接觸或通過汙染BVDV的豬瘟疫苗而感染了 BVDV，感染BVDV後產生類似慢性豬瘟的臨床症狀和病理變化，並可產生豬瘟病毒的交叉中和抗體，單憑臨床症狀病理變化及常規的血清學方法是難以鑑別的，給豬病的診斷和防治帶來新的難題。
[0006]針對當前國內畜群中豬瘟及牛病毒性腹瀉流行狀況，迫切需要建立快速、簡單、特異的病原檢測及抗體水平檢測方法。目前用於CSF、BVDV抗原檢測的方法很多，主要為病毒分離、中和試驗和免疫組化試驗等，這些方法操作繁瑣、費時，均不便於大批量樣品檢測。酶聯免疫吸試驗(ELISA)、RT-PCR方法雖然敏感、準確、快速，但對儀器設備及操作人員技術要求高，不適於基層實驗室操作。免疫層析試紙是在單克隆抗體技術、膠體金免疫層析技術和新材料技術基礎上發展起來的一種新型體外檢測技術，是理想的即時檢測(point-of-care test, P0CT)和現場檢測技術,其具有更加靈敏、特異、簡便、快速等優點，尤其是可實現「傻瓜式」操作，即不需要任何附加儀器設備即可進行現場檢測，並在1-5分鐘內判定結果，廣泛應用於各種分析物的定性和半定量快速檢測，包括抗原、半抗原、抗體和核酸，已成為當今最快速敏感的免疫學檢測技術之一。河南省動物免疫學重點實驗室從1995年開始系統開展免疫試紙快速檢測技術研究，率先在國際上研製成功動物疫病病原和抗體檢測膠體試紙產品一雞傳染性法氏囊病快速診斷試紙和豬旋毛蟲抗體檢測紙，建立了動物疫病快速檢測試紙研發技術平臺，截至目前已成功開發出動物疫病抗原、抗體以及藥物殘留檢測等系列快速檢測試紙產品，大大推動了該技術的應用和發展。本發明針對豬瘟病毒和牛流行性腹瀉病毒鑑別診斷的關鍵技術問題，篩選鑑定可區分CSFV和BVDV的高親和力配對單克隆抗體，建立基於免疫層析試紙的蛋白晶片技術平臺，研製豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙，建立適用於養殖基層和臨床檢測的快捷、簡便的豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒聯檢技術，實現對畜群疫病感染的實時監測，為我國豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒防控與淨化提供技術支撐，對豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒疫情監測和防控具有重要意義。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是:研製適用於豬群或牛群中豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病感染的鑑別診斷檢測試紙，本試紙特異、敏感、快捷、簡便，易在生產實踐中推廣應用。
[0008]本發明的技術方案是:一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙，由支撐板，樣品墊，金標墊，檢測膜和吸水墊構成，金標墊為吸附膠體金標記的同時識別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒單克隆抗體玻璃纖維，檢測膜為豬瘟病毒檢測線Tl、牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2和質控線C的硝酸纖維素膜，由樣品端至手柄端的排列為豬瘟病毒檢測線Tl/牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2/質控線C I I I 」，豬瘟病毒檢測線Tl為特異識別豬瘟病毒但不與牛病毒性腹瀉病毒交叉反應的單克隆抗體mAb2印跡「 I 」，牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2為特異識別牛病毒性腹瀉病毒但不與豬瘟病毒交叉反應的單克隆抗體mAb3印跡「 I 」，質控線C為抗小鼠IgG抗體pAbl或金黃色葡萄球菌SPA印跡「 I 」。鑑別檢測時，豬瘟病毒感染或免疫並混合牛病毒性腹瀉病毒感染時在檢測膜顯現豬瘟病毒檢測線Tl，牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2和質控線C三條紅色條帶「 I I I 」，豬瘟病毒感染或免疫在檢測膜顯現豬瘟病毒檢測線Tl和質控線C兩條紅色條帶「 I I 」，牛病毒性腹瀉病毒感染在檢測膜顯現牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2和質控線C兩條紅色條帶「 I I 」，無豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒則只顯現質控線c 一條紅色條帶「丨」。
[0009]分別以豬瘟病毒石門系標準強毒株、牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株為免疫抗原，通過雜交瘤細胞技術生產鑑定抗豬瘟病毒、抗牛病毒性腹瀉病毒單克隆抗體，利用免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)篩選同時識別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體以及能區分豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體。用於膠體金標記的識別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體mAbl能同時識別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒，豬瘟病毒檢測線Tl的單克隆抗體mAb2能特異性識別豬瘟病毒但不與牛病毒性腹瀉病毒交叉反應，用於牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2的單克隆抗體mAb2能特異識別牛病毒性腹瀉病毒但不與豬瘟病毒交叉反應；以IPMA篩選與豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒反應譜廣的單克隆抗體，膠體金標記單克隆抗體mAbl可識別豬瘟病毒石門系強毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株和多數豬瘟病毒流行毒株以及牛病毒性腹瀉病毒I型BA株和多數牛病毒性腹瀉病毒流行毒株。豬瘟病毒檢測線Tl單克隆抗體mAb2可識別豬瘟病毒石門系強毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株及多數豬瘟病毒流行毒株，牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2單克隆抗體mAb3可識別牛病毒性腹瀉病毒I型BA株及多數牛病毒性腹瀉病毒流行毒株。以小鼠IgG為免疫抗原製備羊抗小鼠IgG多克隆抗體pAbl, PAbI和金黃色葡萄球菌SPA均可用於質控線C印跡。
[0010]本發明有益的積極效果，豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙實現了豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的同步聯檢，可有效鑑別臨床上表現為非典型豬瘟或溫和型豬瘟症狀豬是否由BVDV感染所致，還可檢測CSFV兔化弱毒(細胞源)疫苗是否汙染BVDV以及牛群中BVDV的感染。本方法操作簡單，能較好滿足不同層次人員的需要，如疫病監測、海關檢疫、衛生防疫、集約化養殖到個體養殖等，易於大範圍推廣應用，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。檢測試紙條具有下列各項優點:
(I)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒聯檢。豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙在檢測膜上含有特異識別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒檢測線，可同步進行豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒聯檢，實現豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的鑑別檢測。
[0011](2)特異性強，敏感性高。豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙以同時識別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體及可區分豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的高親和力配對單克隆抗體為基礎製備而成，單克隆抗體的特異性強和敏感性高，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的範德華力相結合，膠體金對標記抗體的反應性影響很小，且具有較高的標記率。因此，鑑別檢測試紙具有較高的特異性和敏感性。
[0012](2)操作簡便快速。使用鑑別檢測試紙時無需任何其它試劑，只要將其插入待檢樣品10秒左右，在2分鐘內即可判定檢測結果。
[0013](3)顯示檢測結果形象、直觀準確。鑑別檢測試紙以顯示紅棕色「 I 」、「 I I 」、「I I」和「I I I 」印跡作為檢測的陰性、豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒以及豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒陽性標記，即在檢測膜上顯示一條棕紅色條帶「 I 」為豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒陰性，表示被檢測樣品為無豬瘟病毒感染或免疫及牛病毒性腹瀉病毒感染；兩條棕紅色條帶「 I I 」為豬瘟病毒陽性，表示被檢樣品為豬瘟病毒感染或免疫，無牛病毒性腹瀉病毒感染；兩條棕紅色條帶「 I I 」為牛病毒性腹瀉病毒陽性，表示被檢樣品為牛病毒性腹瀉病毒感染，無豬瘟病毒感染或免疫；三條棕紅色條帶「 I I I 」為豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒陽性，表示被檢樣品為豬瘟病毒感染或免疫混合牛病毒性腹瀉病毒感染，結果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現假陰性和假陽性誤判。
[0014](4)成本低，投資少。使用鑑別檢測試紙，不需另配儀器設備及其它試劑，使現場檢測一步到位，成本低廉，投資少，見效快。
[0015]【專利附圖】
【附圖說明】下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
[0016]圖1是豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙側視結構示意圖。
[0017]圖2是豬瘟病和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙俯視結構示意圖。
[0018]圖中，1.支撐板，2.樣品墊，3.金標墊，4.檢測膜，5.吸水墊，6.豬瘟病毒檢測線Tl印跡，7.牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2印跡，8.質控線C印跡，9-1.樣品端保護膜，9-2.手柄端保護膜，10.標記線。
[0019]【具體實施方式】豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙可廣泛應用於豬群中豬瘟病毒感染或免疫和牛病毒性腹瀉病毒感染的鑑別檢測、豬瘟疫苗是否汙染牛病毒性腹瀉病毒的鑑別檢測以及牛群中牛病毒性腹瀉病毒感染的檢測。製備豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙，首先需製備豬瘟病毒及牛病毒性腹瀉病毒免疫抗原，進而製備抗豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體、篩選同時識別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體以及能區分豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體。同時識別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體mAbl用於製備膠體金標記物，識別豬瘟病毒但不與牛病毒性腹瀉病毒交叉反應的單克隆抗體mAb2用於印製豬瘟病毒檢測線印跡「 I 」，識別牛病毒性腹瀉病毒但不與豬瘟病毒交叉反應的單克隆抗體mAb3用於印製牛病毒性腹瀉病毒檢測線印跡「 I 」，其次需製備羊抗小鼠IgG抗體pAbl或金黃色葡萄球菌SPA，用於印製質控線印跡「I」。
[0020](I)豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒免疫抗原的製備。
[0021](1.1)豬瘟病毒免疫抗原的製備
以豬瘟病毒標準強毒株石門株接種豬腎細胞(PK-15)，48-60小時收取病毒培養液，4°C 3000 r/min低速離心30 min去除雜質,利用50 kDa超濾膜對病毒培養液進行超濾濃縮，以Sepherose 4 Fast Flow瓊脂糖凝膠柱對豬瘟病毒進行凝膠過濾層析純化，測定豬瘟病毒的半數細胞培養物感染量(TCID5tl)達10_7以上，螢光定量PCR測定純化病毒拷貝數達1ltl以上。
[0022](1.2)牛病毒性腹瀉病毒免疫抗原的製備
以牛病毒性腹瀉病毒I型BA株接種牛腎細胞(MDBK)，48?96小時收取病毒培養液，4°C 3000 r/min低速離心30 min去除雜質,利用50 kDa超濾膜對病毒培養液進行超濾濃縮，以Sepherose 4 Fast Flow瓊脂糖凝膠柱對豬痕病毒進行凝膠過濾層析純化,測定牛病毒性腹瀉病毒的半數細胞培養物感染量(TCID5tl)達10_8以上，螢光定量PCR測定純化病毒拷貝數達101°以上。
[0023](2)抗豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒單克隆抗體的製備。
[0024](2.1)雜交瘤細胞株的建立
分別將豬瘟病毒及牛病毒性腹瀉病毒免疫抗原與弗氏免疫佐劑等量混合，充分乳化，以50mg-100mg/只分別免疫BALB/c系小鼠3次，每次間隔15-30天；第3次加強免疫後3-4天，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，於75%酒精浸泡5-10min，無菌取其脾細胞；剪碎並經100目尼龍網過濾，1000 r/min離心10 min，收集脾細胞；將I X 18的脾細胞與2-5 X 10 7的SP2/0骨髓瘤細胞混合，1000 r/min離心10 min，棄上清，在37°C的水浴中將0.7_1 ml的40%-50% PEG 4000 (pH8.5-9.0)緩緩加入細胞，溫育I min後，緩慢加入無血清1640培養基15 ml，以終止PEG的作用，37°C水浴5-10 min, 1000 r/min離心10 min，棄上清，將細胞重懸於HAT選擇培養基中，並加入96孔培養板(100 ml-200 ml/孔)，置37°C 5% CO2培養箱中培養。培養7-10天後，取雜交瘤細胞培養上清以免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)篩選陽性雜交瘤細胞。分別以豬瘟病毒石門系標準強毒株感染PK-15細胞、牛病毒性腹瀉病毒I型BA株感染MDBK細胞，經甲醇固定後，5%脫脂奶37°C封閉I h ;加待檢細胞培養上清50mL/孔，設HAT培養基和小鼠免疫血清為陰性和陽性對照；加I: 500辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗小鼠IgG抗體(50 mL/孔)，37°C作用30 min ;每步反應後均用含0.05% Tween-20的PBS充分洗滌；以底物AEC室溫顯色10-20 min，用水衝洗中止顯色後，在顯微鏡下觀察顯色結果。選取強陽性、細胞生長旺盛的克隆孔進行連續3次有限稀釋克隆化，擴大培養後凍存細胞，建立抗豬瘟病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株6株、抗牛病毒性腹瀉單克隆抗體雜交瘤細胞株8株。
[0025](2.2)單克隆抗體的製備:以體內誘生腹水製備單抗。取經降殖烷或液體石蠟致敏的經產Balb/c小鼠，腹腔注射對數生長期的雜交瘤細胞17個/只，7 d?10 d後抽取腹水，離心後取上清，分裝，凍存。
[0026](2.3)單克隆抗體的鑑定 (2.3.1)單克隆抗體的抗體效價
以免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)測定雜交瘤細胞培養上清和腹水的單抗效價，單抗上清和腹水的IPMA效價分別在1:16和1:1600以上。
[0027](2.3.2)單克隆抗體的特異性
用CSFV石門系強毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株以及CSFV流行毒株感染豬腎細胞(PK-15)，用牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株、BVDV流行毒株感染牛腎細胞(MDBK)，以免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)測定單抗與CSFV、BVDV流行毒株的反應性，篩選獲得同時識別CSFV石門系強毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株以及CSFV流行毒株、牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株、BVDV流行毒株的單克隆抗體2株，而特異性識別CSFV石門系強毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株以及CSFV流行毒株但不與牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株、BVDV流行毒株發生交叉反應的單克隆抗體2株，特異性識別牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株、BVDV流行毒株但不與CSFV石門系強毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株以及CSFV流行毒株發生交叉反應的單克隆抗體3株。以免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)測定上述7株單克隆抗體與CSFV、BVDV標準株和流行毒株的反應譜，證明用於膠體金標記的單克隆抗體可識別豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒標準株及豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒流行毒株，用於豬瘟病毒檢測線Tl可檢測CSFV石門系強毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株以及多數流行毒株，用於牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2可檢測牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株及多數牛病毒性腹瀉病毒流行毒株，均具有較廣的CSFV或BVDV反應譜。
(2.4)單克隆抗體的純化:以辛酸-硫酸銨法從小鼠腹水中純化單抗IgG。取I mL小鼠腹水，加入2 mL 0.06 mol/L乙酸鈉緩衝液(pH 5.0),以0.1 mol/L HCl調至pH 4.5 ;於室溫攪拌下，逐滴加入33 mL辛酸，4°C靜置2 h, 15000 r/min離心30 min,棄沉澱；在離心上清中加入 1/10體積0.01 mol/L PBS (ρΗ7.4)，#0.1 mol/L NaOH調至pH 7.4 ;於冰浴條件下加入飽和硫酸銨至終濃度45%，4°C靜置2 h，10000 r/min離心30 min，棄上清；以適量PBS重懸沉澱，對PBS透析過夜，換液3次。以分光光度計法或考馬斯亮藍染色法(Bradford法)測定純化單克隆抗體IgG的蛋白含量在lmg/ml以上，以免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)測定小鼠腹水和純化IgG的抗體效價在1:1000以上，分裝，凍存。
[0028](3)兔抗小鼠IgG多克隆抗體的製備
以純化小鼠IgG免疫2.0 kg左右健康紐西蘭兔，首次免疫以弗氏完全佐劑乳化抗原，皮下多點注射50mg/只，每次加強免疫間隔3 w,以弗氏不完全佐劑乳化抗原肌肉注射，最後一次加強免疫2 w後，以瓊脂擴散試驗(AGP)測定免疫血清抗體效價高於1:40時，採集高免兔全血，分離血清，以辛酸-硫酸銨法純化兔抗小鼠IgG，方法同(2.4)單抗純化，辛酸用量為45 mL/mL血清，測定抗體效價和蛋白濃度(10-20 mg/ml )，所製備兔抗小鼠IgG多克隆抗體PAbl可用於檢測試紙質控線C印跡的印製。
[0029](4)單克隆抗體的膠體金標記
(4.1)膠體金的製備:取100 mL超純水置於500 mL潔淨的錐形瓶，加入I mL I % (w/V)氯金酸煮沸；在攪拌狀態下迅速加入新鮮配製的I mL 1% (w/v)檸檬酸鈉溶液，煮沸約3min至溶液顏色由黃色變為紫紅色，繼續煮沸2 min;待溶液涼至室溫，補超純水至100 mL,以0.2 mol/L K2C03iI pH至9.0，4°C避光可保存數月。
[0030](4.2)最適標記蛋白濃度測定:取待標記mAbl IgG對20 mmol/L硼酸鈉溶液(pH8.0)4°C過夜透析。在微孔板中以25 mL超純水1:2、1:4、1:8……倍比稀釋待標記單抗；各孔加入125 mL膠體金溶液，RT靜置5 min ;加入125 mL I mol/L NaCl溶液；各孔顏色隨蛋白濃度的降低而由紅色變為藍色。以顏色未變藍的單抗最高稀釋度的蛋白濃度為膠體金最適標記濃度，膠體金標記時，蛋白濃度增加20%。
[0031](4.3)單克隆抗體的膠體金標記:取2 mL最適蛋白濃度的mAbl待標記IgG,加入10 mL膠體金溶液(pH 9.0)，迅速混勻，室溫作用10 min?15 min ;加入1/10體積含10%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的20 mmol/L硼酸鈉溶液,迅速混勻,RT作用10 min?15 min ；40C 15000 g離心30min，小心移去上清；以含1% (w/v)BSA的20 mmol/L硼酸鈉溶液重懸膠體金，同上離心，棄上清；重複洗漆I次，以I mL含1% (w/v) BSA的20mmol/L硼酸鈉溶液重懸膠體金，4°C保存備用。
[0032](5)檢測膜的製備
將硝酸纖維素檢測膜切成2.5X30 cm2的長條，置於XYZ 3000噴點儀平臺上，並以壓條固定；用PBS (pH 7.2)分別將特異識別豬瘟病毒毒株但不與牛病毒性腹瀉毒株反應的單抗mAb2 IgG、特異識別牛病毒性腹瀉病毒毒株而不識別豬瘟病毒毒株的單抗mAb3IgG稀釋至I mg/mL,並分別放於忙存池；利用B1jet Quanti 3000以I mL/cm分別將抗CSFV mAb2單抗、BVDVmAb3單抗和兔抗鼠IgG溶液噴點於檢測膜中央，形成豬瘟病毒檢測線Tl、牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2和質控線C印跡，檢測線與質控線相距0.5 cm ;置42°C乾燥箱30 min或室溫自然乾燥；將檢測膜置塑膠袋，加乾燥劑4°C密閉保存備用。
[0033](6)結合墊的製備
將玻璃棉切成1.5X30 cm2的長條，置於XYZ 3000噴點儀平臺上，並以壓條固定；取ImL 膠體金標記物加入 2 mL 含 2% (w/v) BSA>3% (w/v)鹿糖、0.6 mol/L NaCl、0.2% Tween20 (v/v)和 0.1% (w/v)疊氮鈉的 20 mmol/L 硼酸鈉溶液(pH 8.0);利用 Airjet Quanti3000以15 mL/cm將抗膠體金標記物溶液噴點於玻璃棉；置50°C乾燥箱30 min乾燥；將膠金墊置塑膠袋，加乾燥劑4°C密閉保存備用。
[0034](7)樣品墊的製備
將玻璃棉切成1.5X30 cm2的長條，以將含0.1 mol/L NaCl、0.2% Tween 20 (v/v)和0.1% (w/v)疊氮鈉的PBS (pH 7.2)溶液浸泡玻璃棉條；置50°C乾燥箱30 min乾燥；將樣品墊置塑膠袋，加乾燥劑RT密閉保存備用。
[0035](8)吸水墊的製備
將玻璃棉切成2.5X30 cm2的長條，將吸水墊置塑膠袋，加乾燥劑RT密閉保存備用。
[0036](9)支撐板的製備
將雙面膠貼於PVC支撐板，切成7.5X30 Cm2的長板，製備支撐板。
[0037](10)試紙的組裝
利用LM5000試紙裝配儀或手工將上述材料裝配成試紙板。先將檢測膜粘貼於支撐板中央，然後將膠金墊和樣品墊依次粘貼於檢測膜的樣品端，各層間重疊I mm?2 mm，再將吸水墊粘貼於檢測膜的另一端，與檢測膜重疊I mm?2 mm，在樣品端以白色塑膠膜包裹樣品墊和膠金墊，塑膠膜上印有檢測方向及檢測溶液上限標記，在手柄端以藍色塑膠膜包裹吸水墊。
[0038](11)切割與包裝
利用CM4000切割儀將裝配好的試紙板切成0.3 cm的試紙條，將試紙條分裝入塑膠袋，加乾燥劑4°C密閉保存。
[0039]( 12)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙的實施結構
參見圖1，圖2，圖中，I為支撐板用不吸水薄片條，實施中可採用塑膠薄片條或採用不吸水的硬質紙片材，反應試劑載體吸附層由2，3，4，5，組合而成，從樣品端2開始，到手柄端5依次粘貼在支撐層I上面；其中2為樣品端樣品墊，實施中可使用玻璃纖維棉簡稱玻璃棉，3為吸附膠體金標記同時識別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒單克隆抗體的金標玻璃纖維棉，可採用精製玻璃纖維棉，簡稱為金標墊，4為檢測膜，實施中可採用硝酸纖維素膜，5為手柄端吸水墊，採用吸水紙，如濾紙或其它吸水紙均可，試紙條總長8 cm，寬度0.4 cm, 6為用特異識別豬瘟病毒但不與牛病毒性腹瀉病毒發生交叉反應的單克隆抗體mAb2在硝酸纖維素膜上印製的豬瘟病毒檢測線印跡「 I 」，7為特異識別牛病毒性腹瀉病毒但不與豬瘟病毒發生交叉反應的單克隆抗體在硝酸纖維素膜上印製的牛病毒性腹瀉病毒檢測線印跡「 I 」，8為兔抗小鼠IgG多克隆抗體pAbl或金黃色葡萄球菌SPA在硝酸纖維素膜上印製的質控線印跡「 I 」，在檢測膜上的豬瘟病毒檢測線印跡、牛病毒性腹瀉病毒檢測線印跡和質控線印跡組合排列為「 III」。9為保護膜，覆蓋在玻璃棉及金標玻璃棉的保護膜為9-1，覆蓋在吸水層濾紙上的保護膜為9-2。在玻璃棉和金標玻璃棉交界處對應位置的白色保護膜上偏向玻璃棉一方0.5 cm處的保護膜上印有一條標記線10，在標記線10右邊印有箭頭和Max字樣，手柄端保護膜可用黃色或其它顏色，2，3，4，5各層彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。
[0040]( 13)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙實施檢測反應原理
當豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙樣品端插入待檢測樣品溶液後，待檢溶液通過虹吸帶動待檢CSFV、BVDV抗原及金標抗體mAbl —起向硝酸纖維素膜擴散，並最終滲透到濾紙層中，在擴散過程中金標抗體mAbl分別與待檢CSFV、BVDV抗原相結合，形成金標抗體-抗原複合物，CSFV、BVDV抗原的金標複合物可分別與檢測膜上的豬瘟病毒檢測印跡mAb2和牛病毒性腹瀉病毒檢測印跡mAb3結合，生成紅棕色「 I I 」標記及「 I I 」，部分未與抗原結合的金標抗體不能與檢測印跡結合而繼續擴散，在檢測膜上與質控印跡中的PAbl或PSA，生成紅棕色標記「 兩種標記組合疊加，形成三條紅棕色陽性標記「 I I |」，表示樣品中同時含有豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒；CSFV病毒的金標複合物不能與檢測膜上的BVDV檢測印跡mAb3結合，只能與CSFV檢測印跡mAb2結合，生成紅棕色「 I 」標記，部分未與抗原結合的金標抗體不能與檢測印跡結合而繼續擴散，在檢測膜上與質控印跡中的PAbl或PSA，生成紅棕色標記「 I 」，兩種標記組合疊加，形成兩條紅棕色陽性標記「 I I 」，表示樣品中只含有豬瘟病毒；BVDV的金標複合物不能與檢測膜上的CSFV檢測印跡mAb2結合，只能與BVDV檢測印跡mAb3結合，生成紅棕色「 I 」標記，部分未與抗原結合的金標抗體不能與檢測印跡結合而繼續擴散，在檢測膜上與質控印跡中的PAbl或PSA，生成紅棕色標記「 I 」，兩種標記組合疊加，形成兩條紅棕色陽性標記「 I I 」，表示樣品中只含有牛病毒性腹瀉病毒；當樣品中不含豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒時，沒有金標抗體-抗原複合物形成，不能與CSFV檢測印跡和BVDV檢測印跡結合，則生成陰性標記「 I 」。如果檢測膜上沒有紅棕色標記顯示，則表明試紙條已失效。
(14)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙檢測實例操作方法(14.1)檢測樣品溶液的製備:採集病(死)豬、牛的病變組織，包括肺、肝、脾、腎、氣管、小腸、大腸和淋巴結等，以1:5或1:10加適量PBS或水進行簡單研磨，製備待檢溶液。
[0041](14.2)試紙檢測:將豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙樣品端浸入待檢溶液10 S?20 S ;取出試紙水平放置5 min?10 min觀察結果。
[0042](14.3)檢測結果判定:試紙顯現三條紅棕色條帶(CSFV檢測線、BVDV檢測線和質控線)「I I I 」為CSFV、BVDV陽性，表示待檢樣品中同時含有CSFV、BVDV抗原；兩條紅棕色條帶(CSFV檢測線和質控線)「 I I 」為CSFV陽性，表示待檢樣品中僅含有CSFV抗原；兩條紅棕色條帶(BVDV檢測線和質控線)「 I I 」為BVDV陽性，表示待檢樣品中僅含有BVDV抗原；僅顯現一條紅棕色條帶(質控線)「 I 」為CSFV、BVDV陰性，表示待檢樣品未檢出CSFV、BVDV抗原；試紙未顯現任何條帶表明檢測操作不當或試紙失效，需以另取檢測試紙重新檢測。
[0043]實施例一，豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒快速診斷，採集病(死)豬、牛的病變組織，包括肺、肝、脾、腎、氣管、小腸、大腸和淋巴結等，以1:5或1:10加適量PBS或水進行簡單研磨，製備待檢溶液，以豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙按(14)操作方法進行檢測和結果判定，鑑別診斷病(死)豬、牛CSFV感染或CSFV免疫混合BVDV感染、CSFV感染或CSFV免疫、BVDV感染。試紙顯現三條紅棕色條帶(豬瘟病毒檢測線、牛病毒性腹瀉病毒檢測線和質控線)「I I I 」為CSFV、BVDV陽性，表示待檢豬、牛為CSFV感染或CSFV免疫混合BVDV感染；兩條紅棕色條帶(豬瘟病毒檢測線和質控線)「I I 」為CSFV陽性，表示待檢豬、牛為CFSV感染或免疫，無BVDV感染；兩條紅棕色條帶(牛病毒性腹瀉病毒檢測線和質控線)「I I 」為BVDV陽性，表示待檢豬、牛為BVDV感染，無CFSV感染或免疫；僅顯現一條紅棕色條帶(質控線)「 I 」為CSFV、BVDV陰性，表示待檢豬、牛無BVDV感染、CSFV感染或免疫；試紙未顯現任何條帶表明檢測操作不當或試紙失效，需以另取檢測試紙重新檢測。
[0044]實施例二，外表健康及發熱期病豬、牛檢驗檢疫，採集外表健康豬、牛拭子(咽拭和肛拭)、糞便或發熱期血樣，以1:5或1:10加適量PBS或水進行簡單混懸，以豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙按(14)操作方法進行檢測和結果判定，鑑別外表健康及發熱期病豬、牛的CSFV感染或CSFV免疫混合BVDV感染、CSFV感染或CSFV免疫、BVDV感染。試紙顯現三條紅棕色條帶(豬瘟病毒檢測線、牛病毒性腹瀉病毒檢測線和質控線)「 I I I」為CSFV、BVDV陽性，表示待檢豬、牛為CSFV感染或CSFV免疫混合BVDV感染；兩條紅棕色條帶(豬瘟病毒檢測線和質控線)「 I I 」為CSFV陽性，表示待檢豬、牛為CFSV感染或免疫，無BVDV感染；兩條紅棕色條帶(牛病毒性腹瀉病毒檢測線和質控線)「 I I 」為BVDV陽性，表示待檢豬、牛為BVDV感染、無CFSV感染或免疫；僅顯現一條紅棕色條帶(質控線)「 I 」為CSFV.BVDV陰性，表示待檢豬、牛無BVDV感染、無CFSV感染或免疫；試紙未顯現任何條帶表明檢測操作不當或試紙失效，需以另取檢測試紙重新檢測。
[0045]實施例三,豬痕病毒兔化弱毒疫苗(細胞源)的質量檢測，以1:5或1:10加適量PBS或水溶解豬瘟兔化弱毒疫苗(細胞源)，製備待檢疫苗溶液，以豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙按(14)操作方法進行檢測和結果判定，檢測豬瘟兔化弱毒疫苗(細胞源)的病毒含量和鑑別檢測疫苗的牛病毒性腹瀉病毒汙染情況。試紙顯現三條紅棕色條帶(豬瘟病毒檢測線、牛病毒性腹瀉病毒檢測線和質控線)「 I I I 」為CSFV、BVDV陽性，表示待檢疫苗為BVDV汙染；兩條紅棕色條帶(豬瘟病毒檢測線和質控線)「I I 」為CSFV陽性，表示待檢疫苗無BVDV汙染，豬瘟病毒檢測線的顯色強度與CSFV疫苗含量成正比；兩條紅棕色條帶(牛病毒性腹瀉病毒檢測線和質控線)「 I I 」為BVDV陽性，表示待檢疫苗有BVDV汙染，疫苗無CSFV ;僅顯現一條紅棕色條帶(質控線)「 I 」為CSFV、BVDV陰性，表示待檢疫苗無BVDV汙染，同時也不含疫苗毒；試紙未顯現任何條帶表明檢測操作不當或試紙失效，需以另取檢測試紙重新檢測。
【權利要求】
1.一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑑別檢測試紙，由支撐板，樣品墊，金標墊，檢測膜和吸水墊構成，其特徵是:金標墊吸附膠體金標記同時識別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體mAbl，檢測膜的豬瘟病毒檢測線Tl為特異識別豬瘟病毒但不與牛病毒性腹瀉病毒交叉反應的單克隆抗體mAb2印跡「 I 」，牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2為特異識別牛病毒性腹瀉病毒但不與豬瘟病毒交叉反應的單克隆抗體mAb3印跡「 I 」，質控線C為抗小鼠IgG抗體pAbl或金黃色葡萄球菌SPA印跡「丨」。
2.根據權利要求1所述的鑑別檢測試紙,其特徵是:豬瘟病毒感染或免疫並混合牛病毒性腹瀉病毒感染時在檢測膜顯現豬瘟病毒檢測線Tl，牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2和質控線c三條紅色條帶「 III」，豬瘟病毒感染或免疫時在檢測膜顯現豬瘟病毒檢測線Tl和質控線c兩條紅色條帶「 I I 」，牛病毒性腹瀉病毒感染時在檢測膜顯現牛病毒性腹瀉病毒檢測線T2和質控線C兩條紅色條帶「 I I 」，無豬瘟病毒或牛病毒性腹瀉病毒則只顯現質控線c 一條紅色條帶「丨」。
3.根據權利要求1所述的鑑別檢測試紙，其特徵是:單克隆抗體mAbl同時識別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒，單克隆抗體mAb2特異識別豬瘟病毒但不與牛病毒性腹瀉病毒發生交叉反應，單克隆抗體mAb3特異識別牛病毒性腹瀉病毒但不與豬瘟病毒發生交叉反應。
4.根據要求I或3所述的鑑別檢測試紙，其特徵是:鑑別檢測試紙的豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒反應譜廣，豬瘟病毒檢測線TI可檢測CSFV石門系強毒株(Shimen)、豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)以及多數豬瘟病毒流行毒株，牛病毒性腹瀉病毒T2可檢測牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株及多數牛病毒性腹瀉病毒流行毒株，可實現對豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的鑑別檢測。
【文檔編號】G01N33/577GK104459143SQ201410763134
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月12日 優先權日:2014年12月12日
【發明者】王麗, 柴書軍, 楊蘇珍, 孫亞寧, 楊繼飛, 史西保, 李青梅, 郅玉寶, 趙東, 梁躍, 郭軍慶, 楊豔豔, 鄧瑞廣, 張改平 申請人:河南省農業科學院